章 毅，劉云峰，高璟英，王 慧，丁亞琴，鐘向琴

( 山西醫(yī)科大學 1.藥理學教研室、2.第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,山西 太原 030001)

染料木黃酮對大鼠胰島素分泌的調(diào)控作用

章 毅1，劉云峰2，高璟英1，王 慧1，丁亞琴1，鐘向琴1

( 山西醫(yī)科大學 1.藥理學教研室、2.第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,山西 太原 030001)

我國糖尿病的發(fā)病率近年來呈現(xiàn)快速增長的趨勢。2型糖尿病以胰島素分泌相對不足和胰島素抵抗為主要特征，因此，促進胰島素分泌是臨床治療2型糖尿病的重要手段。染料木黃酮(genistein)主要來源于豆類植物，大量證據(jù)表明染料木黃酮對糖尿病、慢性缺氧、骨質(zhì)疏松等有一定的預防和治療作用[1-3]。研究顯示，染料木黃酮可改善2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗[1]，但其對胰島素分泌的作用及機制尚不明晰。本研究采用放免法測定胰島素分泌，膜片鉗測定胰島β細胞鉀離子通道電流等方法，觀察染料木黃酮對大鼠胰島素分泌的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料胰島由180～250 g Wistar大鼠分離所得。胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；膠原酶P、Histopaque 1077、染料木黃酮、青鏈霉素及多聚賴氨酸購自美國Sigma公司；Fura 2 AM購自日本同仁(Dojindo)公司；分離胰島細胞用Dispase酶購自美國Amresco公司；大鼠胰島素放射免疫試劑盒購自北京北方生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 胰島細胞分離及培養(yǎng) 根據(jù)我們之前報道的方法[4]，分離大鼠膽總管后，經(jīng)膽總管向胰腺內(nèi)注入膠原酶P后37℃水浴消化，Histopaque 1077梯度離心，收集消化后的胰腺組織，于體視顯微鏡下手工挑取胰島。部分胰島經(jīng)dispase酶37℃繼續(xù)消化6 min，獲得胰島細胞。

1.2.2 胰島素釋放實驗 根據(jù)我們之前報道的方法[4]，配制KRBH孵育液，依實驗要求分別添加不同濃度的葡萄糖和染料木黃酮。每個含KRBH的孵育管中放入5個胰島，置于培養(yǎng)箱中孵育60 min，收集上清液，用放免法測胰島素含量。

1.2.3 膜片鉗實驗 當細胞封接電阻大于1 GΩ，行全細胞膜片鉗記錄。將細胞鉗制在-70 mV，給予70 mV的電壓刺激，記錄電壓依賴性鉀通道(KV)電流。

2 結果

2.1 染料木黃酮對胰島素分泌的影響在15 mmol·L-1葡萄糖濃度條件下給予不同濃度的染料木黃酮，結果表明隨著藥物劑量的增加，胰島素分泌量逐漸增大。同對照組(control) 相比,10～100 μmol·L-1的染料木黃酮均明顯增加了胰島素的分泌量。見Tab 1。

2.2 葡萄糖濃度對染料木黃酮促胰島素分泌作用的影響在不同葡萄糖濃度(0、10、15 mmol·L-1)條件下給予100 μmol·L-1的染料木黃酮，并設平行對照組不給予染料木黃酮，結果顯示隨著葡萄糖濃度的增加，染料木黃酮的促胰島素分泌作用逐漸增強。與其平行對照組相比,高糖(10、15 mmol·L-1)條件下染料木黃酮對胰島素分泌的促進作用差異具有統(tǒng)計學意義，而在無糖環(huán)境下染料木黃酮則對胰島素分泌不產(chǎn)生影響。表明染料木黃酮的刺激胰島素分泌作用具有葡萄糖濃度依賴性。見Tab 2。

Genistein/μmol·L-1Insulinrelease/ng·islet-10(control)8.39±0.54310.46±0.581012.57±0.69*3019.89±0.88**10023.87±0.75**

*P<0.05 ,**P<0.01vscontrol

Glucoseconcentration/mmol·L-1Insulinrelease/ng·islet-1ControlGenistein00.47±0.040.63±0.05103.06±0.259.26±0.65**159.57±0.63*27.57±1.63**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 細胞外鈣對染料木黃酮促胰島素分泌作用的影響在15 mmol·L-1葡萄糖濃度條件下，觀察染料木黃酮(100 μmol·L-1)在含不同鈣濃度(0、2.5 mmol·L-1)孵育液中對胰島素分泌的作用。結果顯示，同對照組相比，在有細胞外鈣離子的條件下染料木黃酮明顯促進了胰島素的分泌；而在無細胞外鈣離子條件下染料木黃酮對胰島素分泌無明顯影響。表明染料木黃酮的促胰島素分泌作用依賴于細胞外鈣離子。見Tab 3。

ExtracellularCa2+/mmol·L-1Insulinrelease/ng·islet-1ControlGenistein04.39±0.384.83±0.402.57.67±0.6523.06±1.25**

**P<0.01vscontrol

2.4 染料木黃酮對胰島β細胞電壓依賴性鉀通道(Kv)的影響結果顯示,與給藥前(before treatment)相比，給予染料木黃酮干預 (treatment with genistein)使Kv電流明顯被抑制；而當去除染料木黃酮干預后(after treatment) Kv電流又恢復至給藥前水平。表明染料木黃酮能可逆性地抑制Kv通道電流。見Tab 4。

GroupCurrentdensity/pA·pF-1Beforetreatment147.62±4.78Treatmentwithgenistein56.67±2.82*Aftertreatment139.72±3.98

*P<0.05vscontrol

3 討論

染料木黃酮是一種異黃酮類化合物, 主要來源于豆類植物。在對人和動物的研究中發(fā)現(xiàn)染料木黃酮具有抗糖尿病作用[5-6]，這可能與染料木黃酮改善胰島素抵抗、改善糖脂代謝有關[1]。然而，染料木黃酮是否具有調(diào)節(jié)胰島素分泌的作用尚不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)染料木黃酮可以濃度依賴性的促進胰島素分泌，并且此作用與胰島所處的葡萄糖濃度環(huán)境密切相關，在高糖環(huán)境下染料木黃酮的促胰島素分泌作用更強。

我們的研究進一步發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮具有明顯的抑制胰島β細胞Kv通道的作用。Jacobson等[7]的研究表明，抑制β細胞Kv通道可以通過延長細胞動作電位時程，進而增加細胞外鈣進入細胞內(nèi)而發(fā)揮促進胰島素分泌作用。我們的實驗結果也表明,當去除胰島β細胞外鈣離子后，染料木黃酮的促胰島素分泌作用基本消失，表明染料木黃酮的促胰島素分泌作用依賴于細胞外鈣離子。此外,我們的前期研究也表明，一種腺苷酸環(huán)化酶抑制劑MDL-12330A具有阻斷β細胞Kv通道的作用，并且可以葡萄糖依賴性的促進胰島素分泌[4]，其作用特點與染料木黃酮的促胰島素分泌作用非常相似。綜上所述，我們認為染料木黃酮的促胰島素分泌作用是其產(chǎn)生抗糖尿病作用的重要因素之一，其作用機制與阻斷Kv通道，進而促進鈣離子內(nèi)流有關。

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Regulatory effects of genistein on insulin secretion from rat pancreatic cells

ZHANG Yi1, LIU Yun-feng2, GAO Jing-ying1, WANG Hui1, DING Ya-qin1, ZHONG Xiang-qin1

(1.DeptofPharmacology, 2.DeptofEndocrinologyoftheFirstHospital,ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China)

染料木黃酮；胰島；電壓依賴性鉀通道；膜片鉗；鈣離子；胰島素

genistein; pancreatic islet; voltage dependent potassium channel; patch clamp; calcium; insulin

時間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.029.html

2014-12-12,

2015-01-10

國家自然科學基金資助項目(No 81070662，81273564，81373464)；山西省自然科學基金資助項目(No 2012011039-8, 2013011047-3)；山西省高等學校優(yōu)秀青年學術帶頭人支持計劃(章毅 2011-24)；山西省留學人員科技活動項目擇優(yōu)資助，山西省回國留學人員科研資助項目(No 2012-046，2013-111)；山西省衛(wèi)生廳科研課題資助項目(No 201201062)；中華醫(yī)學會臨床醫(yī)學科研專項資金資助項目(No 13040440429);人力資源和社會保障部擇優(yōu)啟動項目(No 2013-277)

章 毅(1971-) ，男，博士，教授，博士生導師，研究方向:內(nèi)分泌藥理學，通訊作者，Tel: 0351-4135132，E-mail：yizhang313@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.029

A

1001-1978(2015)05-0737-02

R-332；R322.57；R347.8；R587.105.31；R977.15