黃愷飛

（1.廈門市醫(yī)藥研究所藥物研發(fā)中心，福建 廈門361008；2.廈門南方海洋研究中心，福建 廈門361008）

NF-κB-p65信號分子參與重組蛋白藥物Kallistatin抑制人臍靜脈內皮細胞侵襲作用

黃愷飛1,2

（1.廈門市醫(yī)藥研究所藥物研發(fā)中心，福建 廈門361008；2.廈門南方海洋研究中心，福建 廈門361008）

通過構建NF-κB-p65真核表達質粒，研究NF-κB-p65在重組Kallistatin(rhKal)抑制內皮細胞侵襲中的作用及其分子機制。利用基因重組技術構建NF-κB-p65真核表達質粒載體，轉染入HUVEC細胞，檢測NF-κB-p65蛋白表達變化；Transwell小室觀察重組Kallistatin對轉染NF-κB-p65真核表達質粒HUVEC細胞侵襲的影響；Western blotting檢測過表達p65對重組Kallistatin對內皮細胞侵襲相關蛋白抑制作用的影響。人臍靜脈內皮細胞轉染NF-κB-p65真核表達質粒載體后，細胞內p65蛋白表達明顯升高；p65過表達可以逆轉rhKal對HUVEC細胞體外侵襲的抑制作用；過表達p65可以明顯抵抗rhKal對NF-κB信號通路下游相關靶基因的抑制作用。研究表明重組Kallistatin明顯抑制HUVEC細胞體外侵襲，其分子機制可能與NF-κB信號通路相關。

Kallistatin；HUVEC；NF-κB；侵襲；信號通路

Kallistatin（Kal）又稱組織激肽釋放酶結合蛋白，具有獨特的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性，隨后發(fā)現(xiàn)其參與高血壓［1-2］、炎癥［3-4］、血管生成［5-6］、腫瘤［7-8］等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，是一個極具臨床應用前景的蛋白類藥物。近些年來，Kallistatin的抗血管生成作用倍受大家的關注［9-10］。血管生成過程伴隨著血管內皮細胞的增殖、遷移和重構。抑制血管內皮細胞的增殖或侵襲成為抗血管生成的重要靶標之一。

p65具有TAD反式激活結構域，是NF-κB家族中含量最豐富、功能最重要的亞基，其參與了多種靶基因的表達調控，從而影響了多種生理還能，是目前研究NF-κB信號通路的關鍵分子［11］。目前認為NF-κB刺激癌癥發(fā)生與刺激促進腫瘤轉移、細胞生長、抑制凋亡、促進血管生成等密切相關［12-13］。本研究首先通過基因工程方法獲得高純度的Kallistatin蛋白；構建NF-κB-p65真核表達質粒載體，轉染HUVEC細胞；觀察重組Kallistatin對轉染NF-κB-p65真核表達質粒HUVEC細胞侵襲的影響；最后檢測過表達p65對重組Kallistatin對內皮細胞侵襲相關蛋白抑制作用的影響，明確NF-κB-p65信號分子在Kallistatin抑制人臍靜脈內皮細胞侵襲中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 試劑

轉染試劑Lipofectamin TM 2000（美國Invitrogen公司）；RPM I1640培養(yǎng)基、胎牛血清（GIBCO公司）；瓊脂糖（賽百盛公司）；限制性內切酶（NEB公司）；Taq polymerase、dNTP（Takara公司）；蛋白裂解液、蛋白提取試劑（海門碧云天公司）；雙抗（青鏈霉素）（Hyclone公司）；硝酸纖維素（NC）膜（廈門泰京生物有限公司）；NF-κB65,NF-κB50,ICAM-1,MMP-2,MMP-9, VEGF,酶標二抗多克隆抗體（武漢博士德公司）；YPD液體培養(yǎng)基、BMG培養(yǎng)基、FM 21基礎發(fā)酵培養(yǎng)基（由本實驗室配置），細胞培養(yǎng)板（CorningCostar公司）；Thincert小室（Greiner公司）。

1.1.2 儀器和細胞株

熒光倒置顯微鏡（日本Nikon）；多功能酶標儀（美國MD公司）；PCR儀（美國Bio-RAD公司）；水平、垂直電泳槽(美國Bio-RAD公司）；CO2培養(yǎng)箱（新加坡ESCO公司）；人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC細胞）由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 rhKal蛋白的表達和純化

取實驗室保存的含有pPIC9-Kal質粒的GS115 (His4)菌30μL接入8m L YPD液體培養(yǎng)基中，恒溫搖床內，28℃，220 r/min培養(yǎng)18～24 h，D（λ）值達到0.5以上，培養(yǎng)的發(fā)酵種液再以1∶50的比例接種于250 m LBMG培養(yǎng)基中，誘導表達16 h左右，當D（λ）值達到0.5以上，并鏡檢沒有染菌，再以1∶20比例接種于4 L FM 21基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)108 h放罐后，菌液10000 r/min，4℃離心30m in，棄菌體，收集上清進行純化。Western blotting方法對重組Kallistatin蛋白進行鑒定。

1.2.2 p65真核表達載體構建

人臍靜脈內皮細胞用含有10%小牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)基，放置于37℃、5%CO2和100%濕度條件下培養(yǎng)，利用酸性異硫氰酸胍法提取總RNA，用M-MLV逆轉錄酶和Oligo(dT)18引物逆轉錄合成cDNA第一鏈，并作為模板進行PCR擴增。根據(jù)GenBank中人p65序列（登錄號：RELA NM-021975）設計引物，上游引物P1：5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'，下游引物P2：5'-TTATTAGGAAAGGACAGTGGG-3'，分別引入了Xho I/Kpn I酶切位點。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2min，共30個循環(huán)；72℃延伸10m in；4℃保存。將PCR擴增得到的p65片段切膠回收后，同時與質粒GV141一起進行Xho I/Kpn I酶切，純化試劑盒純化酶切PCR產(chǎn)物，4℃下T4連接酶連接過夜。連接產(chǎn)物轉化入大腸桿菌DH 5α中保存，篩選陽性克隆菌，提取質粒進行PCR、酶切驗證，并測序。重組質粒GV141-p65經(jīng)鑒定引物為上游：CCACCTCGACGCATTGCTG；下游：TTATTAGGAAAGGACAGTGGG。

1.2.3真核表達質粒p65 cDNA細胞轉染

轉染前1 d將HUVEC細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，調整細胞濃度為3×105/m L，接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，待達到80%～90%細胞融合，棄上清，用無血清1640培養(yǎng)基洗滌細胞2～3次，加Opti-MEM I無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，準備轉染。移去24孔板中的原培養(yǎng)基，用Opti-MEM I培養(yǎng)基清洗細胞3次。將轉染混合液加入細胞板中，每孔100μL，輕輕混勻?？召|粒以200μLOpti-MEM I無血清培養(yǎng)基代替。用Opti-MEM I培養(yǎng)基補液到總體積500μL，培養(yǎng)12 h。用10%1640培養(yǎng)液洗細胞3遍，加入1m L 1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 Transwell侵襲小室實驗

HUVEC細胞分別轉染p65cDNA及GV141空載體24 h后，加入80μg/m L rhKal繼續(xù)培養(yǎng)20 h后，制備成單細胞懸液，調整濃度為2.5×105個/m L；加入Thincert侵襲小室，培養(yǎng)20 h后，取出Thincert小室，擦除膜表面細胞；沿小室邊緣將膜切下，膜下表面向上放入24孔培養(yǎng)板的孔中；甲醇∶冰醋酸（3∶1）固定10min，10%姬姆薩染液染色15～30m in；漂洗干凈后隨機選取6個視野計數(shù)細胞（呈紫色，200×）。

1.2.5 Western blotting實驗

取20μL蛋白質樣品，進行12%SDS-PAGE電泳；半干式電轉移法將凝膠上的蛋白質轉移到NC膜上，恒流1 mA/cm2，3 h；將NC膜在麗春紅中染色30 s，dH2O脫色至有清晰條帶，將右上角剪去以區(qū)分蛋白面；將NC膜用封閉液室溫封閉1.5 h；PBST洗膜2～3次，每次5～10min。加入一抗，4℃過夜或37℃1.5 h；PBST洗膜3～5次，每次5～10min。加入二抗，室溫孵育1h；PBST洗膜3～5次，每次5～10m in。在暗室（允許紅色光源）中，將NC膜蛋白面朝上放在保鮮膜上，向表面均勻滴加發(fā)光液，反應5min；將NC膜包裹在保鮮膜中，剪下一塊等大的X光膠片，放置夾片盒曝光0.5～5min（視條帶光強度而定）；取出X光膠片，在顯影劑中漂至條帶出現(xiàn)，放到停影液（5%冰醋酸）中停影1min，用流水沖洗1min后在定影劑中漂至背景部分透明，最后流水沖洗20m in固定影像。

1.2.6統(tǒng)計分析

結果以±S表示（n=3），采用Dunnett’s t-檢驗進行統(tǒng)計分析。*P＜0.05，**P＜0.01。

2 結果

2.1 rhKal蛋白的純化和鑒定

重組Kallistatin蛋白通過疏水作用和親和層析純化后，SDS-PAGE電泳后如圖1A所示。為了進一步確定純化后的蛋白，Western blotting對重組Kallistatin進行鑒定，實驗結果表明在50 ku左右發(fā)現(xiàn)明顯條帶（圖1B）。通過蛋白定量計算，1 L的發(fā)酵液里可以純化出20mg的重組Kallistatin蛋白。

圖1 rhKal蛋白的檢測和鑒定Fig 1 Characterization of expressed rhKalby SDS-PAGE andwestern blottingA為SDS-PAGE染色后考馬斯亮藍染色：1—肝素柱上樣穿透峰；2—0.1mol/L NaCl洗滌峰；3—0.5mol/L NaCl洗脫峰；M—蛋白Marker。B為Western-bloting檢測rhKal蛋白：1—野生型酵母發(fā)酵液；2—原液1；3—原液2。

2.2表達載體構建及驗證

提取總RNA后，通過PCR擴增獲得全長為1657 bp的目的基因，瓊脂糖電泳觀察分子量大小。如下圖所示(圖2)。

重組質粒GV 141-p65經(jīng)過PCR擴增后，0.8%瓊脂糖電泳可得到891 bp的目的條帶，證明p65已經(jīng)成功插入到GV141載體的多克隆位點中（圖3）。測序結果也表明目的片段插入方向正確，而且與GenBank中的序列（NM_021975）完全相同，證明重組質粒GV141-p65構建成功。

圖2 p65電泳圖Fig 2 p65 geneelectrophoresis

圖3 構建后p65 PCR鑒定Fig 3 The identification of p65 gene in the restructuring plasmid1—陰性對照（ddH2O）；2—陰性對照（空載自連對照組）；3—陽性對照（GAPDH）；4—Marker自上而下依次為5 kb，3 kb，2 kb，1.5 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp；5-12：RELA 1-8號轉化子。

2.3真核表達質粒p65cDNA瞬時轉染細胞

利用不同濃度配比的轉染復合物分別轉染HUVEC細胞后，Western blotting法檢測結果顯示，瞬時轉染p65cDNA可以顯著增加HUVEC細胞p65蛋白表達量。如圖4所示。

2.4過表達p65對rhKal抑制HUVEC細胞侵襲作用的影響

為了進一步探明p65是否逆轉rhKal對HUVEC細胞的侵襲抑制作用，我們在HUVEC細胞分別轉染p65cDNA及GV141空載體24 h后，加入80μg/m L rh-Kal繼續(xù)培養(yǎng)20 h，結果顯示，rhKal可以顯著抑制轉染空質粒載體細胞的侵襲，但過表達p65的實驗組細胞侵襲抑制率明顯低于空白載體對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。說明p65過表達可以逆轉rhKal對HUVEC細胞體外侵襲的抑制作用。如圖所示（圖5）。

圖4 轉染后p65蛋白的鑒定Fig 4 Identification of p65 protein in the restructuring plasm id（The p65 protein in HUVECwasdetected byWestern blotting after transfected w ith various concentration of transfectcomplex）（Western blotting法檢測不同濃度配比的轉染復合物轉染HUVEC細胞后胞內p65蛋白的表達）

圖5 過表達p65逆轉rhKal對HUVEC細胞侵襲抑制作用（p65表達載體和空質粒轉染后的細胞分別給予rhKal處理20 h）Fig 5 p65 gene reverse the inhibition of invasion for HUVEC cellafter treated w ith rhKal（The cells transfected w ith expression vectorsand empty vectorwere treated w ith rhKal for20 h）

2.5 過表達p65對rhKal對血管生成相關基因抑制作用的影響

本實驗將重點考察過表達p65對rhKal對血管生成相關基因抑制作用的影響。結果表明：rhKal可以顯著抑制轉染組和空白載體對照組MMP-9、MMP-2、VEGF蛋白的表達，但對p65過表達組蛋白表達抑制率顯著低于空載體對照組，具有統(tǒng)計學意義(圖6)。說明了p65過表達可以抵抗rhKal對NF-κB信號通路下游靶基因的抑制作用。

圖6 p65基逆轉rhKal對NF-κB信號通路下游靶基因抑制作用（p65表達載體和空質粒轉染后的細胞分別給予rhKal處理48 h）Fig 6 p65 gene reverses the inhibition of downstream genesof NF-κB signaling pathway by rhKal（The cells transfected w ith expression vectorsand empty vectorwere treatedw ith rhKal for48 h）

3 討論

NF-κB作為一種重要的核轉錄因子，可以上調許多與血管生成相關的因子的表達和功能，從而增強細胞的粘附、侵襲及血管生成［14］。尤其在腫瘤的血管生成中，NF-κB通過調節(jié)VEGF、b-FGF等血管生成調節(jié)因子的表達影響了腫瘤血管的發(fā)生、生成［15-17］。因此，NF-κB在血管的發(fā)生發(fā)展中的作用十分重要，其功能有待于進一步探索。

本研究首先成功表達了重組Kallistatin蛋白，同時構建了p65基因的表達載體，并通過脂質體轉染細胞，在細胞內過表達。轉染后的細胞，當給予rhKal蛋白后，p65cDNA轉染組和陰性對照組的侵襲力明顯被抑制，但轉染p65cDNA組細胞的侵襲力顯著高于轉染空載體質粒組，表明p65過表達可以對抗rhKal對HUVEC細胞體外侵襲作用。

p65不僅參與細胞凋亡過程，同時增強細胞穿越基質膜的趨化能力，促使VEGF、MMP-2、MMP-9等表達水平的上升。腫瘤細胞大量合成的VEGF，與VEGFR-2受體結合，促進血管生成。MMP-2、MMP-9過表達及有效激活可以加快腫瘤細胞介導的細胞外基質降解，促進內皮細胞的增殖、形成血管，MMP-2、MMP-9在各種實體瘤的發(fā)展進程中起到了重要的作用。為了說明以上p65逆轉rhKal對細胞侵襲抑制作用的分子機制，通過Western blotting實驗檢測了rhKal蛋白對轉染質粒載體細胞血管生成相關的蛋白，結果表明，p65胞內過表達明顯扭轉了rhKal對血管生成相關蛋白的抑制作用，同時證明了NF-κB信號通路在其抗血管生成活性中的重要意義。

以上實驗結果共同提示，rhKal蛋白具有顯著抑制血管生成的作用，并對NF-κB信號通路具有抑制作用，進而抑制了其下游基因產(chǎn)物的合成。p65的過表達逆轉了rhKal的血管生成抑制作用，其分子機制可能與調控NF-κB信號通路下游靶蛋白相關，同時也表明了p65在血管形成中的關鍵作用，具有明顯的臨床意義。

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NF-κB-p65 signalingmolecules involved in the inhibition by kallistatin on the invasion of human umbilical vein endothelial cells

HUANG Kai-fei1,2
（1.Xiamen Medicine Research Institute,Xiamen 361008；2.Xiamen Research Centerof the Southern Ocean,Xiamen 361008,China）

The effection and themolecularmechanism of recombinant Kallistatin(rhKal)on the anti-invasion of endothelial cell were studied by transfected NF-κB-p65 eukaryotic expression plasmid.HUVEC cellswere transfected by NF-κB-p65 eukaryotic expression vector which was constructed by genetic recombination technology.The expression of p65 protein was also detected by Western blotting.The invasion of transfected HUVEC cells was detected by Transwell chamber after treated w ith recombinant Kallistatin.The expression of invasion associated proteinwas detected byWestern blotting in endothelial cellswhich were transfected by NF-κB-p65 expression vector.The results showed that the expression of p65was significantly increased after transfected w ith NF-κB-p65 eukaryotic expression vector.Overexpression of p65 gene can reverse the inhibitory of invasion on HUVEC cells by rhKal. Overexpression of p65 gene can significantly increase downstream targetgenes of NF-κB signaling pathway after treated w ith rhKal. In conclusion,This study showed that the recombinant Kallistatin could inhibit HUVEC cell invasion in vitro,and itsmolecular mechanism may be related to the NF-κB signaling pathway.

kallistatin;HUVEC;NF-κB;invasion;signaling pathway

R363.1

A

2095－1736（2015）03－0004－05

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.004

2014-10-23；

2014-11-30

國家自然科學基金（81271691）；福建省衛(wèi)生廳青年項目（2013-2-110）；廈門市科技計劃項目（3502Z2013043）

黃愷飛，博士，主要從事藥物研發(fā)工作，E-mail:hkf5306@163.com。