沈云琳 鈕小玲 劉華杰 孫 蕾 匡新宇 黃文彥

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轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1通過(guò)Smad3調(diào)控補(bǔ)體應(yīng)答基因32轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制

沈云琳 鈕小玲 劉華杰 孫 蕾 匡新宇 黃文彥

目的：前期工作發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體應(yīng)答基因32(RGC-32)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程中Smad信號(hào)下游的關(guān)鍵調(diào)控分子。本研究擬進(jìn)一步明確TGF-β誘導(dǎo)腎小管EMT過(guò)程中RGC-32的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。 方法：體外培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞，利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)RGC-32啟動(dòng)子活性以確定Smad結(jié)合元件(SBE)是否為TGF-β誘導(dǎo)的RGC-32轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)；通過(guò)凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)明確與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子。 結(jié)果：(1)轉(zhuǎn)染野生型SBE片段的NRK-52E細(xì)胞熒光素酶活性明顯增高，而轉(zhuǎn)染突變的SBE片段的細(xì)胞無(wú)此表現(xiàn)，表明SBE是調(diào)控TGF-β誘導(dǎo)的RGC-32轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的關(guān)鍵位點(diǎn)。(2)合成32P標(biāo)記的包含SBE的寡核苷酸探針行EMSA可見(jiàn)TGF-β誘導(dǎo)的核蛋白與探針復(fù)合物生成，且加入包含SBE序列的競(jìng)爭(zhēng)片段可以抑制此核蛋白-探針復(fù)合物的形成，表明有蛋白與SBE結(jié)合并調(diào)控RGC-32的轉(zhuǎn)錄。(3)當(dāng)加入不同的Smad抗體行超遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Smad2和Smad3抗體可以和復(fù)合物相互作用，表明Smad2和Smad3可能是TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組成部分。(4)將Smad2和Smad3分別與p-1500RGCluc共同轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞，Smad3可以顯著增加RGC-32啟動(dòng)子活性，表明Smad3是TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組成部分，而不是Smad2。 結(jié)論：在TGF-β誘導(dǎo)腎小管EMT過(guò)程中，Smad3通過(guò)與RGC-32啟動(dòng)子區(qū)SBE結(jié)合，從而調(diào)控腎小管EMT過(guò)程。

補(bǔ)體應(yīng)答基因32 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

慢性腎臟病(CKD)一直是困擾全世界的難題，并嚴(yán)重威脅著人類健康。而腎小管間質(zhì)纖維化的程度與腎功能下降及CKD的進(jìn)程密切相關(guān)[1-3]。腎小管間質(zhì)纖維化的一個(gè)重要過(guò)程是上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[3-5]，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞的表型和功能丟失，上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白表達(dá)降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如N-鈣黏蛋白表達(dá)增強(qiáng)，并且獲得產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的能力，如膠原蛋白，纖維連接蛋白和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)增加[6-7]?，F(xiàn)已明確轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎小管EMT過(guò)程中起關(guān)鍵作用，而Smad蛋白是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中將信號(hào)由胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的中介分子[8]。然而，TGF-β誘導(dǎo)EMT的詳細(xì)分子調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體應(yīng)答基因32(RGC-32)作為TGF-β下游關(guān)鍵調(diào)控分子，參與了Smad信號(hào)通路介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT過(guò)程[9]。在TGF-β誘導(dǎo)的神經(jīng)嵴細(xì)胞平滑肌細(xì)胞分化中，Smad2和PEA3相互作用共同調(diào)節(jié)RGC-32的轉(zhuǎn)錄活性[10]。最近，Guo等[11]發(fā)現(xiàn)RGC-32必須與Smad3相互作用誘導(dǎo)人腎小管細(xì)胞EMT。但Smad3調(diào)控RGC-32的分子機(jī)制尚有待明確，為此，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)明確Smad3調(diào)控RGC-32轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)和試劑 大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)細(xì)胞株購(gòu)自ATCC(American Type Culture Collection)。細(xì)胞培養(yǎng)用含5%胎牛血清(GIBCO公司)Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)基(GIBCO公司)，37 ℃，95%空氣和5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將NRK-52E細(xì)胞按3×105/孔接種至六孔板中培養(yǎng)至80%融合，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6h，然后按實(shí)驗(yàn)需要予TGF-β1(5 ng/ml)刺激不同時(shí)間后收集細(xì)胞用于檢測(cè)。Smad1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad5抗體(兔多抗IgG)購(gòu)自Santa Cruz公司。Smad1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad5表達(dá)質(zhì)粒[12]及小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)均購(gòu)自于OriGene公司。TGF-β1來(lái)源于R&D Systems公司。

RGC-32啟動(dòng)子質(zhì)粒構(gòu)建 參照文獻(xiàn)10,即利用大鼠基因組DNA為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增RGC-32啟動(dòng)子DNA，并克隆至經(jīng)KpnI/Bgl II限制性內(nèi)切酶消化的含熒光素酶報(bào)告載體pGL3-basic(Promega)位點(diǎn)之間。pGL3-RGC-32(-1 500)所包含的調(diào)控區(qū)域位于RGC-32基因-1 500 bp至22 bp處。引物設(shè)計(jì)為：正向：5>A￣A￣A￣A￣G￣G￣T￣A￣C￣C￣G￣C￣A￣T￣G￣C￣C￣A￣C￣A￣T￣T￣C￣T￣G￣A￣C￣A￣C￣C<3；反向：5>A￣A￣A￣A￣A￣G￣A￣T￣C￣T￣C￣G￣C￣T￣A￣G￣C￣T￣A￣C￣T￣C￣G￣C￣G￣T￣G￣A￣G<3。pGL3-RGC-32(-1 500)突變質(zhì)粒采用Quikchange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit突變?cè)噭┖?Stratagene 公司)構(gòu)建，按試劑盒說(shuō)明書使用。Smad結(jié)合位點(diǎn)(SBE)序列為GTCTGGAC(-1 344 bp至-1 337 bp)突變?yōu)镚TtatGAC。

轉(zhuǎn)染和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將NRK-52E細(xì)胞以2×105/孔接種于12孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞80%融合，然后嚴(yán)格按照說(shuō)明書用LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所有樣品均設(shè)三個(gè)復(fù)孔。50%的轉(zhuǎn)染細(xì)胞觀察到有增強(qiáng)的綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。用熒光酶標(biāo)儀(BioTek instruments)檢測(cè)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次，結(jié)果取均值。

凝膠遷移率(EMSA)實(shí)驗(yàn) 首先提取NRK-52E細(xì)胞核蛋白，并測(cè)定濃度，然后標(biāo)記寡核苷酸探針。EMSA實(shí)驗(yàn)方法[10,13]如下：(1)結(jié)合反應(yīng)：將DNA結(jié)合反應(yīng)液15 μl和核蛋白提取物5 μg加入EP管內(nèi)冰浴15 min，加入已標(biāo)記的寡核苷酸雙鏈1 μl，25℃孵育30 min，加入4 μl加樣緩沖液，混勻后加樣。(2)特異性競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)：將DNA結(jié)合反應(yīng)液15 μl和核蛋白提取物5 μg加入EP管內(nèi)冰浴15 min，加入50倍未標(biāo)記的同樣的寡核苷酸雙鏈，25℃孵育20 min，加入已標(biāo)記的寡核苷酸雙鏈1 μl，25℃孵育30 min，加入4 μl加樣緩沖液，混勻后加樣。(3)超遷移實(shí)驗(yàn)：在結(jié)合反應(yīng)的基礎(chǔ)上再加入了1 μg Smad抗體，25℃孵育30 min，加入4 μl加樣緩沖液，混勻后加樣。蛋白-DNA 復(fù)合物用5%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離并行放射自顯影。突變探針的突變位點(diǎn)與之前突變熒光素酶質(zhì)粒的描述相同。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)值均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析兩組間比較采用ANOVA，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

TGF-β誘導(dǎo)RGC-32轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)的驗(yàn)證 SBE序列為GTCTGGAC，位于RGC-32基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1 344 bp至-1 337 bp。Huang等[10]報(bào)道，在神經(jīng)嵴細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化過(guò)程中，Smad2和PEA3共同作用調(diào)控RGC-32的轉(zhuǎn)錄，而SBE為RGC-32轉(zhuǎn)錄調(diào)控的結(jié)合位點(diǎn)。為了驗(yàn)證SBE是否在TGF-β誘導(dǎo)的腎小管上皮NRK-52E細(xì)胞RGC-32轉(zhuǎn)錄中同樣起調(diào)控作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了pGL3-RGC-32(-1 500)序列的部分核苷酸突變位點(diǎn)(圖1A)，然后將野生型和突變序列分別轉(zhuǎn)染至NRK-52E細(xì)胞，TGF-β1刺激后行熒光素酶活性測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變的SBE較野生型的熒光素酶活性明顯降低(圖1B)，表明SBE是TGF-β誘導(dǎo)的RGC-32轉(zhuǎn)錄的調(diào)控位點(diǎn)。

圖1 TGF-β誘導(dǎo)RGC-32轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)的驗(yàn)證SBE：Smad結(jié)合元件；TGF-β:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β;RGC-32:補(bǔ)體應(yīng)答基因32；A：RGC-32基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1 500 bp至-1 021 bp中包含SBE序列，野生型中下劃線部分為野生型SBE序列，而突變型中下劃線部分為突變的SBE序列，圖中數(shù)字為RGC-32基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游相應(yīng)堿基數(shù);B：將野生型和突變型轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞20h，然后細(xì)胞用TGF-β1(5 ng/ml)刺激18h后測(cè)定熒光素酶活性；*：與空白載體組比較，P<0.05

TGF-β誘導(dǎo)的核蛋白與SBE結(jié)合形成復(fù)合物 為了觀察TGF-β誘導(dǎo)的核蛋白與SBE相互作用，TGF-β1刺激NRK-52E細(xì)胞后，將核蛋白提取物與32P標(biāo)記的包含SBE的DNA寡核苷酸探針?lè)跤缓笮蠩MSA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激后30 min、2 h和6 h均存在TGF-β誘導(dǎo)的核蛋白與探針復(fù)合物生成(圖2A)。當(dāng)加入包含SBE的野生型DNA序列的競(jìng)爭(zhēng)片段可抑制此核蛋白-探針復(fù)合物的形成，而加入包含突變的SBE序列的競(jìng)爭(zhēng)片段則沒(méi)有此作用(圖2B)。

圖2 TGF-β誘導(dǎo)的核蛋白與SBE結(jié)合形成復(fù)合物TGF-β:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β;SBE:Smad結(jié)合元件；EMSA：凝膠遷移率試驗(yàn)；A:NRK-52E細(xì)胞用TGF-β(5 ng/ml)刺激后，其核蛋白提取物與32P標(biāo)記的SBE探針?lè)跤?，行EMSA結(jié)果;B:在核蛋白提取物與探針?lè)跤龝r(shí)，再加入包含野生型SBE的DNA片段或包含突變SBE的DNA片段作為競(jìng)爭(zhēng)物，行競(jìng)爭(zhēng)性EMSA實(shí)驗(yàn)

TGF-β誘導(dǎo)的與SBE結(jié)合的核蛋白 上述實(shí)驗(yàn)證明有TGF-β誘導(dǎo)的核蛋白與探針復(fù)合物生成，但仍不清楚蛋白質(zhì)性質(zhì)。于是我們?cè)谏鲜鰧?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上又分別加入不同的Smad抗體行超遷移實(shí)驗(yàn)，以了解Smad蛋白是否是TGF-β誘導(dǎo)的核蛋白-探針復(fù)合物的組成成分。通過(guò)超遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入Smad2或Smad3抗體的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物出現(xiàn)遷移延遲，但Smad1、Smad4 和Smad5抗體則沒(méi)有，表明Smad2和Smad3抗體可以和復(fù)合物相互作用，可能是TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組成成分。

圖3 TGF-β誘導(dǎo)的與SBE結(jié)合的核蛋白TGF-β:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β;SBE:Smad結(jié)合元件；EMSA：凝膠遷移率試驗(yàn)；在上述EMSA實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將核蛋白提取物與1.0 μg的Smad1(S1)、Smad2(S2)、Smad3(S3)、Smad4(S4)和Smad5(S5)放在冰上孵育0.5 h，用正常羊IgG作為對(duì)照(C)，然后行超遷移EMSA，觀察轉(zhuǎn)錄復(fù)合物有無(wú)遷移延遲

Smad3是TGF-β誘導(dǎo)RGC-32轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵分子 以上實(shí)驗(yàn)可以明確Smad2和(或)Smad3參與了TGF-β誘導(dǎo)RGC-32啟動(dòng)的復(fù)合物的組成，但是何種Smad是RGC-32轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的關(guān)鍵我們還不清楚。我們將pGL3-RGC-32(-1 500)質(zhì)粒和Smad1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad5表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到NRK-52E細(xì)胞，然后用TGF-β刺激。熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定顯示Smad1和Smad5對(duì)RGC-32轉(zhuǎn)錄活性沒(méi)有影響，但Smad2、Smad3和Smad4明顯上調(diào)RGC-32轉(zhuǎn)錄活性(圖4A)；而當(dāng)轉(zhuǎn)染不同的Smad siRNA后，轉(zhuǎn)染Smad3 siRNA的細(xì)胞RGC-32轉(zhuǎn)錄活性下降(圖4B)。將Smad2和Smad3表達(dá)質(zhì)粒分別或一起與RGC-32(-1 500)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Smad3后RGC-32的轉(zhuǎn)錄活性明顯上調(diào)(圖4C)。

圖4 Smad3是TGF-β誘導(dǎo)RGC-32轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵分子TGF-β:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β;RCG-32：補(bǔ)體應(yīng)答基因32；A:將RGC-32(-1 500)質(zhì)粒分別與Smad1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad5表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞20h，然后用TGF-β1(5 ng/ml)或TGF-β1(-)刺激18h，測(cè)定熒光素酶活性;B：將RGC-32(-1 500)質(zhì)粒分別與Smads siRNA (Smad-S)或?qū)φ?siCtrl)共同轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞48h，然后用TGF-β1(5 ng/ml)刺激18h，測(cè)定熒光素酶活性；C：將Smad2和Smad3表達(dá)質(zhì)粒分別或一起與RGC-32(-1 500)共同轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞20h，然后用TGF-β1(5 ng/ml)或TGF-β1(-)刺激18h，測(cè)定熒光素酶活性；*：與TGF-β1(-)組比較，P<0.05

討 論

TGF-β是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族中的主要成員，可以通過(guò)受體表面的受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的合成、創(chuàng)傷的修復(fù)、免疫功能等有重要的調(diào)節(jié)作用。在CKD中TGF-β是腎小子，TGF-β信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)分為Smad通路和非Smad通路。許多研究已經(jīng)揭示，TGF-β信號(hào)通路和Smad蛋白包括Smad2、Smad3、Smad4和Smad7，在腎臟纖[12，14-15]。TGF-β配體和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Ⅱ型受體結(jié)合并使其活化，活化的Ⅱ型受體募集并結(jié)合Ⅰ型受體，形成異源三聚體，使Ⅰ型受體磷酸化，活化的Ⅰ型受體特異性地與Smad蛋白相互作用，并將信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核[16]。

Smad蛋白可分為三類，分別為受體激活型Smad(Smad2和Smad3)、公共介體型Smad(Smad4)和抑制型Smad(Smad7)?；罨蘑裥褪荏w特異性地與受體激活型Smad2和Smad3相互作用使其活化，活化的Smad2/3還必須與公共介體型Smad4結(jié)合，Smad4協(xié)助活化的Smad2/3向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，并保持其轉(zhuǎn)錄活性，轉(zhuǎn)入核內(nèi)的Smad2/3通過(guò)與DNA結(jié)合或與其他轉(zhuǎn)錄因子共同作用而參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[8，16-17]。目前認(rèn)為Smad2/3是腎臟纖維化時(shí)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中必需的[18]，但是具體的機(jī)制仍不清楚。

RGC-32是一種重要的補(bǔ)體應(yīng)答基因，首次由Badea等[19]克隆，被發(fā)現(xiàn)存在于多種人類組織中，包括心、腦、肝、骨骼肌、胎盤、腎臟和胰腺。在人類某些腫瘤組織中，如結(jié)腸癌組織中，RGC-32表達(dá)明顯增高[20]。RGC-32還是周期素依賴激酶p34cdc2的調(diào)控分子，對(duì)細(xì)胞周期的激活起到重要作用[19,21]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)RGC-32作為TGF-β下游Smad信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控分子參與了TGF-β誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞EMT[9]。Verrecchia等[22]報(bào)道某些纖維發(fā)生基因(膠原蛋白)和EMT標(biāo)志物(α-SMA和E-cadherin)依賴于Smad3。最近，Guo等[11]研究發(fā)現(xiàn)，RGC-32必須與Smad3相互作用并調(diào)控成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、ECM和E-cadherin的表達(dá)。然而，Smad3如何調(diào)控RGC-32的分子機(jī)制仍不清楚。

本研究中，我們首次闡明在TGF-β誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞EMT過(guò)程中，Smad3調(diào)控RGC-32基因轉(zhuǎn)錄活性。首先，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)RGC-32基因啟動(dòng)子區(qū)上游的SBE序列(-1 344至-1 337 bp)為TGF-β誘導(dǎo)的核蛋白與RGC-32啟動(dòng)子相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。第二，通過(guò)特異性抗體的識(shí)別發(fā)現(xiàn)，Smad2和Smad3抗體可以與TGF-β誘導(dǎo)的與RGC-32啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物結(jié)合，因此Smad2/3可能是復(fù)合物的組成成分。由于Smad4是公共介體型Smad，其可協(xié)助活化的Smad2/3向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，其本身不是復(fù)合物的組成成分，故無(wú)超遷移條帶產(chǎn)生。第三，熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，Smad3明顯增強(qiáng)RGC-32啟動(dòng)子活性，但Smad1、Smad2和Smad5對(duì)RGC-32啟動(dòng)子活性沒(méi)有影響，故Smad3可能是TGF-β誘導(dǎo)的RGC-32啟動(dòng)子活化的關(guān)鍵分子。第四，將Smad2和Smad3表達(dá)質(zhì)粒分別或一起與p-1500RGCluc共同轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞，Smad3明顯增強(qiáng)RGC-32啟動(dòng)子活性，而Smad3 siRNA可抑制RGC32啟動(dòng)子活性。以上結(jié)果表明，在TGF-β誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞EMT過(guò)程中，Smad3可通過(guò)與RGC-32基因啟動(dòng)子區(qū)上游的SBE序列結(jié)合，對(duì)RGC-32的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起到重要作用。

圖5 TGF-β1通過(guò)Smad3調(diào)控RGC-32轉(zhuǎn)錄示意圖TGF-β：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β；RGC-32：補(bǔ)體應(yīng)答基因32；SBE：Smad結(jié)合元件；TβR：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體

現(xiàn)已明確，TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EMT過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，Smad2和Smad3在Smad4的協(xié)助下，將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核，從而調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄最終發(fā)揮其生物學(xué)作用[23]。前期工作表明RGC-32為Smads下游關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子在EMT過(guò)程中起重要作用[9]，但其確切分子調(diào)控機(jī)制不明。Huang等[10]研究發(fā)現(xiàn)RGC-32轉(zhuǎn)錄調(diào)控在TGF-β誘導(dǎo)神經(jīng)嵴細(xì)胞株Monc-1細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化過(guò)程中起著重要作用，且Smad2與PEA3相互作用調(diào)控RGC-32轉(zhuǎn)錄水平。本研究通過(guò)體外NRK-52E細(xì)胞，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導(dǎo)EMT過(guò)程中，TGF-β通過(guò)Smad3(并非Smad2或Smad4)與RGC-32基因上游SBE序列結(jié)合，從而調(diào)控RGC-32基因轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)合Guo等[11]新近研究發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導(dǎo)人近端腎小管細(xì)胞株(HPTC細(xì)胞)EMT過(guò)程中，Smad3必須與RGC-32蛋白結(jié)合由細(xì)胞漿跨膜進(jìn)入細(xì)胞核，從而調(diào)控α-SMA、ECM和E-鈣黏蛋白的表達(dá)。因此，我們推測(cè)RGC-32在TGF-β誘導(dǎo)EMT過(guò)程中的作用機(jī)制如圖5所示，即一方面TGF-β信號(hào)通過(guò)Smads轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Smad2/Smad3/Smad4形成復(fù)合物，RGC-32蛋白與Smad3結(jié)合該復(fù)合物轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而發(fā)揮作用；另一方面，Smad3與RGC-32啟動(dòng)子區(qū)SBE結(jié)合進(jìn)一步調(diào)控RGC-32轉(zhuǎn)錄活性。

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(本文編輯 加 則 青 松)

The molecular mechanism of TGF-β1 regulating trascription of response gene to complement 32 through Smad3 pathways

SHENYunlin,NIUXiaoling,LIUHuajie,SUNLei,KUANGXinyu,HUANGWenyan

DepartmentofNephrologyandRheumatology,ShanghaiChildren’sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200062,ChinaCorrespondingauthor:HUANGWenyan(E-mail:hwy65@hotmail.com)

Objective：To research the molecular mechanisms of Smad3 regulation RGC-32 transcription in TGF-β1 induced Epithelial-mesenchymal Transition on NRK-52E Cells. Methodology：The NRK-52E cells were cultured and transiently transfected in vitro. Luciferase assays were performed to determine whether the SBE plays roles in TGF-β1-induced RGC-32 promoter activation. Electrophoretic mo to determine which proteins are the formations of TGF-β1-induced nuclear complex. Results：(1) The Smad biGF-β1-induced RGC-32 transcriptional activation. The SBE mutation structure significantly inhibited RGC-32 promoter activity. (2) The SBE was essential for the interaction of TGF-β1-induced nuclear proteins with RGC-32 promoter. It was found that the TGF-β-induced interaction between nuclear factors and RGC-32 promoter in EMSA, and the wild-type DNA containing SBE site as competitors abolished the formation of TGF-β-induced complex. (3) Smad2/3 was the composition of TGF-β1-inducible transcription factor complex bound to RGC-32 promoter as recognized by their specific antibodies in EMSA. (4) Smad2 and Smad3 expression plasmids were co-transfected individually into NRK-52E cells, and then Smad3 significantly increased the RGC-32 promoter activity. This suggests that Smad3, but not Smad2, be presented in the TGF-β1-inducible complex formed by nuclear proteins with RGC-32 promoter. Conclusion：These results illuminated that Smad3 may be combined with RGC-32 promoter region SBE and play an important role in transcriptional regulation in TGF-β-induced renal tubular EMT of NRK-52E cells.

response gene to complement 32 epithelial-mesenchymal transition transforming growth factor-β transcriptional regulation

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81370813)；上海市科委(114119a1700)；上海市衛(wèi)生局優(yōu)秀學(xué)科帶頭人項(xiàng)目(XBR2011010)

上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院腎臟風(fēng)濕科(上海,200062)

黃文彥(E-mail：hwy65@hotmail.com)

2015-02-26

? 2015年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有