王 超, 張會欣, 邢邯英, 王 杏, 劉 敏, 張 哲

(1. 河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學重點實驗室，河北 石家莊 050051；2. 河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理室，河北 石家莊 050035)

◇復方藥物藥理學◇

通心絡膠囊抑制p38 MAPK磷酸化抑制糖尿病周圍神經(jīng)病變小鼠氧化應激

王 超1, 張會欣2, 邢邯英1, 王 杏1, 劉 敏1, 張 哲1

(1. 河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學重點實驗室，河北 石家莊 050051；2. 河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理室，河北 石家莊 050035)

目的 觀察通心絡膠囊對糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)小鼠氧化應激的作用并探討其機制。方法 KK/Upj-Ay小鼠分為模型組、通心絡高、中、低劑量組，另設C57BL/6小鼠為對照組。灌胃給藥12周，測定熱痛覺閾值和運動神經(jīng)傳導速度(MNCV)；比色法測定血液中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量；熒光定量PCR和Western blot測定坐骨神經(jīng)血紅素氧合酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)表達；Western blot測定坐骨神經(jīng)p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK蛋白表達。結果 與模型組比較，通心絡組小鼠痛覺閾值升高，MNCV明顯增快(P<0.05，P<0.01)；SOD、GSH-Px活性明顯上升，MDA含量上升(P<0.01)；HO-1、γ-GCS mRNA和蛋白表達明顯升高(P<0.05，P<0.01)；p-p38 MAPK表達明顯下降(P<0.05)。結論通心絡膠囊可通過抑制p38 MAPK磷酸化水平而發(fā)揮其抗DPN小鼠氧化應激損傷的作用。

通心絡膠囊；糖尿病周圍神經(jīng)病變；氧化應激；MAPK；p38 MAPK；KK/Upj-Ay小鼠

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病患者最為常見慢性并發(fā)癥之一，也是足潰瘍、感染及壞疽的主要致病因素。大量研究表明，糖尿病時氧化應激可通過多種途徑損害神經(jīng)，如MAPK通路，MAPK是重要的信號傳導系統(tǒng)，氧化應激能夠激活MAPK通路調(diào)節(jié)Ⅱ相酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和表達，引起機體發(fā)生病理生理改變[1-2]。通心絡膠囊在治療DPN患者臨床研究中顯示了很好的療效[3-4]。我們采用KK/Upj-Ay小鼠為DPN動物模型，KK/Upj-Ay小鼠是常用的一種自發(fā)性2型糖尿病動物模型，研究表明，12周齡的KK/Upj-Ay小鼠即可出現(xiàn)周圍無髓神經(jīng)纖維空泡化、軸索閉鎖等明顯的DPN的病理特征[5]。本實驗從氧化應激角度觀察通心絡膠囊對DPN小鼠的作用，并進一步研究其對絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級C57BL/6 ♂小鼠，25～30 g，10只；SPF級KK/Upj-Ay ♂小鼠，30～40 g，40只；均購于北京華阜康生物公司，動物合格證號：SCXK-(京)2009-0004。

1.2 藥品與試劑通心絡膠囊[由人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣、檀香、降香、乳香(制)、酸棗仁(炒)、冰片組方，石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號20110501]；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、SOD、GSH-Px試劑盒購自南京建成生物研究所；γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl cysteine synthetase，γ-GCS)和血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)引物由上海生工生物技術公司合成；兔抗HO-1多克隆抗體、兔抗γ-GCS多克隆抗體、兔抗p38 MAPK多克隆抗體、兔抗p-p38 MAPK多克隆抗體、兔抗p-JNK多克隆抗體、兔抗JNK多克隆抗體、兔抗p-JNK多克隆抗體、兔抗ERK多克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.3 儀器PowerLab生理記錄儀購自AD Instrument公司；SpectraMax M2酶標分析儀購自美國分子儀器公司；凝膠成像分析儀購自Biorad公司；7300熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.4 動物分組與給藥將40只♂ KK/Upj-Ay小鼠按空腹血糖值(FBG)分為模型組、通心絡高劑量組(TXL-H)、通心絡中劑量組(TXL-M)和通心絡低劑量組(TXL-L)，另設C57BL/6小鼠為對照組，每組10只動物。通心絡高、中、低劑量組分別灌胃給予生藥4、2、1 g·kg-1的通心絡膠囊，模型組和對照組灌胃給予等體積的純水，每日1次，連續(xù)12周。

1.5 熱痛覺閾值測定和坐骨神經(jīng)傳導速度(MNCV)測定給藥結束后，將小鼠放在恒溫(55℃)熱板儀上，以小鼠舔后足反應的潛伏期為痛覺閾值。運動神經(jīng)傳導速度測定時，連接PowerLab生理記錄儀，將刺激電極插入小鼠右側坐骨切跡，將2個記錄電極分別插入小鼠踝部和左足底第2趾間，記錄雙通道復合動作電位。MNCV=兩對記錄電極間距離除以兩通道復合動作電位潛伏期之差。

1.6 FBG、SOD、GSH-Px活性和MDA含量測定末次給藥結束后，禁食，取血，血糖儀測定FBG；按試劑盒說明書比色法測定SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.7 熒光定量PCR方法測定γ-GCS、HO-1 mRNA的表達實驗結束后處死小鼠，取坐骨神經(jīng)組織，提取總RNA，按試劑盒說明加樣進行逆轉錄反應，熒光定量qPCR儀擴增。γ-GCS引物：上游：5′-GCACATCTACCACGCAGTCA-3′，下游：5′-CAGAGTCTCAAGAACATCGCC-3′，產(chǎn)物片段142bp；HO-1引物：上游：5′-GCTGGTGATGGCTTCCTTGT-3′，下游：5′-ACTGGGTTCTGCTTGTTGCG-3′，產(chǎn)物片段75bp；內(nèi)參照GAPDH引物：上游：5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′，下游：5′-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3′，產(chǎn)物片段143 bp。用儀器自帶的分析軟件，將對照組設定為1，以相對定量值RQ用于統(tǒng)計分析。

1.8 Western blot法檢測γ-GCS、HO-1、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK蛋白的表達實驗結束后處死小鼠，取坐骨神經(jīng)組織，提取總蛋白，半干法電泳轉移至PVDF膜，用脫脂奶粉封閉，加入γ-GCS、HO-1、p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK和GAPDH一抗，后加入相應的二抗，化學發(fā)光法顯影。對條帶進行掃描，用軟件分析條帶中吸光度值，以目的蛋白γ-GCS、HO-1、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK和GAPDH內(nèi)參照吸光度值的比值用于統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 各組小鼠FBG、痛覺閾值及MNCV變化與對照組比較，模型組小鼠FBG值明顯升高，痛覺閾值明顯降低，MNCV明顯減慢(P<0.01)；通心絡組FBG與模型組比較有下降的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。通心絡中、高劑量組與模型組比較痛覺閾值明顯升高，MNCV明顯增快(P<0.05，P<0.01)。見Tab 1。

GroupFBG/mmol·L-1Before12weeksPawwithdrawallatency/sMNCV/m·s-1Control5.33±0.815.51±0.8816.99±2.0024.44±0.06Model14.83±2.66##17.54±2.79##8.82±1.22##5.43±1.01##TXL-L14.72±2.7816.46±2.449.64±1.506.16±1.12TXL-M14.64±2.6115.84±1.8611.5±1.85*7.82±1.63*TXL-H14.86±2.3114.97±2.2712.63±2.19**9.54±1.77**

##P<0.01vscontrol group；*P<0.05，**P<0.01vsmodel group

2.2 各組小鼠血液中SOD、GSH-Px及MDA含量的變化與對照組比較，模型組SOD、GSH-Px活性明顯下降，MDA含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，通心絡組SOD活性上升、MDA含量降低(P<0.01)，中、高劑量組GSH-Px活性上升(P<0.01)。見Tab 2。

GroupSOD/kU·L-1GSH-Px/kU·L-1MDA/μmol·L-1Control72.5±7.9191.56±9.707.81±1.33Model40.33±4.43##45.73±5.63##12.29±1.19##TXL-L52.32±6.77**48.97±5.849.26±1.40**TXL-M59.98±7.15**56.16±5.83**9.81±1.56**TXL-H65.10±6.99**61.74±5.72**8.86±1.75**

##P<0.01vscontrol group；**P<0.01vsmodel group

2.3 各組坐骨神經(jīng)HO-1、γ-GCS表達的變化與對照組比較，模型組HO-1、γ-GCS表達有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)；與模型組比較，通心絡組HO-1、γ-GCS mRNA表達明顯上升(P<0.01)，中、高劑量組HO-1、γ-GCS蛋白表達明顯上升(P<0.05，P<0.01)。見Fig 1。

Fig 1 Effects of TXL on HO-1,γ-GCS mRNA(A) and protein (B) expression

1.Control；2.Model；3.TXL-L；4. TXL-M；5. TXL-H；*P<0.05，**P<0.01vsmodel group

2.4 各組坐骨神經(jīng)MAPK通路的變化與對照組比較，模型組p38 MAPK蛋白磷酸化水平明顯升高(P<0.01)；通心絡中、高劑量組p38 MAPK蛋白磷酸化水平明顯低于模型組(P<0.05)；p38 MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK蛋白在各組表達差異無統(tǒng)計意義。見Fig 2。

Fig 2 Effects of TXL on MAPK expression in DPN mice

1.Control；2.Model；3.TXL-L；4. TXL-M；5. TXL-H;##P<0.01vscontrol group；*P<0.05vsmodel group.

3 討論

通心絡膠囊是已上市的中藥復方制劑，臨床上用于治療心絞痛、冠心病等心腦血管性疾病。近期臨床陸續(xù)報道了通心絡膠囊可以提高DPN患者傳導速度、改善DPN體征[3-4]。我們實驗也證實通心絡膠囊能提高DPN小鼠痛覺閾值、提高神經(jīng)傳導速度，但并沒有顯示出明顯的降糖作用，表明通心絡膠囊的改善DPN作用是獨立于降糖作用之外的其他機制。

大量研究證實，超氧化物陰離子的過量產(chǎn)生導致的氧化應激可損傷糖尿病動物的神經(jīng)和血管組織的 DNA、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)，導致神經(jīng)傳導速度下降，產(chǎn)生DPN[6-7]。HO-1和γ-GCS是體內(nèi)重要的氧自由基清除劑和抗氧化劑，中藥通過上調(diào)HO-1和γ-GCS表達預防和治療DPN也有大量文獻報道[8]。本實驗結果顯示，通心絡膠囊給予灌胃12周后能降低MDA含量，提高SOD、GSH-Px活性，表明通心絡膠囊改善DPN與有效減低DPN小鼠的氧化應激損傷有關。我們同時還觀察到通心絡膠囊能明顯升高DPN小鼠坐骨神經(jīng)HO-1、γ-GCS mRNA和蛋白表達，其中HO-1的活性直接影響到抗氧化損傷的能力的變化[9]。谷胱甘肽GSH是一種重要的抗氧化劑[10]，谷氨酰半胱胺酸合成酶(γGCS)為其關鍵限速酶，坐骨神經(jīng)HO-1、γ-GCS表達的升高與血液中MDA含量下降，SOD、GSH-Px活性升高二者互相印證，提示了通心絡膠囊對DPN小鼠的抗氧化應激作用。

MAPK家族是引起細胞生物學反應(如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等)的重要信號傳導系統(tǒng)，MAPK分為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun 氨基端激酶(JNK) 和p38 MAPK三類。其中p38 MAPK信號轉導通路參與了神經(jīng)病變的發(fā)生和發(fā)展[11]。Agthong等[12]報道了應用p38 MAPK抑制劑SB239063可防治糖尿病大鼠感覺神經(jīng)元的傳導障礙。我們觀察了DPN小鼠MAPK通路的變化，研究發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)中p38 MAPK磷酸化被激活，通心絡膠囊灌胃給藥12周能明顯降低p38 MAPK磷酸化水平，表明通心絡膠囊可通過抑制p38 MAPK磷酸化抑制DPN小鼠氧化應激。

通心絡膠囊可通過抑制p38 MAPK途徑，抑制DPN小鼠的氧化應激，從而保護神經(jīng)細胞免受氧化應激損傷，提高神經(jīng)傳導速度，這可能是其保護 DPN 的作用機制之一。通心絡膠囊為中藥復方制劑，組方中的人參具有降糖、擴血管的作用，文獻報道人參炔醇和人參環(huán)氧炔醇同時具有神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)作用，但是否在DPN中發(fā)揮作用尚需進一步研究。

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Tongxinluo capsule inhibits oxidative stress in diabetic peripheral neuropathy mice by inhibiting the activity of p-p38 MAPK

WANG Chao1, ZHANG Hui-xin2, XING Han-ying1, WANG Xing1, LIU Min1, ZHANG Zhe1

(1.KeyLaboratoryofGeriatrics,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China;2.DeptofPharmacology,HebeiYilingMedicineInstitute,Shijiazhuang050035,China)

Aim To investigate the effects of Tongxinluo capsule on oxidative stress in diabetic peripheral neuropathy (DPN) mice and its mechanisms. Methods KK/Upj-Ay mice were divided into model, Tongxinluo low-dose group, Tongxinluo middle-dose group and Tongxinluo high-dose group. C57BL/6 mice were selected as control group. Mice were given drugs intragastrically for 12 weeks. Paw withdrawal latency, motor nerve conduction velocity (MNCV) were detected. Activity of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and content of malondialdehyde (MDA) in blood were detected by colorimetric method. The expression of heme oxygenase-1(HO-1), γ-glutamyl cysteine synthetase (γ-GCS) of sciatic nerve was examined by real time PCR and Western blot. The protein expression of p38 MAPK,p-p38 MAPK,JNK,p-JNK,ERK,p-ERK was examined by Western blot. Results Compared with model group, paw withdrawal latency was increased and MNCV was faster in Tongxinluo group (P<0.05,P<0.01). SOD and GSH-Px contents significantly increased, MDA content decreased (P<0.01). HO-1, γ-GCS mRNA and protein expression significantly increased (P<0.05,P<0.01) in Tongxinluo group. p-p38 MAPK protein expression decreased in Tongxinluo group (P<0.05). Conclusion Tongxinluo can inhibit oxidative stress in DPN of mice via suppressing the phosphorylation of p38 MAPK.

Tongxinluo capsule；diabetic peripheral neuropathy；oxidative stress；MAPK；p38 MAPK；KK/Upj-Ay mice

時間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.026.html

2015-02-24,

2015-03-28

國家科技部 “重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No 2011ZX09101-004-02)；河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目(No 2014155)

王 超(1975- )，男，博士，副研究員，研究方向：老年病學， E-mail: cwyx163@163.com； 張會欣(1976- )，女，博士，正高級工程師，研究方向：糖尿病微血管病，通訊作者，E-mail:hxzhang76@sohu.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.026

A

1001-1978(2015)05-0726-05

R-332；R287；R349.1；R587.2；R745