韋冠東，王洪光，馬 萍，湯德元＊，張?jiān)?，曾智勇，?霞，唐 宇，李 達(dá)

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽(yáng)550008）

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；?、集約化的不斷發(fā)展及治療豬病手段的不斷進(jìn)步，隨之而來(lái)的疾病的種類(lèi)也產(chǎn)生了變化，由以往的單一病原致病發(fā)展到多種病原混合感染和繼發(fā)感染。雖然藥物治療手段和效果越來(lái)越好，但隨之豬病的復(fù)雜程度及其危害也與日俱增。近年來(lái)，與豬呼吸道相關(guān)的疾病是我國(guó)豬群的常發(fā)病，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展，已經(jīng)受到廣泛重視。研究表明，PRV、PCV－2、CSFV、PRRSV、PPV 與SIV 等 病 毒是豬場(chǎng)發(fā)生的各類(lèi)病毒性呼吸道相關(guān)疾病中最為常見(jiàn)的病原［1］。斷奶前后的仔豬和早期育肥豬是豬呼吸道相關(guān)疫病的主要侵害對(duì)象，尤其是剛斷奶的仔豬，由于失去母源抗體保護(hù)，自身免疫系統(tǒng)未發(fā)育完全、沒(méi)有健全消化和呼吸系統(tǒng)功能，在斷奶、混群和飼料刺激等應(yīng)激下，豬群極易發(fā)病［2－3］。豬群發(fā)生呼吸道相關(guān)疫病的主要臨床癥狀有采食量下降、日漸消瘦；有明顯的呼吸道癥狀如咳嗽、喘氣、呼吸困難；眼部及鼻端分泌物增多、發(fā)熱等特征［4］。自1983年Mullis成功建立PCR 技術(shù)，隨著該方法應(yīng)用領(lǐng)域及方法的不斷進(jìn)步與發(fā)展，現(xiàn)成為動(dòng)物疫病診斷的重要方法之一，并廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域［5］。隨著PCR 技術(shù)的不斷發(fā)展，不同動(dòng)物疫病病原的多重PCR 方法建立也越來(lái)越普遍，王洪光［6］等建立了PRRSV 與SIV 二重RT－PCR 檢測(cè)方法，能同時(shí)檢測(cè)PRRSV 與SIV。劉志杰［7］等建立了六重PCR 檢測(cè)方法，可以同時(shí)檢測(cè)PCV－2、PRV、PPV、CSFV、PRRSV 和JEV 6 種豬繁殖障礙病毒性疫病。本試驗(yàn)擬建立能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)PRV、PCV－2、PPV、CSFV、PRRSV 與SIV6 種 病 原 的PCR 或RT－PCR 方法，以期對(duì)臨床病料進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞、質(zhì)粒及菌株 本研究中使用的PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV 和SIV 系 病 豬組織中獲得，由貴州省動(dòng)物疫病研究室分離并保存提 供；；pMD19－T Vector 和 大 腸 埃 希 菌 感 受 態(tài)Top10購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 TaKaRa MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit Ver.4.0RNA／DNA核酸提取試劑盒、DL Marker 2 000，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；EZNA TM Gel Extraction Kit（50）膠回收試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；普通質(zhì)粒小提試劑盒，Tiangen 公司產(chǎn)品；異丙醇、無(wú)水乙醇等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；Icycler Thermal cycler型PCR儀，Bio－Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 試驗(yàn)根據(jù)GenBank 登錄的PRV gB（AF257079）、PCV－2 ORF2（NC－005148）、PRRSV ORF6（NC－001961）、CSFV C（AY805221）、PPV NS1（NC－001718）、SIV M（GU086140）等基因序列，應(yīng)用DNAStar、Oligo、MPprimer設(shè)計(jì)PCR／RT－PCR 引物，用于擴(kuò)增目的基因片段［8］（表1）。

表1 擴(kuò)增目的片段的引物Table 1 Specific primers used to amplify target genes

1.2.2 病毒核酸提取 分別取病毒液200μL，參照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，嚴(yán)格按步驟提取病毒RNA／DNA，利用蛋白質(zhì)核酸儀測(cè)定其濃度，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR／RT－PCR 反 應(yīng)體系 PRV、PCV－2、PPV 反應(yīng)體系為50μL，10×Taq PCR buffer 5 μL、dNTP（10 mmol／L）1 μL，上、下 游 引 物 各1μL，模板各1μL，r Taq 聚合酶1μL，滅菌超純水補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃5min；95 ℃30 s，57℃30s，72 ℃30s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PRRSV、CSFV、SIV 反應(yīng)體系為25μL，2×1step buffer 12.5μL，上、下游引物各1μL，模板各1μL，Prime Script One Step Enzyme Mix 1μL，RNase free H2O 8.5μL。反應(yīng)程序：50℃40min，95 ℃5min，95 ℃30s，57℃30s，72 ℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。分別取5.0μL PCR／RT－PCR產(chǎn)物于10g／L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳測(cè)定。

1.2.4 PCR／RT－PCR 產(chǎn)物的鑒定 使用EZNA TM Gel Extraction Kit膠回收試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟回收上述6種病毒的PCR／RT－PCR 擴(kuò)增片段，將膠回收產(chǎn)物與pMD19－T 載體連接于16 ℃過(guò)夜，隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞（Top10），經(jīng)Amp、IPTG、X－gal篩選，挑取單個(gè)白色菌落純培養(yǎng)后將陽(yáng)性菌液送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.5 PCR／RT－PCR 方法反應(yīng)條件的優(yōu)化 對(duì)PCR／RT－PCR 反應(yīng)退火溫度（51℃～60 ℃）進(jìn)行優(yōu)化，以 確 定 最 佳Tm。PCR 反 應(yīng) 條 件：95 ℃5min；95 ℃30s，（51℃～60 ℃）30s，72 ℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。RT－PCR 反應(yīng)條件：50℃40min；95℃5min，94℃30s，（51℃～60℃）30 s，72 ℃30s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10min。取5.0 μL PCR／RT－PCR 產(chǎn)物于10g／L 瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳測(cè)定。

1.2.6 PCR／RT－PCR 特異性檢測(cè) 利用建立的PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RTPCR 方法分別對(duì)彼此進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)該方法是否具有特異性。

1.2.7 PCR／RT－PCR 敏感性檢測(cè) 用蛋白質(zhì)核酸儀測(cè)定提取的6 種病毒的核酸濃度，并用RNase free H2O 進(jìn)行101、102、103、104、105倍稀釋?zhuān)謩e取1μL 相應(yīng)倍比稀釋物進(jìn)行PCR／RT－PCR 反應(yīng)，進(jìn)行敏感性檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR／RT－PCR 產(chǎn)物的鑒定

將PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RT－PCR 產(chǎn) 物 連 接pMD19－T 載 體 后，轉(zhuǎn) 化TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增片段為6種病毒的特異性基因片段。

2.2 PCR／RT－PCR 擴(kuò)增結(jié)果

六種病毒PCR／RT－PCR 方法最佳退火溫度范圍均較廣，53℃～58℃檢測(cè)效果基本無(wú)差別，對(duì)PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV 的 核 酸 模板進(jìn)行PCR／RT－PCR 反應(yīng)，分別擴(kuò)增出了192、255、364、530、759、981bp的特異性片段，各擴(kuò)增片段的克隆測(cè)序結(jié)果表明，所擴(kuò)增片段與預(yù)期結(jié)果大小一致，系目的基因序列（圖1）。

2.3 特異性檢測(cè)

利 用 建 立 的PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RT－PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性，表明建立的方法特異性較好（圖2）。

2.4 PCR／RT－PCR敏感性檢測(cè)

對(duì)病毒核酸進(jìn)行101～105倍稀釋?zhuān)媒⒌腜RV、PCV－2、CSFV、PRRSV、PPV、SIV PCR／RTPCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，觀察其敏感性。發(fā)現(xiàn)該6種病毒核酸的檢測(cè)最低濃度依次為2.5×10－3、2.2×10－4、3.2×10－3、8.3×10－3、3.7×10－3、3.7×10－3ng（圖3）。

圖1 PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RT－PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection results of PRV，PCV－2，PRRSV，CSFV，PPV，SIV by PCR／RT－PCR

圖2 PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RT－PCR特異性試驗(yàn)Fig.2 Specificity test of PCR or RT－PCR for detecting PRV，PCV－2，PRRSV，CSFV，PPV，SIV

圖3 PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RT－PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity test of PCR／RT－PCR for detecting PRV，PCV－2，PRRSV，CSFV，PPV，SIV

3 討論

建立PCR 檢測(cè)方法時(shí)，引物的設(shè)計(jì)是首要條件，試驗(yàn)表明建立PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV PCR／RT－PCR 的 最 佳 退 火 溫 度 范 圍 較廣，53℃～58℃檢測(cè)效果均較好。在敏感性試驗(yàn)中，6種病毒的核酸檢測(cè)最低濃度依次為2.5×10－3、2.2×10－4、3.2×10－3、8.3×10－3、3.7×10－3、3.7×10－3ng。近幾年來(lái)，豬病毒性疾病發(fā)生對(duì)我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，我國(guó)規(guī)模化豬場(chǎng)絕大多數(shù)都受到豬病毒性呼吸道疾病的威脅。PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV 是 呼 吸 道病毒性疫病的重要病原，該類(lèi)病原侵入呼吸道后，會(huì)造成呼吸道的防御屏障的破壞及呼吸道抗病毒能力的下降，繼而引起混合感染和繼發(fā)感染，由于導(dǎo)致呼吸道抵抗力的下降，使呼吸道類(lèi)的疾病發(fā)病率變高，導(dǎo)致多種疫病同時(shí)發(fā)生，使疫病復(fù)雜化，病癥加重；同時(shí)PRRSV、PCV－2、CSFV、PPV、PRV 能夠損傷機(jī)體的免疫系統(tǒng)，降低豬群對(duì)外界環(huán)境的抵抗力，使得豬群發(fā)生疾病時(shí)多種病原混合感染和繼發(fā)感染的情況越來(lái)越普遍，由于這些病毒給機(jī)體造成相似臨床癥狀，導(dǎo)致疾病的診斷十分困難，難以及時(shí)給與相應(yīng)防治［9］。因此快速、準(zhǔn)確地診斷發(fā)病原因，從而及時(shí)有效的針對(duì)發(fā)病豬群采取相應(yīng)的藥物治療或免疫預(yù)防措施，降低疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本 試 驗(yàn) 針 對(duì)PRV、PCV－2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV 等6種常見(jiàn)病毒的相關(guān)保守基因分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以擴(kuò)增PRV gB、PCV－2ORF2、PRRSV ORF6、CSFV C、PPV NS1、SIV M 部分基因片段，應(yīng)用Primer Premier 5.0、Oligo 7.4、MFE primer和MP primer軟件進(jìn)行綜合分析，充分考慮PRVG＋C 含量較高，PPVG＋C 含量較低的問(wèn)題，Tm 值應(yīng)該控制在50℃～60℃，確保某一溫度都能進(jìn)行很好的PCR 反應(yīng)，盡量避免引物間的非特異性擴(kuò)增，為以后多重PCR 反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。建立的6種呼吸道相關(guān)病毒性疫病的PCR／RT－PCR 檢測(cè)方法，較理想的實(shí)現(xiàn)了上述6種病毒臨床病料的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，該方法的建立為檢測(cè)以上6種病毒提供了有參考價(jià)值的方法。

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