嚴(yán)國強(qiáng)，陳春香，陳芳輝，高 艷，儲佳佳，李 騰，黃起壬

(1.江西省基礎(chǔ)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.南昌大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，江西 南昌 330006)

PPARγ介導(dǎo)卡托普利改善高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的作用

嚴(yán)國強(qiáng)1,2，陳春香1,2，陳芳輝1,2，高 艷1,2，儲佳佳1,2，李 騰1,2，黃起壬1,2

(1.江西省基礎(chǔ)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.南昌大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，江西 南昌 330006)

目的 研究卡托普利(captopril，Cap)對高糖(high glucose，HG，33 mmol·L-1)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelium cells，HUVECs)胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的作用及機(jī)制。方法 首先觀察Cap對HG(33 mmol·L-1)誘導(dǎo)的HUVECs IR的改善作用。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組，即正常對照(Control)組、IR組、IR+CapⅠ(1×10-6mol·L-1)組、IR+CapⅡ(1×10-5mol·L-1)組、IR+CapⅢ(1×10-4mol·L-1)組。其次證實(shí)Cap改善HG(33 mmol·L-1)誘導(dǎo)HUVECs IR的作用是由PPARγ介導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為6組，即Control組、IR組、IR+Cap(1×10-5mol·L-1)組、PPARγ抑制劑GW9662(PI，1.0 μmol·L-1)組、IR+PPARγ抑制劑(IR+PI，1.0 μmol·L-1)組、IR+Cap+PPARγ抑制劑(IR+Cap+PI，1.0 μmol·L-1)組，除Control組和PI組外，所有各組先用含33 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)48 h，Cap各組再加不同濃度的Cap處理4 h，最后胰島素(100 nmol·L-1)處理30 min，抑制劑組再加抑制劑(1.0 μmol·L-1)處理1 h，最后進(jìn)行指標(biāo)檢測。結(jié)果 IR組NO水平明顯降低、ET-1含量明顯升高，提示細(xì)胞已產(chǎn)生IR，但PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)水平與Control組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Cap呈濃度依賴性逆轉(zhuǎn)HG誘導(dǎo)NO和ET-1水平的改變，明顯增加磷酸化PPARγ(P-PPARγ)水平，說明其可明顯改善HG誘導(dǎo)的IR，但對PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)水平無明顯影響(vsIR，P>0.05)；加PI處理后，Cap改善IR的作用完全取消，提示Cap改善IR的作用是由PPARγ介導(dǎo)。結(jié)論 Cap可通過PPARγ介導(dǎo)改善高糖所致血管內(nèi)皮細(xì)胞IR，其機(jī)制可能與PPARγ表達(dá)水平無關(guān)，而與PPARγ激活有關(guān)。

卡托普利；高糖；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；胰島素抵抗；PPARγ；NO；ET-1

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，血管內(nèi)皮胰島素抵抗是糖尿病發(fā)生血管并發(fā)癥的始動環(huán)節(jié)，是滋生多種代謝相關(guān)疾病的共同“土壤”[1-2]。但目前，國內(nèi)外對其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。因此,闡明血管內(nèi)皮IR發(fā)生的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)糖尿病防治藥物新的分子作用靶點(diǎn)及開發(fā)新的防治藥物，對于降低糖尿病患者心腦血管事件發(fā)生，改善患者生存質(zhì)量具有重要意義。PPARγ 是過氧化物增殖酶體激活受體超家族(PPARs) 的成員之一，是體內(nèi)糖代謝和脂肪細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，是胰島素增敏劑噻唑烷二酮類的靶標(biāo)[3]，能改善血管內(nèi)皮細(xì)胞對胰島素的敏感性，機(jī)制可能與其激活了PPARγ依賴的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。另外，PPARγ也能在配體依賴方式下通過抑制其他轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB及活化劑蛋白-1家族，從而直接地抑制促炎癥基因的表達(dá)[4-5]。研究證實(shí)前列腺素衍生物如15-脫氧前列腺素J2(15-d-PGJ2)是PPARγ的天然激動劑[6-7]。

卡托普利(captopril，Cap)是第一代的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，臨床廣泛用于合并了糖尿病的高血壓或心衰患者的治療。有研究證實(shí)，Cap可通過增加前列腺素衍生物、緩激肽(bradykinin, BK)水平來改善IR[8-9]，那么，它能不能通過直接改變PPARγ的表達(dá)或活性來改善IR，目前相關(guān)報(bào)道甚少，因此，本實(shí)驗(yàn)探討卡托普利改善內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的機(jī)制，為尋找糖尿病血管病變防治的分子靶點(diǎn)拓展新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及血清培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)用HUVECs株購自美國ATCC(Catalog No: CRL-1730)；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco BRL公司。

1.2 藥品及試劑NO檢測試劑盒購自Beyotime Institute of Biotechnology；ET-1試劑盒購自上海RD生物公司；卡托普利購自上海普康公司；PPARγ抑制劑(GW9662)購自美國Sigma；PPARγ多克隆抗體購自美國Cell Signaling；PPARγ磷酸化抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz；TRIzol 試劑購自Invitrogen公司；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、Oligo(dT)15、Taq酶均購自Promega Corporation；引物購自上海捷瑞生物公司；其它各種化學(xué)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法

1.3.1 Cap對HG誘導(dǎo)的HUVECs IR的改善作用 將HUVECs均勻接種在六孔培養(yǎng)板上，隨機(jī)分為5組，即Control組、IR組、IR+CapⅠ(1×10-6mol·L-1)組、IR+CapⅡ(1×10-5mol·L-1)組、IR+ CapⅢ(1×10-4mol·L-1)組。除Control組(5.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)48 h)外，所有各組先用含33 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)48 h，Cap各組再加不同濃度的Cap處理4 h，最后胰島素(100 nmol·L-1)處理30 min，收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞，分別進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.3.2 Cap改善HG誘導(dǎo)HUVECs IR的作用是由PPARγ介導(dǎo) 將HUVECs均勻接種在六孔培養(yǎng)板上，隨機(jī)分為6組，即Control組、IR組、IR+CapⅡ(1.0×10-5mol·L-1)組、PPARγ抑制劑GW9662(PI，1.0 μmol·L-1)組、IR+PPARγ抑制劑(IR+PI，1.0 μmol·L-1)組、IR+Cap(1.0×10-5mol·L-1)+ PPARγ抑制劑(IR+Cap+PI，1.0 μmol·L-1)組，除Control組和PI組(5.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)48 h)外，所有各組先用含33 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)48 h，Cap各組再加不同濃度的Cap處理4 h，最后胰島素(100 nmol·L-1)處理30 min，抑制劑組再加抑制劑GW9662(1.0 μmol·L-1)處理1 h，收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞，分別進(jìn)行以下指標(biāo)檢測。

1.4 HUVECs中NO、ET-1水平的檢測(a) 參照碧云天生物技術(shù)研究所一氧化氮檢測試劑盒的使用說明，先做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)各組吸光度，計(jì)算出各組NO的含量。(b) 參照人內(nèi)皮素(ET)酶聯(lián)免疫試劑盒的使用說明，先做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)各組吸光度，計(jì)算出各組ET-1的含量。

1.5 Western blot檢測HUVECs內(nèi)PPARγ、P-PPARγ蛋白的表達(dá)細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)因素處理后，經(jīng)PBS清洗后，用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，蛋白濃度用BCA試劑盒進(jìn)行測定，細(xì)胞裂解物溶于上樣緩沖溶液煮沸后經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分離，并電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，取出后將膜放入質(zhì)量濃度均為50 g·L-1的脫脂牛奶或者BSA中封閉2 h，再用TBST洗膜3次，每次15 min。將膜放入一抗中(1 ∶750)，4℃孵育過夜。TBST沖洗膜后，將膜放入相應(yīng)的二抗(1 ∶2 000)中，室溫平搖2 h后，漂洗3次，每次20 min，用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。將曝光條帶進(jìn)行X光膠片掃描后，在醫(yī)學(xué)圖形分析系統(tǒng)ImageTool軟件上進(jìn)行分析，將所得PPARγ蛋白帶的綜合密度分別除以對應(yīng)組β-actin的綜合密度后，Excel表中進(jìn)行分析。

1.6 HUVECs PPARγ mRNA表達(dá)檢測PCR擴(kuò)增所用引物由上海生物工程有限公司合成，PPARγ上游引物：5′-TCTGGCCACCAACTTTGGG-3′；下游引物：5′-CTTCACAAGCATGAACTCCA-3′，PCR擴(kuò)增片段長度為360 bp。內(nèi)參β-actin上游引物：5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′；下游引物：5′-TGGAAGGTGG ACAGCGAGG-3′ ，PCR擴(kuò)增片段長度為268 bp。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中cDNA為5 μL，上、下游引物各1.0 μL，2X Tag酶為12.5 μL，再用無菌三蒸水補(bǔ)至25.0 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為30，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，擴(kuò)增PPARγ為61℃退火30 s，擴(kuò)增β-actin 為55℃退火45 s，72℃延伸45 s，最后72℃延伸5 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在透射紫外光分析儀下攝影，并在電腦上用Image Tool圖像處理軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 Cap呈濃度依賴性改善HG誘導(dǎo)HUVECs胰島素抵抗血管內(nèi)皮IR評價指標(biāo)常用血清或培養(yǎng)上清液中NO 和ET-1水平來表示。IR組與Control組比較，NO水平明顯降低、ET-1水平明顯升高(P<0.01vsControl)；用低劑量的卡托普利處理4 h后，與IR相比NO水平明顯升高且差異有顯著性(P<0.05vsIR)，而ET-1水平與IR組比較組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中、高劑量的卡托普利處理后，NO升高更明顯(P<0.01vsIR)，ET-1水平明顯降低(P<0.05)，見Fig 1。

2.2 Cap改善HG誘導(dǎo)HUVECs胰島素抵抗是由PPARγ介導(dǎo)見Fig 2。PI組與Control組比較，NO、ET-1水平無明顯差異(P>0.05)；IR+PI組與IR組比較，NO、ET-1水平差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IR+Cap組與IR組相比NO水平明顯升高、ET-1水平明顯下降(P<0.01)；而IR+Cap+PI組與IR+Cap組相比NO水平明顯下降、ET-1水平明顯升高(P<0.01)。

Fig 1 NO,ET-1 levels of various treatments in cultured ±s,n=6)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIR group

Fig 2 NO,ET-1 levels of various treatments in cultured HUVECs ±s,n=6)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsIR group;△△P<0.01vsIR+Cap group

2.3 Cap對HUVECs胰島素抵抗 時PPARγ mRNA表達(dá)的影響PPARγ mRNA各組樣本均由對應(yīng)的β-actin條帶的掃描值標(biāo)化再與Control組比較。PPARγ mRNA在正常HUVECs中呈基礎(chǔ)性表達(dá)；HUVECs暴露在高糖培養(yǎng)液中48 h后，PPARγ mRNA的表達(dá)與Control組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Cap組中內(nèi)皮細(xì)胞的PPARγ mRNA的表達(dá)量與IR組相比組間無明顯差異(P>0.05)，見Fig 3。

2.4 Cap對HUVECs胰島素抵抗時PPARγ和P-PPARγ蛋白表達(dá)的影響PPARγ各組樣本均由對應(yīng)的β-actin條帶的掃描值標(biāo)化。PPARγ蛋白、P-PPARγ蛋白在正常HUVECs中呈基礎(chǔ)性表達(dá)。IR組中PPARγ蛋白、P-PPARγ蛋白表達(dá)量無明顯變化，與 Control組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Cap組中內(nèi)皮細(xì)胞的PPARγ 蛋白的表達(dá)量與IR組相比亦無明顯差異(P>0.05)；而低、中劑量Cap組中內(nèi)皮細(xì)胞的P-PPARγ 蛋白的表達(dá)量較IR明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而高劑量Cap組與IR組相比P-PPARγ蛋白的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，見Fig 4。

3 討論

卡托普利可以改善胰島素抵抗，已有大量的資料證實(shí)。可能的作用機(jī)制目前有以下幾個方面：通過擴(kuò)血管效應(yīng)，增加骨骼肌的血流，可促使葡萄糖和胰島素向胰島素敏感組織釋放， 增加葡萄糖的利用；通過改善胰腺的血液循環(huán)從而提高胰島β細(xì)胞的代謝，促進(jìn)胰島素分泌，加強(qiáng)靶細(xì)胞功能，提高胰島素的生物效應(yīng)，改善胰島素抵抗[10-11]；Captopril還能通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性，使組織內(nèi)BK降解減少，局部血管BK濃度增高，BK具有擴(kuò)張血管和降壓作用，BK是血管內(nèi)皮L-精氨酸-NO途徑的重要激活劑，它作用于內(nèi)皮的β2受體能引起血管內(nèi)皮超極化因子及NO的釋放，BK降解減少還能進(jìn)一步促進(jìn)15-d-PGJ2合成，而15-d-PGJ2是PPARγ的天然激動劑。

Fig 3 Effect of various treatments on expression levels of

The left panel shows a representative electrophoretic diagram for PPARγ, β-actin mRNA by agrose gels; the right panel shows a statistical diagram of grey density

在我們的前期工作中，從整體動物、細(xì)胞和分子水平觀察了PPARγ經(jīng)典配體如羅格列酮(RG)或匹格列酮(PG)對高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮胰島素抵抗的作用，探討了其可能的作用機(jī)制。結(jié)果表明，無論RG或PG預(yù)處理和后處理，PG和RG均能明顯改善HG誘導(dǎo)HUVEC胰島素抵抗，其機(jī)制是通過非經(jīng)典PPARγ依賴的NF-κB轉(zhuǎn)錄抑制途徑(under revision)。PPARγ表達(dá)很廣泛，包括脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞等[12]。

本實(shí)驗(yàn)中，卡托普利改善胰島素抵抗是否通過PPARγ來介導(dǎo)的目前機(jī)制還并不清楚。實(shí)驗(yàn)中用高糖(33 mmol·L-1)處理內(nèi)皮細(xì)胞48 h后再用胰島素處理0.5 h，取其細(xì)胞上清測NO和ET-1水平，發(fā)現(xiàn)其NO水平比正常組明顯下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ET-1水平明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證明胰島素抵抗的模型建立成功。胰島素抵抗模型建立后，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們設(shè)計(jì)了卡托普利濃度梯度(10-8～10-2mol·L-1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度≤10-7mol·L-1時，Cap對細(xì)胞活力和胰島素抵抗程度均沒有影響；而濃度≥10-3mol·L-1時，細(xì)胞活力明顯下降，表現(xiàn)出明顯地細(xì)胞毒性。因此，我們就選擇了1.0×10-5mol·L-1的濃度。用Cap處理4 h后，其NO水平比IR組明顯升高，ET-1水平比IR組明顯降低，PPARγ蛋白表達(dá)水平與IR組相比無明顯改變，但P-PPARγ蛋白表達(dá)水平比IR組升高。結(jié)合文獻(xiàn)資料可能存在機(jī)制：在高糖和胰島素的刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致NO的分泌減少，ET-1的分泌增多，而這兩類物質(zhì)動態(tài)平衡維持著血管的正常狀態(tài)和功能。用Cap處理4 h后，Cap可以使內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)BK的減少，進(jìn)而促進(jìn)15-d-PGJ2的生成，15-d-PGJ2是PPARγ的天然激動劑，可以使PPARγ磷酸化途徑被激活，進(jìn)而改善胰島素抵抗。

Fig 4 Effect of various treatments on expression levels of PPARγ and P-PPARγ in cultured HUVECs ±s,n=6)

The upper panel shows representative Western blot for PPARγ, P-PPARγ and β-actin; the lower panel shows a statistical diagram of grey density.#P<0.05vsIR group.

綜上所述，卡托普利可以促使P-PPARγ蛋白的表達(dá)上調(diào)，PPARγ與胰島素信號之間亦存在著正反饋機(jī)制；PPARγ可通過轉(zhuǎn)錄激活作用增加靶基因的表達(dá)或激活來發(fā)揮作用?；罨腜PARγ能抑制脂肪細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，減輕TNF-α誘發(fā)的胰島素抵抗，且通過增加c-CBL相關(guān)蛋白及胰島素受體底物2的表達(dá)，增強(qiáng)胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而改善胰島素抵抗。

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Improvement effect of captopril on insulin resistance mediated by PPARγ in vascular endothelial cells

YAN Guo-qiang1,2, CHUN Chun-xiang1,2, CHEN Fang-hui1,2,GAO Yan1,2, CHU Jia-jia1,2, LI Teng1,2, HUANG Qi-ren1,2

(1.TheKeyLaboratoryofBasicPharmacologyinJiangxiProvince; 2.DeptofPharmacology,CollegeofPharmacy,NanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Aim To investigate the role of captopril in insulin resistance of endothelial cells induced by high glucose. Methods 1. Improvement effect of captopril on insulin resistance in HUVECs was observed. The HUVECs were seeded in a 6-well plate and were randomly divided into 5 groups, namely, control group, IR group, IR together with different Cap concentrations (low, medium and high concentration), respectively. 2. Improvement effect of Cap on insulin resistance was mediated by PPARγ in HUVECs. HUVECs were randomly divided into 6 groups, namely, control group, control+PPARγ inhibitor (PI)(1.0 μmol·L-1)group, IR group, IR+PI(1.0 μmol·L-1)group, IR+Cap( 1×10-5mol·L-1) group, and IR+Cap+PI (1.0 μmol·L-1)group. All indicators were detected. Results After HUVECs were incubated with media containing 33 mmol·L-1of glucose for 48 h, the NO levels were significantly decreased while ET-1 levels were significantly elevated, showing a significant difference between IR group and control group (P<0.01). The expression levels of PPARγ mRNA and its protein were somewhat up-regulated, but there was no significant difference between IR group and control group (P>0.05). When the HUVECs in IR group were treated with DMEM containing glucose (33 mmol·L-1) for 48 h and insulin for 30 min, the expression levels of PPARγ mRNA and its protein in Cap groups were similar to those in the IR group, and there was no significant difference between the two groups (P>0.05); however, the expression levels of phosphorylated-PPARγ protein in Cap groups were increased compared with IR group (P<0.05). The levels of NO were significantly increased whereas the levels of ET-1 were decreased in Cap groups, which had significant differences compared with IR group (P<0.05). Nonetheless, pre-treating with GW9662, a PPARγ inhibitor, the improvement effects of Cap were markedly abolished. Conclusions Captopril could improve high glucose-induced insulin resistance of endothelial cells mediated by PPARγ, and the underlying mechanisms are related to the activation of PPARγ, rather than its expression.

captopril; high glucose; human umbilical vein endothelium cells; insulin resistance; PPARγ; NO; ET-1

時間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.027.html

2014-10-31,

2014-12-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81360060、81070633、30860111、30660058)；江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(No 20123BCB22005)

嚴(yán)國強(qiáng)(1989-)，男，碩士生，研究方向：內(nèi)分泌代謝性疾病藥理學(xué),E-mail:ygq19890926@126.com 黃起壬(1967-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)分泌代謝性疾病藥理學(xué),通訊作者, E-mail:qrhuang@ncu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.019

A

1001-1978(2015)04-0532-06

R322.12；R458.5；R543.02；R587.1；R972.4；R977.6