邱 霓，李 聰，方偉進(jìn)，韋雪梅，何玉蓮，熊 燕

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州蛇毒研究所，廣東 廣州 510182)

耐力運(yùn)動(dòng)8周對(duì)大鼠骨骼肌收縮功能和線粒體生物合成的影響及機(jī)制

邱 霓，李 聰，方偉進(jìn)，韋雪梅，何玉蓮，熊 燕

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州蛇毒研究所，廣東 廣州 510182)

目的 探討8周耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)不同類型骨骼肌收縮功能及線粒體能量代謝能力的影響及其機(jī)制。方法 分離經(jīng)8周平臺(tái)跑步訓(xùn)練的♂ SD大鼠的比目魚(yú)肌和趾長(zhǎng)伸肌，觀測(cè)給予不同方式電刺激后兩種類型骨骼肌收縮能力和抗疲勞能力的變化以及ATP含量和線粒體生物合成相關(guān)指標(biāo)的改變。結(jié)果 耐力運(yùn)動(dòng)8周可一定程度提高比目魚(yú)肌和趾長(zhǎng)伸肌在單次電刺激和強(qiáng)直電刺激下的收縮力，明顯改善比目魚(yú)肌的抗疲勞能力。ATP含量在兩類肌肉中均明顯升高，但只有比目魚(yú)肌線粒體DNA、PGC-1α、NRF基因的轉(zhuǎn)錄及PGC-1α蛋白明顯上調(diào)，并伴隨p-AMPK/AMPK蛋白比值明顯增加。結(jié)論 耐力運(yùn)動(dòng)8周改善骨骼肌的收縮能力，但僅增加富含氧化型肌纖維的比目魚(yú)肌的抗疲勞能力，這可能與耐力運(yùn)動(dòng)激活氧化型肌纖維的AMPK，上調(diào)PGC-1α轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，增加線粒體生物合成有關(guān)。

耐力運(yùn)動(dòng)；比目魚(yú)?。恢洪L(zhǎng)伸??；骨骼肌收縮；線粒體生物合成；大鼠模型

骨骼肌占據(jù)了全身約45%的重量，在維持機(jī)體能量代謝平衡中起著重要的作用；肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病常伴隨骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體功能異常[1-2]。研究表明，肥胖患者骨骼肌線粒體含量減少，呼吸鏈氧化酶活性降低，呼吸能力減弱；2型糖尿病患者在出現(xiàn)代謝相關(guān)基因和線粒體基因表達(dá)減少之前就已存在骨骼肌氧化磷酸化水平降低的表現(xiàn)[3]。長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)被證實(shí)可有效改善代謝紊亂，降低代謝性疾病所致的死亡率[4]。

骨骼肌是一類可塑性較高的組織，可根據(jù)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、時(shí)間發(fā)生適應(yīng)性的改變。有證據(jù)表明，短期運(yùn)動(dòng)主要促進(jìn)骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取，增加肌肉蛋白質(zhì)的合成，增強(qiáng)肌肉力量；而長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)則促使肌肉減少對(duì)于糖原和高能磷酸物的利用，能量代謝底物從葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹?，乳酸產(chǎn)生減少，從而延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生[5]。然而，骨骼肌并非由單一類型肌纖維組成，其包括富含線粒體、以有氧代謝為主要能量來(lái)源的氧化型纖維和線粒體含量少、以糖酵解方式獲取能量的糖酵解纖維等。不同類型肌纖維中線粒體功能的改變對(duì)機(jī)體能量代謝狀態(tài)的適應(yīng)性存在差異。有證據(jù)表明，肥胖時(shí)以糖酵解型肌纖維為主的骨骼肌中線粒體數(shù)量升高，表現(xiàn)為線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)、過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferator γ activated receptor coactivator 1α, PGC-1α)、核呼吸因子(nuclear respiratory factor 1/2, NRF 1/2)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)等線粒體標(biāo)志物的含量和表達(dá)水平上調(diào)；而以氧化型肌纖維為主的骨骼肌中這些指標(biāo)無(wú)顯著變化或下調(diào)[6-7]。

現(xiàn)今雖有研究證實(shí)運(yùn)動(dòng)可改善骨骼肌的線粒體功能，但運(yùn)動(dòng)誘發(fā)骨骼肌線粒體發(fā)生適應(yīng)性改變的機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)8周平臺(tái)跑步耐力運(yùn)動(dòng)后大鼠模型小腿以其富含氧化型肌纖維的比目魚(yú)肌(soleus, SOL)和富含糖酵解型肌纖維的趾長(zhǎng)伸肌(extensor digitorum longus, EDL)為研究對(duì)象，探討長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)不同類型骨骼肌收縮和線粒體生物合成的影響及其調(diào)控機(jī)制，為預(yù)防和治療代謝性疾病，維持機(jī)體能量代謝平衡提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法

1.1 動(dòng)物飼養(yǎng)與分組SPF級(jí)♂SD大鼠20只，體質(zhì)量(200±15)g，購(gòu)自于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK(粵)：2010-0104。所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組和耐力運(yùn)動(dòng)組，每組10只。運(yùn)動(dòng)采用平臺(tái)耐力跑步訓(xùn)練法，即每天跑步1次，每周跑步5 d，休息2 d；運(yùn)動(dòng)量為每天先以15 m·min-1的速度跑15 min，再以20 m·min-1的速度跑60 min，最后以15 m·min-1的速度跑15 min，連續(xù)訓(xùn)練8周。

1.2 骨骼肌收縮功能測(cè)定腹腔注射10%水合氯醛(300 mg·kg-1)麻醉大鼠，迅速分離左側(cè)比目魚(yú)肌和趾長(zhǎng)伸肌，置于預(yù)冷充氧的K-H緩沖液中；將骨骼肌條穿過(guò)電極刺激環(huán)的中央，固定于恒溫37℃、持續(xù)充以95% O2和5% CO2混合氣體的K-H緩沖液浴槽中平衡，隨后分別給予單次刺激(10 V電壓、100 ms波寬的脈沖電刺激肌條)、強(qiáng)直刺激[10 V電壓、0.2 ms波寬、60 Hz(比目魚(yú)肌)/90 Hz (趾長(zhǎng)伸肌)頻率的脈沖電刺激肌條2 s]、疲勞刺激[10 V電壓，0.5 ms波寬，60 Hz(比目魚(yú)肌)/90 Hz (趾長(zhǎng)伸肌)頻率的脈沖電刺激肌條，電刺激1 s，休息1 s，依次交替地進(jìn)行，持續(xù)120 s]，采用PowerLab八道電生理記錄儀和Labchart7數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)控制電刺激強(qiáng)度，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3 骨骼肌ATP含量檢測(cè)采用熒光素酶法檢測(cè)ATP含量，并通過(guò)蛋白含量進(jìn)行最終標(biāo)化。取20 mg組織加入200 μL裂解液，然后用機(jī)械勻漿器充分勻漿，裂解后4 ℃ 12 000×g離心5 min，取20 μL上清并依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ATP含量和BCA蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)于廣州碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 線粒體DNA含量測(cè)定酚/氯仿法提取比目魚(yú)肌和趾長(zhǎng)伸肌的基因組DNA，取總DNA 100 ng為模板，加入到20 μL PCR反應(yīng)體系中。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行凝膠圖像分析，以細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COX Ⅰ)與β-actin的比值反映線粒體基因的合成情況。引物序列和反應(yīng)條件如Tab 1所示。

1.5 RT-PCR檢測(cè)PGC-1α、NRF 和UCP2基因轉(zhuǎn)錄TRIzol法提取比目魚(yú)肌和趾長(zhǎng)伸肌的RNA，取總RNA 500 ng為模板，用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。取50 ng cDNA加入到20 μL PCR反應(yīng)體系中。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行凝膠圖像分析。引物序列和反應(yīng)條件如Tab 1所示。

Tab 1 Sequences of forward and reverse primers for genes

1.6 Western blot檢測(cè)PGC-1α、磷酸化AMPK和總AMPK蛋白的表達(dá)取50 mg 比目魚(yú)肌和趾長(zhǎng)伸肌樣本，置于500μL預(yù)冷的RIPA裂解液中，冰上電動(dòng)勻漿20s，于4 ℃以12 000×g離心15 min，留取上清，并取30 μg蛋白進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)ChemiDoxTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，使用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描。其中PGC-1α抗體購(gòu)自Abcam公司，p-AMPK(Thr172)、AMPK抗體購(gòu)自Cell Signaling公司。

2.1 大鼠骨骼肌收縮功能的變化運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周后，無(wú)論是比目魚(yú)肌還是趾長(zhǎng)伸肌，給予單次刺激和強(qiáng)直刺激，其收縮能力均呈增強(qiáng)趨勢(shì)(見(jiàn)Fig 1A-B)。另外，與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組的比目魚(yú)肌抗疲勞能力增加，但趾長(zhǎng)伸肌的抗疲勞能力無(wú)明顯改善(見(jiàn)Fig 1C-D)。

2.2 大鼠骨骼肌ATP含量的改變與對(duì)照組相比，8周運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可提高比目魚(yú)肌和趾長(zhǎng)伸肌內(nèi)的ATP含量，其中比目魚(yú)肌內(nèi)ATP含量升高約2倍(P<0.05)，而趾長(zhǎng)伸肌內(nèi)ATP含量增加達(dá)3倍左右(P<0.01),見(jiàn)Fig 2A-B。

Fig 1 Endurance exercise for 8 weeks increased muscle contractility in SOL and ±s,n=4～5)

A: Twitch tension in SOL and EDL with or without exercise intervention for 8 weeks; B: Titanic tension in SOL and EDL with or without exercise intervention for 8 weeks; C: Percentage of initial force after fatigue stimulation for 120s in SOL; D: Percentage of initial force after fatigue stimulation for 120s in EDL.*P<0.05vscontrol group.

Fig 2 ATP contents increased in SOL(A) and EDL(B) after exercise intervention for 8 ±s,n=4～5)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2.3 運(yùn)動(dòng)8周對(duì)大鼠骨骼肌線粒體DNA的影響采用COX I與細(xì)胞核內(nèi)β-actin DNA比值以反映線粒體DNA含量。運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周的比目魚(yú)肌內(nèi)COX I/β-actin的比值明顯增加(P<0.05)，而趾長(zhǎng)伸肌內(nèi)COX I/β-actin比值無(wú)變化(Fig 3A-B)，這些結(jié)果提示8周耐力運(yùn)動(dòng)僅對(duì)比目魚(yú)肌線粒體生物合成有促進(jìn)作用。

2.4 骨骼肌PGC-1α及下游基因mRNA表達(dá)水平的改變8周耐力運(yùn)動(dòng)可明顯上調(diào)比目魚(yú)肌內(nèi)PGC-1α及其下游NRF基因的mRNA水平(P<0.01)，但對(duì)趾長(zhǎng)伸肌中PGC-1α和NRF基因的轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯影響。另外，8周耐力運(yùn)動(dòng)可明顯下調(diào)比目魚(yú)肌和趾長(zhǎng)伸肌中UCP2 mRNA水平(P<0.05),見(jiàn)Fig 4A-B。

2.5 骨骼肌PGC-1α蛋白表達(dá)水平的改變與對(duì)照組相比，8周耐力運(yùn)動(dòng)上調(diào)比目魚(yú)肌中PGC-1α蛋白水平(P<0.05)，但不影響趾長(zhǎng)伸肌中PGC-1α蛋白表達(dá)(Fig 5A-B)。

2.6 骨骼肌AMPK的表達(dá)變化耐力運(yùn)動(dòng)組比目魚(yú)肌中p-AMPK/AMPK比值較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，提示AMPK被激活(Fig 6A)。但p-AMPK/AMPK比值在趾長(zhǎng)伸肌內(nèi)未出現(xiàn)明顯的改變(Fig 6B)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)耐力運(yùn)動(dòng)8周增加比目魚(yú)肌和趾長(zhǎng)伸肌對(duì)單次刺激和強(qiáng)直刺激的反應(yīng)性，提高比目魚(yú)肌的抗疲勞能力，提示運(yùn)動(dòng)改善骨骼肌的收縮能力，在富含氧化型肌纖維的比目魚(yú)肌中尤為顯著。眾所周知，骨骼肌收縮需要ATP提供能量，而線粒體是ATP產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，因此線粒體功能的變化將直接影響骨骼肌的收縮能力。

Fig 3 Effect of endurance exercise for 8 weeks on mithochondrial DNA contents in SOL(A) and EDL(B) of ±s,n=4)

*P<0.05vscontrol group.

Fig 4 Effect of endurance exercise for 8 weeks on mRNA expression of PGC-1α, NRF, UCP2 and

*P<0.05vscontrol group

Fig 5 Effect of endurance exercise for 8 weeks on PGC-1α

*P<0.05vscontrol group.

線粒體功能的變化包括ATP含量和/或線粒體生物合成的變化。PGC-1α，線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)控因子，其主要分布于高氧化代謝的組織中，如肝臟、棕色脂肪、心臟、骨骼肌等，在骨骼肌中以氧化型肌纖維表達(dá)最高。PGC-1α可協(xié)調(diào)和輔助眾多輔轉(zhuǎn)錄因子(如NRF1和2、PPAR、Tfam等)，促進(jìn)線粒體核基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)線粒體DNA含量和線粒體復(fù)制增加[8-9]。有證據(jù)顯示，過(guò)表達(dá)PGC-1α可誘導(dǎo)小鼠糖酵解型肌纖維向氧化型肌纖維轉(zhuǎn)化，同時(shí)伴隨著細(xì)胞色素C和細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ及ATP合成酶表達(dá)增加；相反，PGC-1α基因敲除的小鼠骨骼肌內(nèi)線粒體體積減小，線粒體呼吸鏈蛋白、ATP合成酶表達(dá)，ADP刺激呼吸能力下降[10-11]。PGC-1α的表達(dá)和活性主要受腺苷酸活化蛋白激酶(5’-AMP-activated protein kinasein，AMPK)調(diào)控。AMPK可直接磷酸化PGC-1α，從而增加PGC-1α mRNA和蛋白的表達(dá)，觸發(fā)PGC-1α信號(hào)級(jí)聯(lián)，誘導(dǎo)線粒體生物合成。AMPK被稱為細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器，在維持能量供需平衡中起著重要作用。在能量匱乏或?qū)δ芰啃枨笤黾訒r(shí)，AMP/ATP比值增加，AMPK被激活，導(dǎo)致產(chǎn)生ATP的分解代謝途徑啟動(dòng)，而消耗ATP的合成代謝途徑被抑制。大量的研究提示，AMPK活化呈現(xiàn)運(yùn)動(dòng)時(shí)間依賴性和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度依賴性，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)不僅提高運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下骨骼肌的AMPK活性，也能提高骨骼肌安靜狀態(tài)下AMPK的活性[12-13]。無(wú)論是一次性急性運(yùn)動(dòng)、高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)還是長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)均可提高骨骼肌PGC-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平[14-16]。本研究結(jié)果顯示，8周耐力運(yùn)動(dòng)增加比目魚(yú)肌中線粒體基因COX Ⅰ與核基因β-actin拷貝數(shù)的比值、PGC-1α和NRF mRNA水平、PGC-1α蛋白水平，伴隨p-AMPK/AMPK比值升高；然而，趾長(zhǎng)伸肌內(nèi)未觀察到線粒體生物合成相關(guān)指標(biāo)和p-AMPK/AMPK比值的改變，提示8周耐力干預(yù)僅對(duì)富含氧化型肌纖維的比目魚(yú)肌內(nèi)線粒體生物合成有促進(jìn)作用，出現(xiàn)差異的原因可能與運(yùn)動(dòng)對(duì)小腿骨骼肌類型存在一定選擇性有關(guān)。

Fig 6 Effect of endurance exercise for 8 weeks on p-AMPK and total AMPK protein expression

*P<0.05vscontrol group.

ATP含量不僅與線粒體數(shù)量有關(guān)，還與線粒體的呼吸速率密不可分[17]。解偶聯(lián)蛋白(uncoupling proteins，UCPS)作為線粒體內(nèi)膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，當(dāng)它被激活時(shí)，可產(chǎn)生質(zhì)子滲漏，使氧化磷酸化解偶聯(lián)，ATP合成降低，導(dǎo)致產(chǎn)能作用轉(zhuǎn)化為產(chǎn)熱作用。UCP2表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致質(zhì)子漏和ATP合成之間進(jìn)行快速轉(zhuǎn)換，在不依賴于底物代謝和線粒體呼吸增加的情況下，提高線粒體呼吸速率，促使ATP得以快速大量產(chǎn)生[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，8周耐力運(yùn)動(dòng)明顯下調(diào)趾長(zhǎng)伸肌內(nèi)UCP2 mRNA的表達(dá)，增加ATP含量，但線粒體生物合成相關(guān)指標(biāo)未發(fā)生變化，推測(cè)線粒體呼吸速率改善是趾長(zhǎng)伸肌內(nèi)ATP含量增加的一個(gè)主要原因。

綜上所述，本研究表明耐力運(yùn)動(dòng)8周增加比目魚(yú)肌的收縮能力和抗疲勞能力，這與氧化型肌纖維內(nèi)AMPK被激活，上調(diào)PGC-1α，增加線粒體生物合成有關(guān)。但8周耐力運(yùn)動(dòng)僅一定程度增加趾長(zhǎng)伸肌的收縮能力，這與線粒體氧化呼吸速率改善，導(dǎo)致ATP含量增加有關(guān)。

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Effects and mechanisms of endurance exercise for 8 weeks on contractile function and mitochondrial biogenesis in rat skeletal muscles

QIU Ni, LI Cong, FANG Wei-jin, WEI Xue-mei, HE Yu-lian, XIONG Yan

(GuangzhouResearchInstituteofSnakeVenomandSchoolofPharmaceuticalSciences,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

Aim This study was aimed to explore the influence and mechanism of the long-term exercise on skeletal muscle contraction and mitochondrial biosynthesis in different muscle fibers. Methods Soleus (SOL) and extensor digitorum longus (EDL) were isolated from SD male rats with platform running training for eight weeks. The changes of contractility under different electrical stimulation were observed, mitochondrial biosynthesis, including ATP content, mitochondrial DNA, the gene expression of PGC-1α and NRF were also detected. Results Long-term endurance exercise can improve twitch tension and titanic tension of SOL and EDL , but only enhanced the fatigue resistance in SOL. ATP contents were significantly increased in the two types of muscles, but mtDNA content, PGC-1α expression and NRF translation were only obviously enhanced in SOL, in accompanied with an increase in p-AMPK/AMPK protein ratio. Conclusion Long-term endurance exercise increased skeletal muscle contractility and improved the anti-fatigue ability in SOL, which may be associated with increase in mitochondrial biosynthesis via activated AMPK-PGC-1α axis.

endurance exercise; soleus; extensor digitorum longus; skeletal muscle contractility; mitochondrial biosynthesis; rat model

時(shí)間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.021.html

2015-02-21,

2015-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81170778)；廣東省科技計(jì)劃(No 2013B21800098)；廣州市科技計(jì)劃(No 2014J4100067)

邱 霓(1981-)，女，博士后，講師，研究方向：代謝性疾病，E-mail：qiuni1016@163.com; 熊 燕(1960-)，女，博士，教授，研究方向：心血管和代謝性疾病，通訊作者，E-mail: xiongyan2001@yahoo.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.020

A

1001-1978(2015)05-0691-07

R-332；R322.74；R329.24；R336；R337.2