彭 忠，梁 婉，2，劉文靜，徐卓菲，譚 臣，吳 斌＊，周 銳，陳煥春

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430070）

多殺性巴氏桿菌是一種嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的重要的革蘭陰性病原菌，對(duì)多種畜禽及野生動(dòng)物甚至人都能造成不同程度的感染和致病［1－2］。依據(jù)莢膜抗原的不同，多殺性巴氏桿菌常被分為A、B、D、E、F 5種血清型［3］。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同血清型的多殺性巴氏桿菌表現(xiàn)出一定的宿主及致病偏好性［2］。多殺性巴氏桿菌的毒力因子眾多，目前已知的毒力因子主要包括莢膜、脂多糖（LPS）、黏附因子、巴氏桿菌毒素（PMT）、鐵攝取相關(guān)蛋白、唾液酸代謝、透明質(zhì)酸酶以及外膜蛋白（OMP）［4］。

有研究發(fā)現(xiàn)［5－6］，革蘭陰性菌中1／3的蛋白合成后需要被轉(zhuǎn)運(yùn)或分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用，包括某些水解酶類、細(xì)胞毒素、膠質(zhì)類、生長因子、激素類或抗體等，這類蛋白被稱為分泌蛋白。分泌蛋白一般占細(xì)菌基因組編碼蛋白總量的10%～20%，它們不僅參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且對(duì)于細(xì)胞增值、分化及凋亡都具有十分重要的調(diào)控作用。因此，研究細(xì)菌的分泌蛋白對(duì)于了解細(xì)菌的生命周期及其致病機(jī)理以及病原菌與宿主間的相互作用具有十分重要的意義。然而，由于分泌蛋白不易被高濃度提取，這對(duì)于開展分泌蛋白研究產(chǎn)生了較大的阻礙。

隨著全基因組測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)的發(fā)展，特別是細(xì)菌全基因組序列的測(cè)定和公布及配套生物信息學(xué)工具的開發(fā)為細(xì)菌分泌蛋白的預(yù)測(cè)和功能研究提供了巨大的幫助。自2001年分離于美國的禽源多殺性巴氏桿菌Pm70株的全基因組測(cè)序被報(bào)道后［7］，最近幾年又有幾株完整的多殺性巴氏桿菌全基因組序列被公布，其中的多殺性巴氏桿菌HN06株是一株來源于中國海南地區(qū)的D 型產(chǎn)毒素巴氏桿菌，分離自一頭患有萎縮性鼻炎病豬的鼻腔，其全基因組序列的測(cè)序于2012年完成并公布［8］，是世界上第1株完成全基因組序列測(cè)定的產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌。本研究將利用Signal P、Tmhmm、Phobius、Target P、Lipop、GPI－SOM、Tat P、SecretomeP 等生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)出其分泌蛋白［9］，并將這些蛋白與其他3株多殺性巴氏桿菌（Pm70、3480、36950）的分泌蛋白進(jìn)行比較分析，篩選出4株菌株共有的經(jīng)典途徑Sec分泌蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了初步的功能分析，為進(jìn)一步篩選多殺性巴氏桿菌亞單位疫苗候選蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

多殺性巴氏桿菌Pm70、3480、36950 及HN06的全基因組信息均下載于GenBank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／genome／genomes／912）；分泌蛋白預(yù)測(cè)及分析工具包括Signal P4.1（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）；Tmhmm v 2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／Tmhmm／）；Phobius（http：／／phobius.sbc.su.se／）；Target P1.1（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TargetP／）；Lipo P1.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／LipoP／）；GPI－SOM（http：／／gpi.unibe.ch／）以及SecretomeP 2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SecretomeP／）。

1.2 方法

1.2.1 Sec途徑分泌蛋白的篩選 分泌蛋白的氨基酸序列的N 端通常有一段10個(gè)～50個(gè)氨基酸的疏水性片段即信號(hào)肽［6］，用以引導(dǎo)隨后的蛋白質(zhì)多肽鏈穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜到達(dá)腔內(nèi)，完成后，一些信號(hào)肽序列被信號(hào)肽酶切除，釋放出成熟的分泌蛋白。因此蛋白質(zhì)序列N 端是否具有信號(hào)肽可以作為一個(gè)重要的預(yù)測(cè)依據(jù)。對(duì)Pm70、3480、36950及HN06等4個(gè)基因組的蛋白序列用Signal P4.1［10］，進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)，保留具有信號(hào)肽的蛋白。使用Tmhmm v2.0［11］篩選出具有0或1個(gè)跨膜螺旋的蛋白，由于該軟件在判斷具有1個(gè)跨膜螺旋的蛋白時(shí)，不能準(zhǔn)確區(qū)分信號(hào)肽和跨膜區(qū)，因此需要使用Phobius軟件重新預(yù)測(cè)具有1個(gè)跨膜螺旋的蛋白，剔除確實(shí)具有跨膜區(qū)的蛋白［12］。再利用GPI－SOM 判斷上述篩選的蛋白中是否具有錨定位點(diǎn)，剔除錨定蛋白。最后，采用Target P1.1軟件預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位，進(jìn)一步確定該蛋白的分布類型，保留分泌型蛋白。上述篩選的蛋白在LipoP 軟件的預(yù)測(cè)下被分為4類，即被Ⅰ型信號(hào)肽酶識(shí)別的蛋白、被Ⅱ型信號(hào)肽酶識(shí)別的蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白和跨膜蛋白。

綜上所述，具有信號(hào)肽、不含跨膜螺旋、無GPI錨定位點(diǎn)、通過分泌途徑分泌且能被Ⅰ型和Ⅱ型信號(hào)肽酶識(shí)別的蛋白可初步預(yù)測(cè)為Sec分泌蛋白［13］。

1.2.2 Tat途徑分泌蛋白的篩選 使用Tat P 軟件篩選出具有RR 信號(hào)肽且D 值大于默認(rèn)閥值0.36的蛋白，然后使用Tmhmmv 2.0和Phobius篩選出其中無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白。

1.2.3 無信號(hào)肽的非經(jīng)典分泌蛋白的篩選 用Signal P4.1篩選出沒有信號(hào)肽的蛋白，并用SecretomeP 2.0 軟 件 選 取secp 值 大 于0.5 的 序 列。經(jīng)Tmhmmv 2.0和Phobius篩選，保留無信號(hào)肽、secp值大于0.5的無跨膜螺旋蛋白［14］。

2 結(jié)果

2.1 基因組和蛋白組信息搜集

多殺性巴氏桿菌Pm70、3480、36950 及HN06這4株多殺性巴氏桿菌的全基因組序列及蛋白質(zhì)序列均來自于美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI），GenBank登 錄 號(hào) 分 別 為：NC－002663、NC－017764、NC－016808、NC－017027；其中HN06株的全基因組序列和蛋白質(zhì)序列由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北，武漢）提交。

2.2 多殺性巴氏桿菌HN06株分泌蛋白預(yù)測(cè)

2.2.1 Sec途徑分泌蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果 使用Signal P4.1預(yù)測(cè)到多殺性巴氏桿菌HN06株含有179個(gè)具有信號(hào)肽的蛋白，進(jìn)一步利用Tmhmmv 2.0軟件預(yù)測(cè)到這179個(gè)蛋白包括150個(gè)無跨膜螺旋的蛋白和22個(gè)只有1個(gè)跨膜螺旋的蛋白；經(jīng)Phobius軟件檢查發(fā)現(xiàn)，具有1個(gè)跨膜螺旋的22個(gè)蛋白中有2個(gè)蛋白具有跨膜區(qū)。此外，使用GPI－SOM 軟件預(yù)測(cè)出10個(gè)錨定蛋白，排除后采用Target P 軟件確定其亞細(xì)胞定位，篩選出分泌型蛋白157個(gè)。最后，用LipoP 軟件篩選出能被Ⅰ型信號(hào)肽酶識(shí)別的蛋白120個(gè)，能被Ⅱ型信號(hào)肽酶識(shí)別的蛋白37個(gè)。

2.2.2 Tat途徑分泌蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果 經(jīng)Tat P 分析，共預(yù)測(cè)到HN06株中Tat途徑分泌蛋白8個(gè)。

2.2.3 非經(jīng)典途徑分泌蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果 HN06 株非經(jīng)典途徑分泌蛋白共預(yù)測(cè)到208個(gè)。

2.3 多殺性巴氏桿菌HN06株分泌蛋白組成分析

多殺性巴氏桿菌全基因組共編碼2 265個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF），經(jīng)預(yù)測(cè)其中含有373個(gè)分泌蛋白，所占比例為16.5%；這些分泌蛋白中spⅠ、spⅡ、Tat P、非經(jīng)典途徑分泌蛋白比例見圖1；就氨基酸就成個(gè)數(shù)而言，373個(gè)分泌蛋白中氨基酸數(shù)量最小為36 個(gè)，最大為2 987個(gè)，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的大小皆位于0～350 個(gè)氨基酸殘基之間，占分泌蛋白總數(shù)的71.1%（圖2）。

信號(hào)肽是Ⅰ型和Ⅱ型分泌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程中必不可少的一個(gè)元件，我們對(duì)其長度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)Ⅰ型分泌蛋白的長度分布在18 個(gè)～33 個(gè)氨基酸之間，其中19個(gè)～26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽最多，占91.7%，Ⅱ型分泌蛋白的長度分布在15個(gè)～25個(gè)氨基酸之間，其中18個(gè)～19 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽最多，占59.5%（圖3）。

圖1 HN06株分泌蛋白組成分布圖Fig.1 Pie chart of the distribution of HN06Sec proteins

圖2 HN06株分泌蛋白的ORF長度分布Fig.2 Distribution of the Sec protein ORF length of HN06

圖3 Ⅰ型和Ⅱ型分泌蛋白的信號(hào)肽長度分布Fig.3 Distribution of signal peptide length of the Sec proteins recognized by signal peptidaseⅠandⅡ

Tat途徑分泌蛋白的信號(hào)肽N 端含有一段RRmotif保守結(jié)構(gòu)區(qū)，因此這種信號(hào)肽又稱RR－motif型信號(hào)肽，通常組成為RR－X－（FGAVML）－（LITMVF）［15］，X 為任意氨基酸。本研究對(duì)Tat途徑分泌蛋白的RR－motif信號(hào)肽進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，HN06中預(yù)測(cè)到的8個(gè)RR－motif均符合一般組成規(guī)律（表1）。

2.4 HN06分泌蛋白功能分析

2.4.1 Sec途徑分泌蛋白功能分析 根據(jù)HN06株蛋白注釋信息及功能不明確蛋白的Blastp發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)到的120 個(gè)spⅠ型分泌蛋白中假設(shè)蛋白26個(gè)，所占比例21.7%。其余蛋白的功能主要是細(xì)胞壁合成酶、代謝相關(guān)酶類、水解酶及代謝相關(guān)蛋白。代謝相關(guān)蛋白中除ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、磷酸結(jié)合蛋白外，還發(fā)現(xiàn)有7個(gè)鐵代謝相關(guān)蛋白、4個(gè)血紅蛋白結(jié)合蛋白及4個(gè)TonB 依賴性蛋白，這些都是病原菌鐵攝取途徑必須的蛋白。

表1 HN06株具有RR－motif的8個(gè)信號(hào)肽Table 1 8RR－motif signal peptides in Pasteurella multocida HN06

spⅡ型分泌蛋白又稱脂蛋白，在對(duì)其功能分析發(fā)現(xiàn)，假設(shè)蛋白11 個(gè)，所占比例30%，其余蛋白主要是代謝酶類和代謝相關(guān)蛋白。

2.4.2 Tat途徑分泌蛋白功能分析 預(yù)測(cè)到的8個(gè)Tat途徑分泌蛋白中有5個(gè)還原酶，1個(gè)代謝相關(guān)的脫氫酶，1個(gè)磷酸二酯酶及1個(gè)細(xì)胞分裂蛋白。

2.4.3 非經(jīng)典途徑分泌蛋白 HN06株中共預(yù)測(cè)到非經(jīng)典途徑分泌蛋白208 個(gè)，其中假設(shè)蛋白84個(gè)，所占比例40.4%。其余蛋白中DNA 復(fù)制相關(guān)蛋白和酶占16.3%，代謝酶類占9.6%，氧化還原酶類占6.3%，另外還有7個(gè)噬菌體相關(guān)蛋白、2個(gè)血紅素結(jié)合受體及熱擊蛋白、冷擊蛋白及黏附素等。

2.5 四株多殺性巴氏桿菌共有sec途徑分泌蛋白功能分析

對(duì)其他3株巴氏桿菌使用同樣的方法預(yù)測(cè)出其sec途徑分泌蛋白，并對(duì)這些分泌蛋白序列使用Blastp進(jìn)行比對(duì)，共得到203個(gè)sec途徑分泌蛋白。各株菌所包含的sec途徑分泌蛋白的分布情況見圖4，四株菌共有的sec途徑分泌蛋白共114個(gè)，占總數(shù)的56.2%，至少在兩株菌中存在的sec途徑分泌蛋白共69個(gè)，占總數(shù)的34.0%，剩余的9.80%為各個(gè)菌株所特有。

圖4 Pm70、3480、36950及HN06株Sec分泌蛋白分布韋恩示意圖Fig.4 Venn diagram of the distribution of Sec proteins of Pm70，3480，36950and HN06strains

對(duì)這4株巴氏桿菌預(yù)測(cè)到的共有Sec分泌蛋白的功能分析發(fā)現(xiàn)，有13個(gè)功能未知的假設(shè)蛋白，所占比例為11.4%，其余的蛋白中代謝相關(guān)蛋白占39.5%，代謝酶類占9.65%，其中代謝相關(guān)蛋白中有31.1%是鐵代謝、血紅蛋白結(jié)合蛋白和TonB 依賴性蛋白。

3 討論

生物信息學(xué)的發(fā)展使得人們能夠?qū)⑵鋸V泛的應(yīng)用于科學(xué)研究中，更快速有效的獲取信息。但是不同的軟件有著不同的計(jì)算方式，預(yù)測(cè)的結(jié)果也不盡相同，甚至?xí)蓄A(yù)測(cè)錯(cuò)誤的現(xiàn)象出現(xiàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)十分必要。

在本次研究中，預(yù)測(cè)到巴氏桿菌HN06株分泌蛋白共373個(gè)，其中Sec分泌蛋白157個(gè)，Tat途徑分泌蛋白8 個(gè)，無信號(hào)肽的非經(jīng)典途徑分泌蛋白208個(gè)。Sec分泌蛋白被Ⅰ型信號(hào)肽酶識(shí)別的有120個(gè)，被Ⅱ型信號(hào)肽酶識(shí)別的有37個(gè)。在對(duì)其功能分析后發(fā)現(xiàn)，Sec分泌蛋白中代謝相關(guān)蛋白和酶類及細(xì)胞壁水解和合成相關(guān)酶類較多，Tat途徑分泌蛋白中還原酶較多，而非經(jīng)典途徑分泌蛋白中DNA 復(fù)制相關(guān)蛋白和酶類較多。Pm70、3480、36950及HN06這4株巴氏桿菌共有的Sec分泌蛋白中代謝相關(guān)蛋白較多，并且鐵代謝、血紅蛋白結(jié)合蛋白和TonB依賴性蛋白占有較大比例。

研究發(fā)現(xiàn)，鐵是病原菌生長所必須的微量營養(yǎng)元素，多殺性巴氏桿菌中鐵代謝相關(guān)基因占全基因組的2.5%。細(xì)菌通過鐵載體、轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白等多種螯合系統(tǒng)調(diào)控鐵的代謝，每種螯合系統(tǒng)都包括1個(gè)外膜受體，1個(gè)胞周質(zhì)結(jié)合蛋白及1個(gè)胞內(nèi)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［16］。通過預(yù)測(cè)得知，巴氏桿菌的分泌蛋白中有較大比例參與了鐵的代謝，而其他代謝相關(guān)酶類等對(duì)于細(xì)菌的增殖、分化及毒力都有十分重要的意義。分泌蛋白是在細(xì)胞內(nèi)合成后運(yùn)送到細(xì)胞外發(fā)生作用的蛋白，它是細(xì)胞與外界環(huán)境發(fā)生相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。但是分泌蛋白在細(xì)胞代謝中具有的重要意義，需要更進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)，以便于更清晰的了解其代謝機(jī)制和致病原理，篩選出免疫原性更好的蛋白。

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