范寧娟，白育斌，師 偉，段 敏＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西楊凌712100）

在甾體分子結(jié)構(gòu)的D－環(huán)引入含N、O、S等雜原子的雜環(huán)后將使得甾體衍生物呈現(xiàn)廣泛的生物活性［1］。在雜環(huán)衍生物中，吡唑啉基甾體化合物因?yàn)榫哂兄雇础⒖咕?、抗癌等功效為人們所熟悉，合成含有吡唑啉基的此類衍生物已?jīng)成為甾體結(jié)構(gòu)改造和修飾的重 要 分 支［2－5］。2013 年，我 們 合 成 了 一 系 列新穎的吡唑啉基甾體衍生物，體外細(xì)胞毒活性試驗(yàn)顯示部分化合物對肺癌（NCI－H460）、宮頸癌（Hela）和肝癌（HepG2）3種人體癌細(xì)胞具有較好的抑制活性，其中化合物1對Hela細(xì)胞的半數(shù)抑制率為12.5 μg／mL，細(xì)胞周期分析試驗(yàn)證明吡唑啉基甾體衍生物1（圖1）具有誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的特性［6］。據(jù)此推測吡唑啉基甾體衍生物1抑制Hela細(xì)胞增殖的活性可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯有關(guān)。

圖1 吡唑啉基甾體衍生物1結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of derivative 1of steroidal derivatives

為了進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能，本研究將檢測C17－吡唑琳基甾體衍生物1對Hela細(xì)胞的凋亡的作用及機(jī)制，為進(jìn)一步明確其抗腫瘤活性研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Hela細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫細(xì)胞株信息庫。RPMI－1640培養(yǎng)液、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購 自Gibico 公 司；Caspase－3、Caspase－8、Caspase－9活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù) 有 限 公 司；Bax、PARP、Bcl－2、β－actin 抗 體 購 于Santa Cruz。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗和ECL 顯 色 試 劑 盒 購 自Pierce 公 司；Annexin－VFITC／PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品合成 C17－吡唑琳基甾體衍生物1參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行合成，將合成的樣品溶于二甲基亞砜（DMSO）中，最終配制成2μg／μL 的儲存液（含0.5 mL／L DMSO）備用，DMSO終濃度不超過10mL／L。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 Hela細(xì)胞用100 mL／L胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)。用2.5mL／L 的胰蛋白酶（含0.4mL／L的EDTA）消化傳代。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 將Hela細(xì)胞接種至12孔板，待貼壁后，用12.5μg／mL的C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理12、24、36、48h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入200μL的PBS和2μL的AO／EB染色液（各含100 μg／mL），室溫避光孵育10min，用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。用DMSO 處理的細(xì)胞作為陰性對照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測吡唑啉基甾體衍生物1對Hela細(xì)胞凋亡率的影響 將Hela細(xì)胞接種于6孔板中，用，同時設(shè)置不用藥物處理的正常細(xì)胞為對照，于藥物處理后不同的時間點(diǎn)（0、12、24、36、48h）收集細(xì)胞，1 000r／min 離心5 min，棄掉上清，用PBS洗滌2次，收集細(xì)胞。先加入195μL Annexin V－FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，然后加入5μL Annexin V－FITC 和10μL 碘化丙啶染色液，輕輕混勻，最后于室溫（20℃～25℃）避光孵育10min～20 min。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2 次～3 次以改善標(biāo)記效果。隨即用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 用分光光度法檢測Caspase－3、－8和－9的活性 用12.5μg／mL 的藥物處理Hela細(xì)胞，分別于不同時間點(diǎn)（0、12、24、36、48h）收集細(xì)胞。按照試劑盒說明書在收集的沉淀細(xì)胞中加入200μL 的Lysis buffer，吹打均勻，置冰上裂解1h，其間渦旋振蕩3次，10 000r／min 離心1min，吸取上清至新的1.5mL EP管中。用BCA 法檢測所提取的蛋白質(zhì)濃度。分別吸取50μL 含總蛋白量為150μg的細(xì)胞裂解上清液，然后加入50μL 的2×Reaction buffer和5μL 的Caspase substrate，37 ℃避光孵育4h。以Lysis buffer 和Reaction buffer作為空白對照。在400nm 波長處測定吸光度值。

1.2.6 Western blot檢測凋亡相關(guān)因子的變化

①細(xì)胞總蛋白的提取。收集細(xì)胞，PBS洗2次，加入400μL的預(yù)冷的含有1mmol／L PMSF的RIPA 裂解液，冰上裂解1h，期間渦旋混勻4 次，12 000r／min離心20min，取上清，加入4×loading buffer，煮沸10min，置－80℃保存?zhèn)溆?。②線粒體蛋白與細(xì)胞漿蛋白的提取。收集細(xì)胞，PBS洗2次，4 ℃、600r／min離心10min，棄上清。加入1mL含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的線粒體分離試劑，重懸細(xì)胞，勻漿細(xì)胞，4 ℃、600r／min離心10 min，將上清移至新的離心管中，4℃、11 000r／min 離心10 min（上清為去除了線粒體的胞漿蛋白液，沉淀為線粒體）。冷卻后，置于－80℃中保存?zhèn)溆?。③Western blot分析與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的變化。取30μg蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至用甲醇活化的PVDF膜上，用含有50g／L脫脂奶粉的PBS封閉2h，用含20g／L 脫脂奶粉的一抗4 ℃孵育過夜。次日，將PVDF 膜用PBST 洗滌3 次，每次6 min。然后將PVDF膜置于用20g／L脫脂奶粉稀釋的HRP標(biāo)記的二抗中，室溫孵育1h，將PVDF 膜用PBST 緩沖液振搖洗滌5次，每次5min。將ECL試劑顯影。

1.2.7 統(tǒng)計分析 將試驗(yàn)所得結(jié)果用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Dunnet t的雙尾檢驗(yàn)多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，＊表示差異顯著（P＜0.05），＊＊表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 C17－吡唑琳基甾體衍生物1誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

透射電鏡觀察C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理的Hela細(xì)胞，細(xì)胞核濃縮，隨著時間的延長，細(xì)胞核發(fā)生明顯的碎裂（圖2A）。熒光顯微鏡下觀察AO／EB 染色后的Hela 細(xì)胞，對照組細(xì)胞只被AO 染色，細(xì)胞核內(nèi)呈均勻的亮綠色熒光；而處理組細(xì)胞于12h開始出現(xiàn)核內(nèi)染色質(zhì)固縮，隨著處理時間的延長，細(xì)胞核發(fā)生明顯的碎裂，晚期凋亡細(xì)胞的胞核內(nèi)出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)（圖2C）。

2.2 C17－吡唑琳基甾體衍生物1對Hela細(xì)胞凋亡率的影響

根據(jù)Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，運(yùn)用雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，藥物處理細(xì)胞24h時，細(xì)胞凋亡率為21.3%，與對照組相比顯著極差異，在48h時細(xì)胞的凋亡率為52.4%，與對照組相比差異極顯著，表明C17－吡唑琳基甾體衍生物1能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，且細(xì)胞的凋亡率與處理時間正相關(guān)（圖2B）。

圖2 吡唑啉基甾體衍生物1誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡Fig.2 C17－pyrazolinyl steroidal derivative induced apoptosis of Hela cells

2.2 C17－吡 唑 琳 基 甾 體 衍 生 物1 對Hela 細(xì) 胞Caspase活性的影響

利用Caspase檢測試劑盒檢測C17－吡唑琳基甾體衍生物1對Hela細(xì)胞Caspase分子的活化的影響。12.5μg／mL的C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理Hela細(xì)胞后，Caspase－8分子活性無顯著變化；而Caspase－3和Capase－9分子的活性在藥物處理12h后發(fā)生了顯著變化，在36h時，Caspase－3與Caspase－9的活性達(dá)到最高，與0h對照組細(xì)胞相比活性分別增加到了6.22和3.76倍，差異極顯著（圖3A）。

2.3 C17－吡唑琳基甾體衍生物1促進(jìn)Caspase－3的切割底物PARP的降解

Caspase－3的切割底物PARP 在C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理后12h開始發(fā)生降解，隨著藥物處理時間的延長，PARP發(fā)生降解的程度越明顯，表明PARP能夠被活化后的Caspase－3 切割，細(xì)胞內(nèi)存在依賴于Caspase－3的其他凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活（圖3B）。

2.4 C17－吡唑琳基甾體衍生物1 對線粒體通路中Bax與Bcl－2蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot檢測表明，C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理Hela細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達(dá)量隨處理時間而增加，抑凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)量則逐漸降低（圖4A）。

2.5 C17－吡唑琳基甾體衍生物1 對線粒體通路中Bax與Cytochrome c轉(zhuǎn)位的影響

通過Western blot檢測表明，藥物處理Hela細(xì)胞12h后，可以在胞漿中檢測到Cytochrome C，并且其表達(dá)量隨時間的延長而逐漸增加，說明Cytochrome C由線粒體釋放到胞漿，同時在胞漿中Bax表達(dá)量隨時間延長而降低（圖4B）。

圖3 吡唑啉基甾體衍生物1對Hela細(xì)胞Caspase活性的影響Fig.3 The effect of C17－pyrazolinyl steroidal derivative on Caspases activities of Hela cells

圖4 C17－吡唑啉基甾體衍生物1對Hela細(xì)胞Ba、Bcl－2和細(xì)胞色素C的作用Fig.4 The effect of C17－pyrazolinyl steroidal derivative on Bax，Bcl－2，and cytochrome C in Hela cells

3 討論

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的程序性細(xì)胞死亡［7］。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，早期凋亡時，細(xì)胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)凝集，細(xì)胞質(zhì)濃縮。中晚期凋亡時，細(xì)胞膜內(nèi)陷，細(xì)胞核碎裂，有凋亡小體的產(chǎn)生［8］。本研究利用AO／EB 染色，觀察C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理后Hela細(xì)胞核形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)藥物處理的Hela細(xì)胞的染色質(zhì)固縮，隨著處理時間的延長，核碎裂更加嚴(yán)重，最終導(dǎo)致凋亡小體的產(chǎn)生，為典型的凋亡細(xì)胞特征。

Caspases蛋白酶為天冬半胱氨酸蛋白酶，其介導(dǎo)的蛋白質(zhì)裂解在細(xì)胞凋亡過程中起著重要的作用［9］。細(xì)胞凋亡的信號通路主要包括死亡受體通路和線粒體通路［10］。死亡受體通路主要依賴于Caspase－8活化，線粒體通路的激活主要依賴于Caspase－9活化［11］。本研究檢測了Caspases活性，C17－吡唑琳基甾體衍生物1處理后，能夠活化Hela細(xì)胞內(nèi)的Caspase－3 和Caspase－9，而Caspase－8 的活性沒有顯著差異，表明該藥物能夠通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Bcl－2家族在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，其家族成員主要包括促凋亡蛋白Bax、Bad、Bak 和抑凋亡蛋白Bcl－2、Bcl－XL、Bcl－w 等，其中Bcl－2 和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的兩個關(guān)鍵蛋白［12－14］。本研究發(fā)現(xiàn)，C17－吡唑琳基甾體衍生物1 處理Hela細(xì)胞后，Bax／Bcl－2的比率升高，胞漿內(nèi)游離的Bax 轉(zhuǎn)移到線粒體中，從而改變了線粒體膜的通透性，進(jìn)而使線粒體中的促凋亡分子Cyt c釋放到胞質(zhì)中，參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路。綜上所述，合成的C17－吡唑琳基甾體衍生物1 能夠通過線粒體途徑誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，為進(jìn)一步研究其抗腫瘤作用提供了依據(jù)。

［1］ Schneider G，Wolfling J.Synthetic cardenolides and related compounds［J］.Curr Org Chem，2004，8（14）：1381－1403.

［2］ Amr Ael G，Sayed H H，Abdulla M M.Synthesis and reactions of some new substituted pyridine and pyrimidine derivatives as analgesic，anticonvulsant and antiparkinsonian agents［J］.Archiv Der Pharmazie，2005，338（9）：433－440.

［3］ Banday A H.Studies on novel D－ring substituted steroidal pyrazolines as potential anticancer agents［J］.Steroids，2010，75（12）：805－809.

［4］ Banday A H，Zargar M I，Ganaie B A.Synthesis and antimicrobial studies of chalconyl pregnenolones［J］.Steroids，2011，76（12）：1358－1362.

［5］ Ivanyi Z.Synthesis of D－ring－substituted（5′R）－and（5′S）－17 beta－pyrazolinylandrostene epimers and comparison of their potential anticancer activities［J］.Steroids，2012，77（5）：566－574.

［6］ Fan N J.Synthesis and cytotoxic activity of some novel steroidal C－17pyrazolinyl derivatives［J］.Euro J Med Chem，2013，69：182－190.

［7］ Tower J.Programmed cell death in aging［D］.Ageing Res Rev，2015.

［8］ Guicciardi M E，Gores G J.Apoptosis as a mechanism for liver disease progression［J］.Seminar Liver Dis，2010，30（4）：402－410.

［9］ McIlwain D R，Berger T，Mak T W.Caspase functions in cell death and disease［J］.Cold Spring Harbor Perspect Bioly，2013，5（4）.doi：10.1101／cshperspect.a008656.

［10］ Wang C X，Youle R J.The role of mitochondria in apoptosis［J］.Annu Rev Genetics，2009，43：95－118.

［11］ Yao Z.RIP1modulates death receptor mediated apoptosis and autophagy in macrophages［J］.Mol Oncol，2015，9（4）：806－817.

［12］ Cheng E.Molecular control of mitochondrial apoptosis by the BCL－2family［J］.Blood，2009，114（22）：1577－1578.

［13］ Wang J.Mitochondrial division inhibitor 1（mdivi－1）enhances death receptor－mediated apoptosis in human ovarian cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，456（1）：7－12.

［14］ Ding L.TGEV nucleocapsid protein induces cell cycle arrest and apoptosis through activation of p53signaling［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，445（2）：497－503.