王 艷 韓正斌 邵樂(lè)平 欒 健 劉 軍

?

10例Gitelman綜合征患者SLC12A3基因的檢測(cè)

王 艷1韓正斌1邵樂(lè)平1欒 健2劉 軍3

目的：對(duì)青島地區(qū)10例可疑Gitelman綜合征患者致病基因SLC12A3和CLCNKB的突變特點(diǎn)進(jìn)行分析。 方法：通過(guò)直接測(cè)序的方法進(jìn)行突變分析。選取100例健康人作為對(duì)照。 結(jié)果：共確定SLC12A3基因9個(gè)突變位點(diǎn)，其中3個(gè)為新突變位點(diǎn)，包括2個(gè)錯(cuò)義突變：Glu429Lys,Ala264Gly；1個(gè)缺失突變：1740delC。6個(gè)已報(bào)道過(guò)的突變，其中包括5個(gè)錯(cuò)義突變：Cys430Gly，Asp486Asn，Ser283Tyr，Thr163Met,Arg913Gln；1個(gè)缺失突變：2877_2878delAC。10例患者中8例攜帶Ala264Gly純合突變,4例攜帶Asp486Asn雜合突變，大部分患者為復(fù)合雜合突變。 結(jié)論：本研究共發(fā)現(xiàn)9個(gè)突變位點(diǎn)，其中3個(gè)新突變位點(diǎn)。

Gitelman綜合征 突變 SLC12A3基因

Gitelman綜合征(GS)是一種常染色體隱性遺傳性疾病(OMIN 263800)，為腎單位遠(yuǎn)曲小管重吸收Na-Cl障礙造成的原發(fā)腎性失鹽性疾病。GS是由SLC12A3 基因失活突變導(dǎo)致，該基因其編碼噻嗪類利尿劑敏感的Na-Cl共同轉(zhuǎn)運(yùn)子(NCCT)。SLC12A3基因(MIM 600968)位于染色體16q13,大小約55 kb，包括26個(gè)外顯子。NCCT由1 021個(gè)或1 030個(gè)氨基酸殘基組成，包括12個(gè)跨膜部分(S)，一個(gè)較大的細(xì)胞內(nèi)N端和一個(gè)疏水的C端[1]。以往GS被認(rèn)為是Bartter綜合征(BS)的一個(gè)亞型，且經(jīng)典型BS同GS表型存在重疊和交叉，故臨床上很容易混淆。同時(shí)，研究表明，少數(shù)疑似為GS的患者是由CLCNKB基因突變引起[2]，存在遺傳異質(zhì)性，因此本研究分析對(duì)10例GS 患者的SLC12A3和CLCNKB基因，以從分子水平提高對(duì)該病的認(rèn)識(shí)。

對(duì)象和方法

研究對(duì)象 本研究組選取2010年7月至2013年7月青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科住院治療的10例疑似GS患者，其中男性7例，女性3例，平均年齡(32±13)歲，分別來(lái)自9個(gè)不同的漢族家系。診斷標(biāo)準(zhǔn)：慢性持續(xù)性低血鉀(<3.5 mmol/L)、低血鎂(<0.65 mmol/L)和低尿鈣(24h尿鈣/尿肌酐<0.1 mmol/mmol)。所有患者均無(wú)長(zhǎng)期服用緩瀉劑、利尿劑及藥物成癮史。選取100例非相關(guān)的健康者作為對(duì)照組，評(píng)估本研究發(fā)現(xiàn)的新突變位點(diǎn)。本研究獲得青島大學(xué)醫(yī)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有參與者均簽署知情同意書(shū)。

研究方法

外周血基因組DNA提取 采用試劑盒(GenElute，Sigma NA2010)抽取患者及其他家庭成員外周血基因組DNA。

引物設(shè)計(jì) SLCl2A3基因序列來(lái)自Genbank(NC_000016)，采用Primier 5軟件自行設(shè)計(jì)23對(duì)引物擴(kuò)增SLCl2A3基因全部26個(gè)外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子序列[3]。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。根據(jù)Simon等[4]的研究設(shè)計(jì)19對(duì)引物擴(kuò)增CLCNKB基因全部19個(gè)外顯子。

PCR產(chǎn)物擴(kuò)增 在25 μl的反應(yīng)體系中包含0.2 mmol/L dNTP、0.03 U/ml Taq 聚合酶(DRR006B，大連寶生)、2.0 mmol/L MgCl2、2.5 ml 10X PCR Mg2+free Buffer(Takara)、30 ng基因組DNA以及各1 mmol/L上下游引物。在梯度PCR儀上95℃變性45s，59℃～71℃退火45s，72℃延伸45s，33個(gè)循環(huán)后72℃最后延伸10 min。

PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序 采用磷酸蝦堿酶和外切酶Ⅰ純化PCR產(chǎn)物，ABI Prism 3700 DNA分析儀(美國(guó)Applied Biosystems)進(jìn)行單向或雙向測(cè)序。

DNA測(cè)序結(jié)果分析 采用Vector NTI11．0與正常序列比對(duì)。

為預(yù)測(cè)可能發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變的致病性 我們引入了錯(cuò)義突變致病性的評(píng)分系統(tǒng)[5-6],并采用Vector NTI advance 10-Align對(duì)8種SLC12A3和CLCNKB基因編碼的同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì)。

結(jié) 果

臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 10例患者中，9例表現(xiàn)骨骼肌功能障礙(肌肉無(wú)力、麻木、搐搦、癱瘓)，1例無(wú)癥狀，在查體中發(fā)現(xiàn)低血鉀。5例患者血漿醛固酮水平升高，7例血漿腎素活性升高，10例有低尿鈣(24h尿鈣/尿肌酐<0.1 mmol/mmol)(表1)。

表1 10例患者的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查

基因分析 通過(guò)直接測(cè)序，10例患者中共發(fā)現(xiàn)SLCl2A3基因的9個(gè)突變位點(diǎn)可能與GS相關(guān)，其中包括7個(gè)錯(cuò)義突變，2個(gè)移碼突變。在對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)此9個(gè)突變。全部突變位點(diǎn)中，6個(gè)突變位點(diǎn)(Cys430Gly， Asp486Asn，Ser283Tyr，Thr163Met,Arg913Gln， 2877_2878delAC)已有報(bào)道[6-7]；經(jīng)檢索人類基因突變庫(kù)(HGMD)和最近文獻(xiàn)，3個(gè)突變位點(diǎn)被證實(shí)是本研究發(fā)現(xiàn)的新突變，其中包括2個(gè)錯(cuò)義突變：Glu429Lys，Ala264Gly；1個(gè)缺失突變：1740delC(圖1)。所有突變點(diǎn)在NCCT中的位置見(jiàn)圖2。所有患者均未發(fā)現(xiàn)CLCNKB基因的突變。

圖1 新發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)基因圖譜A：Ala264Gly的野生型；B：Ala264Gly的突變型；C：Glu429Lys的野生型；D：Glu429Lys的突變型；E：1740delC的野生型；F：1740delC的突變型；Ala264Gly中堿基G突變?yōu)锳，編碼的氨基酸相應(yīng)的由Ala變成Gly；Glu429Lys中堿基G突變?yōu)锳，編碼的氨基酸相應(yīng)的由Glu變成Lys；而1740delC在1740為缺失堿基C，引起框移突變

圖2 突變點(diǎn)在Na-Cl共同轉(zhuǎn)運(yùn)子中的位置示意圖

除1例患者僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)突變位點(diǎn)外,其余9例患者均存在≥2個(gè)突變點(diǎn)，包括純合突變3個(gè)，雜合突變6個(gè)，攜帶純合突變患者的父母無(wú)近親婚配，所有攜帶雜合型突變患者非近親婚配子女。8例患者發(fā)現(xiàn)純合突變Ala264Gly。4例患者攜帶Asp486Asn雜合突變。家系A(chǔ)中，患者6攜帶有雜合突變Glu429Lys和1740delC及純合突變Ala264Gly，但其子例7僅遺傳了父親的雜合突變1740delC和純合突變Ala264Gly，未遺傳雜合突變Glu429Lys。1740delC提前終止于第610位密碼子。例5發(fā)現(xiàn)的2877_2878delAC突變位點(diǎn)已有報(bào)道[7-8]，但其報(bào)道的為雜合突變，本研究發(fā)現(xiàn)的為純合突變，較為少見(jiàn)(表2)。

對(duì)本研究發(fā)現(xiàn)的7個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)的致病性分析，P.C430G、p.S283Y和p.T163M存在高致病可能，p.264G和p.D486N中度致病可能，p.E429K和p.R913Q可能不致病(表3)。同源序列比較(Homosapiens (NP_000330.2)、Bos taurus(NP_0￣0￣1￣1￣9￣3￣1￣0￣7.1)、Canis lupus familiaris(XP_535292.3)、Danio rerio(NP_001038545.1)、Gallus gallus(XP_0￣0￣4￣9￣4￣4￣1￣8￣9.1)、Mus musculus(NP_001192240.1)、Rattus norvegicus(NP_062218.3),和Xenopus(Silurana)tropicalis(XP_004913583.1))，顯示NCCT第163、264、430、486位氨基酸在8種生物種均高度保守，283和429分別在6和5種生物中保守。而913位的Arg在其他3種生物中是Gln(圖4)。

表2 10例患者的突變位點(diǎn)

圖3 家系A(chǔ)遺傳圖譜

表3 錯(cuò)義突變致病性評(píng)分

Grantham Matrix評(píng)分(括號(hào)內(nèi))：<60：1分; 61～78.3：2分; 78.4～93.4：3分;>93.4：4分;任何半胱氨酸的替代=5分；多重序列比對(duì)評(píng)分(MSA評(píng)分)(括號(hào)內(nèi))：8種生物全部保守=5;6～7=4;4～5=3;1～3=1;總分≥8：高致病可能;6～8：中度致病可能;≤5：可能非致病(例如多態(tài)性)

圖4 錯(cuò)義突變多重序列比對(duì)評(píng)分(MSA)圖

討 論

GS以低血鉀、低血鎂、低尿鈣、代謝性堿中毒、高腎素-血管緊張素-醛固酮及正?；蚱偷难獕簽樘攸c(diǎn)。其中低尿鈣、低血鎂在臨床上被認(rèn)為是GS和BS的主要區(qū)別點(diǎn)，但這并非完全可靠[9]。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，突變基因的發(fā)現(xiàn)，給GS的確診提供了更為可靠的證據(jù)。自1996年Simon等[4]從分子角度第一次確認(rèn)GS的突變基因(SLC12A3)不同于BS(CLCNKB)以來(lái)，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有100多個(gè)突變基因與GS有關(guān)[10-11]。通過(guò)GS致病基因的研究，不僅可以加深對(duì)該病的臨床認(rèn)識(shí)及病理生理和分子發(fā)病機(jī)制的理解，同時(shí)也可以為該病的診斷提供了更為可靠的依據(jù)。因此，本研究通過(guò)分析10例GS綜合征患者的基因突變情況，以期進(jìn)一步提高對(duì)該病的認(rèn)識(shí)和豐富SLC12A3突變基因庫(kù)。

本研究通過(guò)直接測(cè)序，在10例患者中共發(fā)現(xiàn)SLC12A3基因9個(gè)突變位點(diǎn)可能與GS有關(guān)，其中3個(gè)位于NCCT胞外段(163、429、430)，4個(gè)位于胞內(nèi)段(283、486、913,2877)，2個(gè)位于跨膜區(qū)(264，1740)。本研究未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)域分布上與疾病之間的關(guān)系，與國(guó)外文獻(xiàn)一致[12]。在此次發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變中，MSA圖示NCCT第163、264、430、486位氨基酸在8種生物種均高度保守，提示Thr163Met、Ala264Gly、Cys430Gly、Asp486Asn可能均是很有意義的突變；NCCT第283位氨基酸雖然僅在6種物種上同源，但Ser283Tyr錯(cuò)義突變致病性總評(píng)分8分，仍提示高度致病性；對(duì)于Arg913Gln和Glu429Lys，雖錯(cuò)義突變致病性總評(píng)分均為4分，且第913位的Arg在其他3種生物中是Gln，因此Arg913Gln和Glu429Lys很可能是多態(tài)性突變。而1740delC和2877_2878delAC均引起框移突變，產(chǎn)生截短的或異常的翻譯產(chǎn)物，對(duì)NCCT的結(jié)構(gòu)和功能影響較大，很可能是很有意義的致病性突變。然而，值得指出的是，采用爪蛙卵母細(xì)胞、cos-7細(xì)胞等生物體，選取以上突變位點(diǎn)，采用蛋白標(biāo)簽、定點(diǎn)突變等技術(shù)，進(jìn)行功能表達(dá)研究較錯(cuò)義突變致病性的評(píng)分系統(tǒng)及基因編碼的同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì)更為準(zhǔn)確[12]。

本研究大多數(shù)患者就診主訴為骨骼肌功能障礙癥狀，如乏力、抽搐甚至癱瘓。但例3卻無(wú)明顯癥狀，僅在查體中發(fā)現(xiàn)低鉀。這提示我們，并非所有GS患者均有臨床癥狀。有文獻(xiàn)曾報(bào)道一個(gè)家系多人攜帶SLC12A3基因中的相同突變，但臨床表現(xiàn)迥異[13-14]。國(guó)內(nèi)學(xué)者亦曾對(duì)GS的高頻突變基因型和表型的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果為無(wú)明顯相關(guān)性[14]。因此，典型GS表型的出現(xiàn)，可能是多個(gè)突變基因協(xié)同作用的結(jié)果；同時(shí)，后天的環(huán)境、飲食的影響亦不能忽視。10例GS患者，女性僅3例，遠(yuǎn)少于男性。歐洲和臺(tái)灣學(xué)者均發(fā)現(xiàn)[15-16]，男性GS患者較女性癥狀更重，就診率高；同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)[17]，正常雌性SD大鼠腎臟表達(dá)的NCCT受體的密度是雄性大鼠的2倍，切除卵巢能顯著減少NCCT受體的密度。以上證據(jù)均提示性別是導(dǎo)致表型多樣性的因素之一。

有研究顯示，Thr60Met在正常亞洲人群中發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)的突變頻率為0.5%～0.8%[15]，而在GS患者中的突變頻率高達(dá)33%，推測(cè)Thr60Met可能是亞洲人群特有的高發(fā)突變。但本研究卻未發(fā)現(xiàn)該突變點(diǎn)，而突變點(diǎn)Ala264Gly的頻率卻高達(dá)38%(8/21),考慮可能原因?yàn)楸狙芯克婕皹颖玖枯^少,與相對(duì)較大的樣本比較，結(jié)果存在偏差。

既往文獻(xiàn)報(bào)道，高達(dá)40%左右的GS患者僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)突變位點(diǎn)[16],可能原因有：(1)突變位點(diǎn)可能位于SLCl2 A3基因的調(diào)節(jié)序列或內(nèi)含子的深部，而上述兩部分平時(shí)不予測(cè)序分析；(2)包含1個(gè)或多個(gè)外顯子的基因片斷重排后難以通過(guò)單個(gè)外顯子分析的方法確定；(3)突變可能位于其他調(diào)節(jié)NCCT功能的基因，如WNKl，WNK4等[15]。雖然未針對(duì)上述可能原因在基因測(cè)序方面做相應(yīng)改進(jìn)，但本研究中僅10%(1/10)的患者存在一個(gè)突變位點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道，考慮可能原因?yàn)楸狙芯繕颖玖枯^ 2個(gè)突 S為一種常染色體隱性遺傳病，根據(jù)遺傳定律，除非是近親結(jié)婚或者婚配同樣的患者，一個(gè)家系連續(xù)兩代均出現(xiàn)患者極為罕見(jiàn)[18]。但本研究中，家系A(chǔ)中父子2人均為GS患者。追問(wèn)婚姻史，例7父母并非近親結(jié)婚。由此推測(cè)，例6的配偶有可能也是GS患者，因無(wú)癥狀而未就診；而例7患者攜帶的純合突變Ala264Gly其中之一即來(lái)自其母親。因此，這似乎從一定程度上說(shuō)明，GS并非罕見(jiàn)病，其發(fā)病率可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于既往文獻(xiàn)報(bào)道。同時(shí)，Ala264Gly可能確為本區(qū)域GS的熱點(diǎn)突變。

綜上所述，通過(guò)直接測(cè)序，我們共發(fā)現(xiàn)GS致病基因SLCl2A3的9個(gè)突變位點(diǎn)，其中3個(gè)為新突變位點(diǎn)；典型GS表型的出現(xiàn)，可能是多個(gè)突變基因協(xié)同作用的結(jié)果；通過(guò)GS致病基因的研究，不僅可以加深對(duì)該病的分子發(fā)病機(jī)制的理解，同時(shí)也可以為該病的診斷提供更為可靠的依據(jù)。

1 Galli-Tsinopoulou A,Patseadou M,Hatzidimitriou A,et al.Gitelman syndrome:first report of genetically established diagnosis in Greece.Hippokratia,2010,14(1):42-44.

2 Zelikovic I,Szargel R,Hawash A,et al．A novel mutation in the chloride channel gene， CLCNKB， as a cause of Gitelman and Bartter syndromes.Kidney Int,2003,63(1):24-32．

3 邵樂(lè)平，任紅，王偉銘，等.Gitelman綜合征SLCl2A3基因突變研究.中華腎臟病雜志,2007,23(6):351-356.

4 Simon DB,Bindra RS,Mansfield TA,et al.Mutations in the chloride channel gene,CLCNKB,cause Bartter’s syndrome type Ⅲ.Nat Genet,1997,17(2):171-178.

5 Grantham R.Amino acid difference formula to help explain protein evolution. Science,1974,185(4154):862-864.

6 Abkevich V,Zharkikh A,Deffenbaugh AM, et al.Analysis of missense variation in human BRCA1 in the context of interspecific sequence variation.J Med Genet,2004,41(7):492-507.

7 Shao L,Ren H,Wang W,et al.Novel SLC12A3 mutations in Chinese patients with Gitelman syndrome.Nephrol Physiol,2008,108(3):29-36.

8 Hsu YJ,Yang SS,Chu NF,et al.Heterozygous mutations of the sodium chloride cotransporter in Chinese children:prevalence and association with blood pressure.Nephrol Dial Transplant,2009,24(4):1170-1175.

9 Knoers NV,Levtchenko EN.Gitelman syndrome.Orphanet J Rare Dis,2008,3:22.

10 Hsu YJ,Yang SS,Chu NF,et al.Heterozygous mutations of the sodium chloride cotransporter in Chinese children:prevalence and association with blood pressure.Nephrol Dial Transplant,2009,24(4):1170-1175.

11 Reissinger A,Ludwig M,Utsch B,et al.Novel NCCT gene mutations as a cause of Gitelman syndrome and a systematic review of mutant and polymorphic NCCT alleles.Kidney Blood Press Res,2002,25(6):354-362.

12 Miao Z,Gao Y,Bindels RJ,et al.Coexistence of normotensive primary aldosteronism in two patients with Gitelman′s syndrome and novel thiazide-sensitive Na-Cl cotransporter mutations.Eur J Endocrinol,2009,161(2):275-283.

13 Ueda K,Makita N,Kawarazaki H,et al.A novel compound heterozygous mutation of Gitelman′s syndrome in Japan,as diagnosed by an extraordinary response of the fractional excretion rate of chloride in the trichlormethiazide loading test.Intern Med,2012,51(12):1549-1553.

14 秦嶺，邵樂(lè)平，任紅，等.中國(guó)人Gitelman綜合征高發(fā)突變的基因型和表型特征.腎臟病與透析腎移植雜志,2008,17(8):331-334.

15 Lin SH,Shiang JC,Huang CC,et al.Phenotype and genotype analysis in Chinese patients with Gitelman′s syndrome.J Clin Endocrinol Metab,2005,90(5):2500-2507.

16 Riveira-Munoz E,Chang Q,Bindels RJ,et al．Gitelman syndrome：towards genotype-phenotype correlations? Pediatr Nephrol,2007,22(3):326-332.

17 Chen Z,Vaughn DA,Fanestil DD.Influence of gender on renal thiazide diuretic receptor density and response.J Am Sec Nephrol,1994,5(4):1112-1119.

18 Yagi H,Yahata K,Usui T,et al.Inheritance of an autosomal recessive disorder,Gitelman′s syndrome,across two generations in one family.Intern Med,2011,50(11):1211-1214.

(本文編輯 春 江)

Analysis of SlCl2A3 gene mutation in patients with Gitelman syndrome

WANGYan1,HANZhengbin1,SHAOLeping2，LUANJian1,LIUJun3

DepartmentofNephrology,theAffiliatedHospitalofMedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266003,China2DepartmentofEndocrinology,theQingdaoMunicipalHospital(Group),Qingdao266003,China3DepartmentofNephrology,theQingdaoNO.8people’shospital,Qingdao266003,China

Objective：To identify the new mutations of SLCl2A3 and CLCNKB gene in patients with suspicious Gitelman syndrome, and Analyze the characteristics of the genetic mutations． Methodology：Ten patients hospitalized in the affiliated hospital of Qingdao university with the clinical and biochemical features of Gitelman syndrome were analyzed by direct sequencing of SLCl2A3 gene．One hundred unrelated normal subjects were selected to evaluate all the mutations found by this study and make sure that they are new mutations through the Human Gene Mutation date base． Results：Nine mutations were identified in SLCl2A3 gene of 10 patients with Gitelman syndrome. Four were novel variants, including 2 missense mutations：Glu429Lys, Ala264Gly, and one deletions：1740delC. Six were recurrent ones including 5 missense mutations: Cys430Gly, Asp486Asn, Ser283Tyr, Thr163Met, Arg913Gln; and one deletion: 2877_2878delAC. The Homozygous mutation Ala264Gly was found in 8 of 10 patients while the heterozygous mutation Asp486Asn in 4 of 10．The majority of the patients were compound heterozygous. Conclusion：Nine mutations were identified in SLCl2A3 gene of 10 patients with Gitelman syndrome, and 3 were novel variants.

Gitelman syndrome Mutation SLCl2A3 gene

山東省科技廳基金(2011GSF11832)

1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科(青島，266003)；2青島市市立醫(yī)院(集團(tuán))內(nèi)分泌科；3青島市第八人民醫(yī)院腎內(nèi)科

? 2015年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有

2015-03-17