羅剛銀，王弼陡，繆 鵬，王 磊，王鐘周，錢 慶，錢 俊

(中國(guó)科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，中科院生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó) 江蘇215163)

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激光共聚焦近紅外熒光掃描系統(tǒng)光學(xué)設(shè)計(jì)

羅剛銀，王弼陡，繆 鵬，王 磊，王鐘周，錢 慶，錢 俊

(中國(guó)科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，中科院生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó) 江蘇215163)

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)近紅外熒光的高分辨率掃描，設(shè)計(jì)了工作在近紅外光譜區(qū)的激光共聚焦光學(xué)系統(tǒng)。采用結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的凹凸雙透鏡物鏡實(shí)現(xiàn)了照明光路和發(fā)射光路的設(shè)計(jì)，并采用Zemax軟件進(jìn)行了光學(xué)設(shè)計(jì)和仿真。實(shí)驗(yàn)表明：照明光路的聚焦彌散斑小于1 μm，照明針孔處的聚焦光斑小于40 μm，滿足照明針孔的尺寸要求；發(fā)射針孔處的聚焦光斑小于10 μm，滿足探測(cè)針孔尺寸要求；同時(shí)照明光路和發(fā)射光路的MTF曲線的截止頻率都分別滿足其衍射極限分辨率的要求，照明光路在全視場(chǎng)空間分辨率420 lp/mm處MTF>0.08，發(fā)射光路在全視場(chǎng)空間頻率400 lp/mm處MTF>0.07。

光學(xué)設(shè)計(jì)；近紅外熒光掃描；激光共聚焦；Zemax

引言

熒光標(biāo)記技術(shù)是指利用一些能發(fā)射熒光的物質(zhì)(如熒光探針，熒光染料等)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究樣本的某個(gè)基團(tuán)(如蛋白分子等)上，然后利用熒光掃描儀等儀器檢測(cè)其熒光特性來(lái)提供被研究對(duì)象的內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息(如抗原抗體分布、濃度等)。用于熒光標(biāo)記的熒光物質(zhì)有很多，而其中的近紅外熒光染料(near infrared fluorescence, NIR)具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。近紅外熒光染料的發(fā)射波長(zhǎng)為700 nm～1 200 nm，在該范圍內(nèi)生物分子自身熒光較弱，可避免背景干擾而獲得較高的分析靈敏度。近紅外熒光具有較強(qiáng)的穿透能力，能夠?qū)崿F(xiàn)樣本的深層檢測(cè)，近紅外熒光對(duì)樣本造成的光損傷較低，也有利于實(shí)現(xiàn)活體檢測(cè)[1]。

激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)(laser induced fluorescence， LIF)是常見(jiàn)的熒光檢測(cè)技術(shù)，而激光共聚焦掃描技術(shù)(confocal laser scanning, CLS)是共聚焦技術(shù)與LIF技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。LIF技術(shù)和CLS技術(shù)都采用激光作為發(fā)射熒光的激發(fā)光源，但是LIF技術(shù)中照明激光和發(fā)射熒光不通過(guò)同一物鏡，激光往往對(duì)樣本進(jìn)行斜射照明，是場(chǎng)光源，可用于普通的熒光顯微鏡；而CLS技術(shù)中照明激光和發(fā)射熒光通過(guò)同一物鏡，激光往往對(duì)樣本進(jìn)行垂直照明，是點(diǎn)光源[2]，可用于激光共聚焦顯微鏡。相對(duì)于LIF技術(shù)，CLS技術(shù)具有更高的分辨率[3]，并且可以實(shí)現(xiàn)深度熒光掃描。

本文根據(jù)CLS技術(shù)的工作原理，針對(duì)近紅外熒光染料的光譜需求，設(shè)計(jì)了近紅外熒光掃描光學(xué)系統(tǒng)，并采用Zemax軟件對(duì)光學(xué)設(shè)計(jì)進(jìn)行了優(yōu)化。

1 激光共聚焦工作原理

CLS技術(shù)是利用照明針孔對(duì)照明光源的空間濾波和整形作用，形成點(diǎn)光源對(duì)樣品進(jìn)行照射，而點(diǎn)光源具有發(fā)散小、能量集中等優(yōu)點(diǎn)，有利于對(duì)樣品中的熒光物質(zhì)進(jìn)行高效激發(fā)，這也避免了場(chǎng)光源照射時(shí)樣品中每一點(diǎn)的熒光激發(fā)都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射或散射光干擾的問(wèn)題。同時(shí)，CLS技術(shù)還利用樣品中的點(diǎn)光源照射點(diǎn)與探測(cè)針孔的共軛關(guān)系來(lái)實(shí)現(xiàn)有用熒光的抗干擾、高精度探測(cè)，即只有在焦平面上的點(diǎn)光源照射點(diǎn)所發(fā)出的熒光能夠通過(guò)探測(cè)針孔被光電探測(cè)元件所接收，而焦平面以外的干擾熒光和散射光不能通過(guò)探測(cè)針孔?？梢?jiàn)，CLS光學(xué)系統(tǒng)中的照明針孔和探測(cè)針孔共同聚焦于樣品中的點(diǎn)光源照明點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)樣品中的激發(fā)熒光的高分辨率探測(cè)。

CLS光學(xué)系統(tǒng)主要由照明光源、照明光濾光片、照明光聚焦透鏡組、照明針孔、準(zhǔn)直透鏡組、二向色鏡、物鏡、發(fā)射光濾光片、發(fā)射光聚焦透鏡組、探測(cè)針孔、光電探測(cè)元件等構(gòu)成，如圖1所示。

圖1中，LASER為用作照明光源的激光器，F(xiàn)1為照明光濾光片，F(xiàn)2為發(fā)射光濾光片，L1為照明光聚焦透鏡組，L2為準(zhǔn)直透鏡組，L3為物鏡，L4為發(fā)射光聚焦透鏡組，A1為照明針孔，A2為探測(cè)針孔，D1為用于照明光和發(fā)射光分離的二向色鏡，PMT為用于光電探測(cè)的光電倍增管。按照功能劃分，CLS光學(xué)系統(tǒng)包括照明光路和發(fā)射光路兩部分，其中照明光路包括的光學(xué)元件有LASER、F1、A1、L1、L2、L3、D1，而發(fā)射光路包括的光學(xué)元件有L3、L4、D1、F2、A2、PMT。

圖1 激光共聚焦工作原理圖Fig.1 Principle diagram of confocal laser scanning

2 光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)指標(biāo)

CLS光學(xué)系統(tǒng)的照明光源是方向性、單色性很好的激光，采用平行入射的方式進(jìn)入光學(xué)系統(tǒng)，因此在光學(xué)設(shè)計(jì)時(shí)只需校正軸上點(diǎn)，即0視場(chǎng)的球差。具體的設(shè)計(jì)任務(wù)要求如下：

1) 視場(chǎng)角w=0°，入瞳直徑為8 mm，只校正軸上點(diǎn)球差。

2) 工作于近紅外波段，其中照明激光光源的波長(zhǎng)為780 nm，發(fā)射熒光的波長(zhǎng)為820 nm。

3) CLS光學(xué)系統(tǒng)常用的照明針孔和探測(cè)針孔的尺寸范圍為50 μm ～300 μm，因此照明光聚焦透鏡組L1和發(fā)射光聚焦透鏡組L2的焦點(diǎn)彌散斑應(yīng)該小于50 μm。

4) CLS光學(xué)系統(tǒng)的共聚焦焦點(diǎn)的幾何彌散斑直徑小于1 μm。

5) 鏡頭結(jié)構(gòu)盡量簡(jiǎn)單。

3 具體光學(xué)設(shè)計(jì)過(guò)程

3.1 物鏡(L3)光學(xué)設(shè)計(jì)

考慮到單透鏡很難校正球差，因此采用凹凸雙透鏡結(jié)構(gòu)[4]來(lái)設(shè)計(jì)CLS系統(tǒng)的物鏡L3，設(shè)置入瞳直徑為8 mm，角度視場(chǎng)為0視場(chǎng)，波長(zhǎng)為780 nm，F(xiàn)數(shù)=1/2。考慮選擇一種類似于雙膠合透鏡的結(jié)構(gòu)，先簡(jiǎn)單將所有的半徑設(shè)置為20 mm，所有的厚度設(shè)置為6 mm，兩塊透鏡分別選擇高反射率的玻璃SF59(n=1.95)和ZF14(n=1.92)，如表1所示。初始結(jié)構(gòu)的像差曲線、點(diǎn)列圖和MTF曲線分別如圖2、圖3和圖4所示，由以上圖示可見(jiàn)，該初始結(jié)構(gòu)的像差很大，由MTF曲線也可看出該初始結(jié)構(gòu)的成像質(zhì)量很差，因此需要校正像差。

表1 物鏡初始結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖2 初始結(jié)構(gòu)的像差曲線Fig.2 Ray fan of initial structure

圖3 初始結(jié)構(gòu)的點(diǎn)列圖Fig.3 Spot diagram of initial structure

圖4 初始結(jié)構(gòu)的MTF曲線Fig.4 MTF curves of initial structure

由于本物鏡只校正軸上點(diǎn)球差，因此通過(guò)設(shè)置優(yōu)化函數(shù)進(jìn)行球差校正，從而得到所需的物鏡結(jié)構(gòu)。優(yōu)化函數(shù)的具體設(shè)置如下：

1) 設(shè)置優(yōu)化函數(shù)為“RMS(均方根)+Spot Radius(像點(diǎn)尺寸)+Centroid(質(zhì)心點(diǎn))”。

2) 設(shè)置玻璃厚度邊界條件為“Min=1，Max=8”。

3) 設(shè)置空氣間隔邊界條件為“Min=1，Max=16”。

4) 增加LONA和SPHA優(yōu)化操作數(shù)，設(shè)置“Target=0，Weight=1”。

5) 將第1、2、3面鏡的r值設(shè)置為變量，通過(guò)選擇最后一面鏡的r值的Slove Type類型F Number值為1/2來(lái)限制物鏡的F數(shù)。

6) 將4個(gè)面鏡的d值都設(shè)置為變量。

首先采用“Optimization”進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化，然后選擇“Hammer Optimization”進(jìn)一步錘形優(yōu)化[5]。優(yōu)化后的凹凸雙透鏡物鏡的結(jié)構(gòu)參數(shù)如表2所示，其三維圖、像差曲線、點(diǎn)列圖分別如圖5、圖6和圖7所示。由圖5～圖7可見(jiàn)，設(shè)計(jì)的凹凸雙透鏡物鏡的像差很小，光學(xué)彌散斑的直徑小于1 μm。

表2 優(yōu)化后的物鏡結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖5 優(yōu)化后物鏡的三維圖與渲染圖Fig.5 3D layout and shaded model of optimized objective

圖6 優(yōu)化后物鏡的像差曲線Fig.6 Ray fan of optimized objective

圖7 優(yōu)化后物鏡的點(diǎn)列圖Fig.7 Spot diagram of optimized objective

物鏡的數(shù)值孔徑表征物鏡的聚光能力，是物鏡的重要性質(zhì)之一，增強(qiáng)物鏡的聚光能力可提高物鏡的分辨率。數(shù)值孔徑NA的計(jì)算公式如下：

NA=n·sinθ

(1)

式中：n為物鏡與觀察對(duì)象之間介質(zhì)的折射率；如空氣的折射率為1；θ為物鏡的孔徑半角，計(jì)算得該物鏡的數(shù)值孔徑值為0.24。

數(shù)值孔徑NA是顯微鏡物鏡最主要的光學(xué)特性，它決定了物鏡的衍射分辨率δ[6]的大小，其計(jì)算公式為

(2)

該物鏡的工作波長(zhǎng)為780 nm，因此其衍射分辨率為1.98 μm。優(yōu)化后的物鏡的MTF曲線如圖8所示，可見(jiàn)其在全視場(chǎng)空間頻率N=1/δ=504 lp/mm處的MTF>0.1[7]，因此具有極高的分辨率。

圖8 優(yōu)化后物鏡的MTF曲線Fig.8 MTF curves of optimized objective

由于該物鏡只是照明光路和發(fā)射光路的一部分，還需要分別和照明光路、發(fā)射光路一起校正球差，因此該物鏡的參數(shù)結(jié)構(gòu)在照明光路和發(fā)射光路的設(shè)計(jì)過(guò)程中還會(huì)繼續(xù)做調(diào)整。

1.2 照明光路(F1、A1、L1、L2、L3)設(shè)計(jì)

為了簡(jiǎn)化光路，選擇單凸透鏡設(shè)計(jì)照明光聚焦透鏡組L1，玻璃材料依然選擇SF59。單凸透鏡結(jié)構(gòu)參數(shù)如表3所示，其三維圖與渲染圖如圖9所示，點(diǎn)列圖如圖10所示。該照明光聚焦透鏡組L1的會(huì)聚光斑的點(diǎn)列圖小于40 μm，因此完全滿足目前激光共聚焦常用照明針孔直徑為50 μm～300 μm的實(shí)際應(yīng)用需求。同時(shí)，由于所采用單凸透鏡的第2面鏡為平面，因此也進(jìn)一步降低了該透鏡的加工和安裝要求。

表3 單凸透鏡結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖9 單凸透鏡的三維圖與渲染圖Fig.9 3D layout and shaded model of single convex lens

圖10 單凸透鏡的點(diǎn)列圖Fig.10 Spot diagram of single convex lens

同樣，采用單凸透鏡設(shè)計(jì)準(zhǔn)直透鏡組L2，其初始結(jié)構(gòu)與表3相同，并添加二向色鏡的反光面和物鏡L3，得到照明光路的初始結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步優(yōu)化該照明光路，保持照明光聚焦透鏡組L1的光學(xué)結(jié)構(gòu)固定不變，設(shè)置準(zhǔn)直透鏡組L2的凸面(第4面)和物鏡L3的4個(gè)面(第6、7、8、9面)的r值為變量，設(shè)置L2的玻璃厚度d值為變量，同時(shí)設(shè)置L3的玻璃厚度d值和空氣間隔d值為變量。先采用“Optimization”進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化，然后選擇“Hammer Optimization”進(jìn)一步錘形優(yōu)化，通過(guò)改變r(jià)值、d值的方法來(lái)優(yōu)化照明光路結(jié)構(gòu)，優(yōu)化后的照明光路結(jié)構(gòu)參數(shù)如表4所示，其三維圖和渲染圖如圖11所示。

表4 優(yōu)化后的照明光路結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖11 照明光路的三維圖與渲染圖Fig.11 3D layout and shaded model of lighting lens

優(yōu)化后的照明光路的像差曲線、點(diǎn)列圖、MTF曲線分別如圖12、圖13和圖14所示。由圖12～圖14可見(jiàn)該照明光路的彌散斑尺寸小于1 μm。另外，物鏡L3的參數(shù)結(jié)構(gòu)在照明光路像差校正的過(guò)程中已經(jīng)重新調(diào)整，其數(shù)值孔徑為0.2，工作波長(zhǎng)為780 nm，由公式(2)計(jì)算可得照明光路的衍射分辨率為2.38 μm，因此由圖13可知，其在全視場(chǎng)空間頻率N=1/δ=420 lp/mm處的MTF>0.08[7]，因此該照明光路具有極高的點(diǎn)光源分辨率。

圖12 照明光路的像差曲線Fig.12 Ray fan of lighting lens

圖13 照明光路的點(diǎn)列圖Fig.13 Spot diagram of lighting lens

圖14 照明光路的MTF曲線Fig.14 MTF curve of lighting lens

1.3 發(fā)射光路設(shè)計(jì)

為了簡(jiǎn)化光路，同樣選擇凹凸雙透鏡設(shè)計(jì)發(fā)射光聚焦透鏡組L4，其初始結(jié)構(gòu)與物鏡L3相同，并添加物鏡L3和二向色鏡的折射面，選擇二向色鏡D1和發(fā)射光濾光片F(xiàn)2的玻璃材質(zhì)為BK7，設(shè)置物方數(shù)值孔徑為0.2，得到其發(fā)射光路的初始結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步優(yōu)化該發(fā)射光路，設(shè)置發(fā)射光聚焦透鏡組L4的4個(gè)面(第9、10、11、12面)的r值為變量，設(shè)置L4的兩塊玻璃厚度d值和空氣間隔d值為變量，同時(shí)設(shè)置L4的兩塊玻璃材料為變量(選擇Slove Type類型為Substitute)。首先采用“Optimization”進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化，然后選擇“Hammer Optimization”進(jìn)一步錘形優(yōu)化，通過(guò)改變r(jià)值、d值和玻璃材料的方法來(lái)優(yōu)化發(fā)射光路結(jié)構(gòu)，優(yōu)化后的發(fā)射光路結(jié)構(gòu)參數(shù)如表5所示，其三維圖和渲染圖如圖15所示。

表5 優(yōu)化后的發(fā)射光路結(jié)構(gòu)

圖15 發(fā)射光路的三維圖與渲染圖Fig.15 3D layout and shaded model of emission lens

優(yōu)化后的發(fā)射光路的點(diǎn)列圖、MTF曲線分別如圖16和圖17所示。可見(jiàn)該發(fā)射光路的彌散斑尺寸小于10 μm，完全滿足目前激光共聚焦常用探測(cè)針孔直徑為50 μm～300 μm的實(shí)際應(yīng)用需求。同時(shí)，由于物鏡L3的數(shù)值孔徑為0.2，發(fā)射光路工作波長(zhǎng)為820 nm，由公式(2)計(jì)算可得發(fā)射光路的衍射分辨率為2.5 μm，由圖16可知，其在全視場(chǎng)空間頻率N=1/δ=400 lp/mm處的MTF>0.07[7]，因此該發(fā)射光路具有極高的光學(xué)傳輸效率。

圖16 發(fā)射光路的點(diǎn)列圖Fig.16 Spot diagram of emission lens

圖17 發(fā)射光路的MTF曲線Fig.17 MTF curves of emission lens

4 結(jié)論

本文采用激光共聚焦原理設(shè)計(jì)了近紅外熒光掃描系統(tǒng)，采用結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的凹凸雙透鏡物鏡實(shí)現(xiàn)了照明光路和發(fā)射光路的設(shè)計(jì)。其中，照明光路的聚焦彌散斑小于1 μm；照明針孔處的聚焦光斑尺寸小于40 μm，滿足照明針孔的尺寸要求；發(fā)射針孔處的聚焦光斑小于10 μm，滿足探測(cè)針孔尺寸要求；同時(shí)照明光路和發(fā)射光路的MTF曲線的截止頻率都分別滿足其衍射極限分辨率的要求，具有較高的光學(xué)傳輸效率。因此，該光學(xué)系統(tǒng)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、工作于近紅外光譜區(qū)、分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，可滿足生物芯片、基因 芯片等對(duì)激光共聚焦近紅外熒光掃描系統(tǒng)的需求。另外，本光學(xué)系統(tǒng)中物鏡的數(shù)值孔徑較小，因此還可以采用較為復(fù)雜的顯微物鏡來(lái)進(jìn)一步提高系統(tǒng)的數(shù)值孔徑，從而進(jìn)一步提高激光共聚焦光學(xué)系統(tǒng)的光學(xué)分辨率和熒光探測(cè)效率。

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Optical design of near infrared fluorescence confocal laser scanning system

Luo Gangyin,Wang Bidou,Miao Peng,Wang Lei,Wang Zhongzhou,Qian Qing,Qian Jun

(CAS Key Lab of Bio-Medical Diagnostics，Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology，CAS,Suzhou 215163, China)

In order to realize the high resolution scanning for near infrared fluorescence，a laser scanning confocal optical system was designed which worked in the near infrared region.The lighting lens,and emission lens were realized based on simple concave lens and convex lens.The software Zemax was used for the optical design and simulation. Simulation results shows that the focal spot’s size of lighting lens is less than 1 μm, and the focal spot’s size is less than 40 μm at the lighting pinhole position, which meets the lighting pinhole’s requirement.The focal spot’s size is less than 10 μm at the emission pinhole position, which meets the emission pinhole’s requirement.In addition,the cutoff frequency of the lighting lens and emission lens meets the diffraction limit resolution requirement respectively. Therefore, it has high optical transmission efficiency.

optical design;near infrared fluorescence scanning;confocal laser scanning;Zemax

1002-2082(2015)01-0029-06

2014-08-25；

2014-09-18

中科院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所“一三五”規(guī)劃重大突破資助項(xiàng)目(Y052031205);蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目(SYG201128)

羅剛銀(1984-)，男，四川德陽(yáng)人，助理研究員，主要從事生物光譜儀器方面的研究。E-mail：luogy1237@sina.com

TN24;TH703

A

10.5768/JAO201536.0101006