彭洪薇，李 菲，鄭雪蓮，呂燕妮，孫曉春，段舟萍，熊冬生，魏筱華

(1. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020)

靛玉紅衍生物PHⅡ-7促進(jìn)sTRAIL對(duì)乳腺癌細(xì)胞及其耐藥株殺傷的機(jī)制研究

彭洪薇1，李 菲1，鄭雪蓮1，呂燕妮1，孫曉春1，段舟萍1，熊冬生2，魏筱華1

(1. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020)

目的 探討靛玉紅衍生物PHⅡ-7聯(lián)合腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7及其耐藥株MCF-7/ADR的增殖及調(diào)節(jié)TRAIL受體表達(dá)的相關(guān)機(jī)制。方法 采用MTT法，分別檢測(cè)PHⅡ-7、TRAIL及低濃度PHⅡ-7聯(lián)合TRAIL處理MCF-7、MCF-7/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，同時(shí)以TRAIL敏感細(xì)胞MDA-MB-231為對(duì)照，證實(shí)上述乳腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和藥物作用后活性氧的產(chǎn)生情況；real time PCR檢測(cè)PHⅡ-7以及PHⅡ-7和活性氧抑制劑NAC聯(lián)用后，乳腺癌細(xì)胞TRAIL功能性受體DR4、DR5的表達(dá)情況。結(jié)果 PHⅡ-7作用24 h后對(duì)MCF-7及MCF-7/ADR的IC50分別為(4.49±1.55)、(3.44±0.90) μmol·L-1，TRAIL可誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，而MCF-7、MCF-7/ADR對(duì)TRAIL極不敏感，各濃度組與MDA-MB-231相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低濃度PHⅡ-7聯(lián)合TRAIL可有效促進(jìn)TRAIL對(duì)MCF-7、MCF-7/ADR的殺傷并誘導(dǎo)凋亡，而兩藥單用對(duì)上述細(xì)胞的增殖抑制作用有限；此外，低濃度的PHⅡ-7還對(duì)人正常細(xì)胞PBMC的毒性很小，即使與TRAIL聯(lián)用，在該濃度范圍下也不會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性；PHⅡ-7可有效誘導(dǎo)MCF-7及MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，同時(shí)上調(diào)TRAIL受體DR4、DR5的水平，并呈劑量依賴性。當(dāng)PHⅡ-7與ROS抑制劑NAC聯(lián)用時(shí)，可有效抑制PHⅡ-7對(duì)DR4、DR5的表達(dá)上調(diào)作用。結(jié)論 低濃度的PHⅡ-7可有效增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MCF-7/ADR對(duì)TRAIL治療的敏感性，其機(jī)制可能是通過PHⅡ-7升高細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平進(jìn)而上調(diào)TRAIL受體DR4、DR5表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。本研究為今后PHⅡ-7聯(lián)合TRAIL 治療方案的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

靛玉紅；PHⅡ-7；乳腺癌耐藥；TRAIL；ROS；死亡受體

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是TNF家族唯一一個(gè)被發(fā)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，而對(duì)正常細(xì)胞沒有影響的蛋白，其可溶形式(sTRAIL,114-281)現(xiàn)在已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)[1]。目前所用的傳統(tǒng)化療藥物存在毒性大、臨床耐藥率高等問題，TRAIL對(duì)腫瘤殺傷的選擇性、特異性使其有可能成為今后新興的腫瘤生物治療“明星”藥物，然而進(jìn)一步的研究顯示，一些血液腫瘤及實(shí)體瘤，尤其是惡性程度高的腫瘤往往對(duì)TRAIL引起的凋亡呈天然耐受[2]。由于TRAIL具有良好的腫瘤靶向性及低毒性，因此，尋找克服TRAIL耐受的機(jī)制或增強(qiáng)TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的策略成為近年來抗腫瘤研究的重點(diǎn)。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤之首，且患者死亡率居高不下。盡管近年來乳腺癌的預(yù)后得到了很大的改善，但乳腺癌對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生往往代表了不良預(yù)后——化療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。腫瘤的多藥耐藥指的是腫瘤細(xì)胞對(duì)結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制相異的傳統(tǒng)化療藥物均具有耐藥性的現(xiàn)象。由此，開發(fā)出新的、可克服耐藥的新化療方案將有助于解決上述問題。PHⅡ-7是靛玉紅的衍生物(結(jié)構(gòu)如Fig 1)，在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，PHⅡ-7對(duì)許多不同來源的腫瘤細(xì)胞，尤其是耐藥的腫瘤細(xì)胞有效[3]。在本研究中，我們選擇高表達(dá)MDR-1的乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR及其敏感細(xì)胞MCF-7為研究對(duì)象，并以乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-361為對(duì)照，重點(diǎn)探討PHⅡ-7對(duì)sTRAIL誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡作用的影響。

Fig 1 Structure of indirubin and derivative of indirubin, PHⅡ-7

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7及其耐藥株MCF-7/ADR、轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-361均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所惠贈(zèng)。細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640或DMEM高糖型培養(yǎng)基，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。此外，耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR常規(guī)培養(yǎng)中加入阿霉素(adriamycin, ADR)，終濃度為1 mg·L-1以維持耐藥性，實(shí)驗(yàn)前2周撤藥。

1.2 試劑與儀器sTRAIL(PROSPEC, Israel)；CCK-8 reagent(日本同仁化學(xué)研究所)；TRIzol及逆轉(zhuǎn)錄試劑(Invitrogen, USA)；Real time試劑(大連寶生物公司)；阿霉素購(gòu)自美國(guó)輝瑞制藥有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific 公司；兔抗人caspase-8抗體、兔抗人PARP-1抗體、兔抗人GAPDH抗體、兔抗人H2A.X抗體及兔抗人磷酸化-H2A.X抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。PCR 引物由Invitrogen公司合成。凝膠電泳儀購(gòu)自上海天能(Tanon) 公司。

1.3 CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞活力采用CCK-8試劑測(cè)定細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，用含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配成1×108·L-1，接種于96孔培養(yǎng)板(細(xì)胞數(shù)為每孔6×103)，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，分組加藥，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)組加入對(duì)應(yīng)濃度的藥物，陰性對(duì)照加入等體積的生理鹽水，使每孔的終體積為200 μL。培養(yǎng)20 h后，每孔加入CCK-8 20 μL (5 g·L-1)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm光密度(OD)值。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率按以下公式計(jì)算：抑制率/%=(對(duì)照組OD值-加藥組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。以同一藥物的不同濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線，根據(jù)線性回歸方程求出該藥物的半數(shù)殺傷濃度IC50，即細(xì)胞存活率減少50%時(shí)的藥物劑量[4]。

1.4 人外周血單個(gè)核細(xì)胞的提?、俨烧Ｈ送庵莒o脈血約10 mL，經(jīng)抗凝處理后，按 1 ∶1 的體積比加入淋巴細(xì)胞分離液，靜置20 min，1 500 r·min-1離心15 min，用吸管小心吸取白膜層相，盡量不要將其它層面的細(xì)胞或液體吸入。②將上面收集到的淋巴細(xì)胞用 PBS 洗滌2遍后，以含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，同時(shí)加入IL-2(1 000 kU·L-1)刺激細(xì)胞。

1.5 活性氧(ROS)檢測(cè)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，稀釋接種于6孔板中培養(yǎng)(每孔3×105細(xì)胞)，對(duì)照組(細(xì)胞未經(jīng)藥物處理)和實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞經(jīng)過藥物處理)處理后，胰酶消化細(xì)胞，于細(xì)胞懸液中加入終濃度10 μmol·L-1DCFH2-DA染料，避光孵育30 min；孵育結(jié)束后重懸、收集細(xì)胞，最后用冰預(yù)冷的PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平[5]。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)胰酶消化細(xì)胞MCF-7/ADR、MCF-7，10%胎牛血清終止消化后PBS洗2遍，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108·L-1，6孔板每孔加2 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過夜后加入藥物處理。參照Annexin Ⅴ/PI雙染凋亡試劑盒操作說明書操作。收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，冰預(yù)冷的PBS洗2遍后，用100 μL Binding buffer將待測(cè)細(xì)胞的密度調(diào)整為5×105～1×106細(xì)胞懸液，5 μL FITC-Annexin Ⅴ標(biāo)記液和5μL PI，輕輕混勻。避光室溫染色15 min，再補(bǔ)充400 μL Binding buffer重懸，流式細(xì)胞儀(BD,LSRⅡ)測(cè)定各組細(xì)胞發(fā)生凋亡的百分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值與標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 RNA提取，cDNA合成和實(shí)時(shí)定量-PCR收集上述乳腺癌細(xì)胞，胰酶消化貼壁細(xì)胞，10%胎牛血清終止消化后PBS洗2遍，調(diào)整細(xì)胞濃度，收集2×105個(gè)細(xì)胞沉淀，以TRIzol裂解。cDNA合成根據(jù)Invitrogen cDNA合成試劑盒說明操作。根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的基因序列信息，采用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，并經(jīng)BLAS分析，由Invitrogen公司合成，PAGE純化，本研究所用的引物序列如Tab 1所示。

Tab 1 Primer sequences for realtime PCR

1.8 蛋白裂解、SDS-PAGE電泳及Western blot實(shí)驗(yàn)收集上述乳腺癌細(xì)胞，胰酶消化貼壁細(xì)胞，10%胎牛血清終止消化后PBS洗2遍。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)，胰酶消化后，按2×106/100μL RIPA濃度加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA中裂解，4℃裂解30 min，10 000×g離心20 min，取上清，BCA法進(jìn)行總蛋白定量。每組取50 μg蛋白，用10%的SDS-PAGE分離蛋白，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h后，按預(yù)染標(biāo)志物標(biāo)記的分子量裁剪轉(zhuǎn)印膜，分別加入目標(biāo)蛋白一抗，4℃孵育過夜。再以PBS清洗后加入二抗，室溫下孵育30 min，ECL法顯色。Tanon凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PHⅡ-7的細(xì)胞毒作用不同濃度的PHⅡ-7及阿霉素處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7及其耐藥株MCF-7/ADR 24 h后，其對(duì)PHⅡ-7的IC50分別為(4.49±1.55)、(3.44±0.90) μmol·L-1；同時(shí)MCF-7及MCF-7/ADR對(duì)阿霉素的IC50值分別為(3.45±0.05)和(137±12.77) μmol·L-1,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明MCF-7/ADR確是耐藥的乳腺癌細(xì)胞株。PHⅡ-7對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7及MCF-7/ADR的增殖抑制作用均存在劑量依賴性，且當(dāng)PHⅡ-7濃度為1 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞抑制率<10%，因此，在以下的實(shí)驗(yàn)中選擇1μmol·L-1PHⅡ-7為聯(lián)合用藥濃度。

2.2 sTRAIL對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞MDA-MB-231是文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)TRAIL較敏感的乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系[6]，MDA-MB-361是對(duì)TRAIL耐受的乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞，在本實(shí)驗(yàn)中我們將它們作為對(duì)照。

不同濃度(0～400 μg·L-1)的sTRAIL處理乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-361、MCF-7及MCF-7/ADR 24h后，與TRAIL敏感細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞相比，其他乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均低于20%，表現(xiàn)出對(duì)TRAIL殺傷不敏感。Western blot進(jìn)一步證實(shí)了sTRAIL可有效地誘導(dǎo)TRAIL敏感細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞凋亡(Fig 2)。

Fig 2 Cytotoxic effect of TRAIL to breast cancer cell line

A: Breast cancer cells MDA-MB-231,MDA-MB-361,MCF-7 and its multidrug resistant counterpart MCF-7/ADR were treated by various concentrations of TRAIL(0～400 μg·L-1) for 24 h, then after incubated by CCK-8 reagent for 2 h, the absorbance was read in 450nm and the inhibition rate was calculated. B: Cell lysates containing equal amounts of protein(50μg)were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with anti-PARP-1/caspase-8/cleaved caspase-8 antibody. GAPDH was shown as an internal control.*P<0.05,**P<0.01vssurvival rate of 0 concentration of each group

2.3 低濃度的PHⅡ-7與sTRAIL聯(lián)用可有效促進(jìn)sTRAIL對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用

2.3.1 低濃度的PHⅡ-7對(duì)正常組織細(xì)胞的毒性 不同濃度的PHⅡ-7(0～20 μmol·L-1)處理人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，低濃度(<1 μmol·L-1)的PHⅡ-7對(duì)PBMC的增殖抑制作用較弱(<80%)，即使與50 μg·L-1的sTRAIL聯(lián)用，對(duì)PBMC的抑制作用仍不明顯(Fig 3 A、B)。

Fig 3 PHⅡ-7 with low concentration augment TRAIL-induced apoptosis in breast cancer cell line

A:Cytotoxic effect of PHⅡ-7(0～20μmol·L-1)on human peripheral blood mononuclear cell(PBMC). PBMC was treated with each concentration of PHⅡ-7 for 24h.*P<0.05,**P<0.01vscontrol. B: Cell survival rate of PBMC treated by low concentration of PHⅡ-7(0～1μmol·L-1)alone or in combination with sTRAIL(50 μg·L-1) for 24h. C: Cell survival rate of breat cancer cell line MCF-7 and its multidrug resistant counterpat MCF-7/ADR treated by low concentration of PHⅡ-7(0～1μmol·L-1)alone or in combination with sTRAIL(50 μg·L-1) for 24h.*P<0.05vsPH Ⅱ-7 alone. D: Apoptosis detected in breast cancer cells by Annexin Ⅴ-FITC tests when PHⅡ-7(1μmol·L-1) in combination with sTRAIL(50 μg·L-1). E： Apoptosis rates counted with three independent repeated experiments.*P<0.05vscontrol.F: Western blot analysis of apoptosis pathway protein. Cell lysates containing equal amounts of protein(50μg) were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with anti-PARP-1 and anti-caspase-8 antibody. GAPDH was shown as an internal control.

2.3.2 低濃度的PHⅡ-7與sTRAIL聯(lián)合應(yīng)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用 低濃度的PHⅡ-7(0～1 μmol·L-1)與sTRAIL聯(lián)合處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7及其耐藥株MCF-7/ADR，如Fig 3C所示，盡管上述濃度范圍內(nèi)的PHⅡ-7對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用有限，但一旦與sTRAIL聯(lián)用，顯示出劑量依賴性的增殖抑制作用，其中1 μmol·L-1PHⅡ-7與50 μg·L-1sTRAIL聯(lián)用后乳腺癌細(xì)胞MCF-7及其耐藥株MCF-7/ADR的抑制率分別為(68.03±1.23)%、(60.03±2.44)%。

2.3.3 低濃度的PHⅡ-7與sTRAIL聯(lián)用可有效誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡 如Fig 3D、E所示，1 μmol·L-1PHⅡ-7及sTRAIL(50 μg·L-1)單用均未明顯誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，而一旦1μmol·L-1PHⅡ-7與sTRAIL聯(lián)用，細(xì)胞凋亡率明顯升高，MCF-7及MCF-7/ADR的凋亡率分別為(25.00±3.23)%、(28.18±0.33)%。

2.3.4 低濃度的PHⅡ-7與sTRAIL聯(lián)用可激活乳腺癌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路 Western blot法證實(shí)1 μmol·L-1PHⅡ-7與sTRAIL(50 μg·L-1)聯(lián)用可有效激活caspase-8，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡(Fig 3F)。

2.4 低濃度的PHⅡ-7通過升高乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平上調(diào)DR4、DR5的表達(dá)

2.4.1 低濃度的PHⅡ-7可激活升高細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平 利用活性氧的特異探針DCFH2-DA，我們檢測(cè)了1μmol·L-1PHⅡ-7作用于MCF-7及MCF-7/ADR后細(xì)胞內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)變化情況。如Fig 4A所示，細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平在藥物作用2 h后達(dá)到最高，之后下降，符合細(xì)胞氧化應(yīng)激的特征。細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物大分子如蛋白質(zhì)、DNA造成損傷。H2A.X是ATM的效應(yīng)蛋白，當(dāng)細(xì)胞的DNA受損后，激活A(yù)TM/ATR激酶系統(tǒng)，從而將H2A.X磷酸化，因此H2A.X的磷酸化是檢測(cè)DNA損傷的一個(gè)重要指標(biāo)。如Fig 4B所示，乳腺癌細(xì)胞中H2A.X的磷酸化狀態(tài)隨著PHⅡ-7作用時(shí)間的增加逐漸增強(qiáng)，說明PHⅡ-7引致的ROS升高可能造成了DNA損傷。

2.4.2 低濃度的PHⅡ-7升高細(xì)胞內(nèi)DR4、DR5的表達(dá) 實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot分析結(jié)果顯示，PHⅡ-7可升高乳腺癌細(xì)胞內(nèi)DR4、DR5的表達(dá)，且呈劑量依賴性；用ROS的抑制劑NAC處理之后，細(xì)胞內(nèi)DR4、DR5的表達(dá)水平恢復(fù)至與對(duì)照組相當(dāng)(Fig 5)。

Fig 4 1 μmol·L-1 PHⅡ-7 generated ROS production in breast cancer cells

A: DCFH2-DA probe detected the ROS production by PHⅡ-7(1μmol·L-1) in breast cancer cells; B: Western blot analysis confirmed DNA damage. Cells were treated with PHⅡ-7(1μmol·L-1) for various time(0-24h). Equal amouts of protein(50μg)from cell lysates were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with anti-phospho-H2A.X/ anti-H2A.X antibody. GAPDH was shown as an internal control.*P<0.05vscontrol

3 討論

TRAIL 因其對(duì)腫瘤細(xì)胞良好的特異性，且對(duì)正常細(xì)胞毒性很小而顯示出很好的應(yīng)用前景。TRAIL為Ⅱ型跨膜蛋白，其可溶形式(114-281肽段)(soluble TRAIL, sTRAIL)作為跨膜蛋白 TRAIL 胞外區(qū)的一部分，可以與完整的TRAIL 分子一樣，募集細(xì)胞膜表面的功能性受體 DR4、DR5，啟動(dòng)外源性凋亡[7]。然而，盡管TRAIL顯示出令人欣喜的抗腫瘤前景，許多腫瘤組織對(duì)TRAIL殺傷的耐受也是不容忽視的問題。

有報(bào)道表明,c-Fos在前列腺癌組織中，因參與抑制抗凋亡蛋白c-FLIP的功能故可以促進(jìn)TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8-10]。在我們實(shí)驗(yàn)室保存的耐藥細(xì)胞株K562/A02及MCF-7/ADR也發(fā)現(xiàn)c-Fos高表達(dá)，并被認(rèn)為與多藥耐藥相關(guān)蛋白P-gp的過表達(dá)相關(guān)[4]。受到Zhang等[8]的研究啟發(fā)，我們比較了sTRAIL分子對(duì)耐藥及敏感細(xì)胞的殺傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sTRAIL對(duì)它們的殺傷并無差異，說明c-Fos在上述兩株耐藥細(xì)胞株中并未對(duì)TRAIL啟動(dòng)的外源性凋亡通路產(chǎn)生明顯影響。

Fig 5 1μmol·L-1 PHⅡ-7 up-regulated expression of TRAIL receptor, DR4 and DR5 and ROS scavenger could block the effect

A.Realtime PCR analysis confirmed TRAIL receptors, DR4 and DR5 up-regulation by PHⅡ-7(1 μmol·L-1) with various time(0-24h), and ROS scavenger, NAC, blocked the effect. B. Western blot analysis confimed DR4 and DR5 up-regulation by PHⅡ-7(1 μmol·L-1) and once NAC in combination with PHⅡ-7, the expression of DR4 and DR5 remain to control.*P<0.05vscontrol

盡管部分化療藥物可不同程度地有助于腫瘤細(xì)胞克服TRAIL的耐受[11-12]，但這些化療藥物大多對(duì)已經(jīng)獲得多藥耐藥性的腫瘤細(xì)胞無效。臨床上，常常由于腫瘤細(xì)胞高表達(dá)P-gp，獲得對(duì)許多傳統(tǒng)化療藥物的多藥耐藥性而導(dǎo)致化療失敗。這樣一來，因?yàn)槟退幮缘漠a(chǎn)生，這些化療藥物在細(xì)胞內(nèi)不能達(dá)到有效的藥物濃度，造成這些細(xì)胞依舊對(duì)與TRAIL聯(lián)合的用藥方案不敏感。同時(shí)，由于傳統(tǒng)化療藥物在治療過程中的毒性較大，不僅降低了病人的生活質(zhì)量，也將對(duì)治療的依從性造成很大的影響。

PHⅡ-7是我們實(shí)驗(yàn)室以傳統(tǒng)中藥當(dāng)歸龍薈丸的有效成分靛玉紅為模板，經(jīng)過構(gòu)效關(guān)系分析合成得到的靛玉紅衍生物，我們之前的研究已發(fā)現(xiàn)PHⅡ-7可有效地降低多藥耐藥腫瘤細(xì)胞K562/A02、MCF-7/ADR中多藥耐藥蛋白MDR-1的表達(dá)，其可能機(jī)制是通過升高細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平[5,13]；而多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的高低可影響腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性[14]。本研究的結(jié)果顯示，PHⅡ-7正是通過升高細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中DR4、DR5的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)TRAIL對(duì)上述細(xì)胞的殺傷。盡管多種化療藥物均證實(shí)可不同程度地提高腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性，但上述傳統(tǒng)化療藥物對(duì)多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞無效。且多數(shù)情況下，大劑量的化療藥物可以通過不同途徑有效殺死腫瘤細(xì)胞，但治療過程中的毒性反應(yīng)難以避免，開發(fā)新的低毒高效的化療方案一直是腫瘤學(xué)界學(xué)者們追求的目標(biāo)。利用TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，同時(shí)借助于低濃度的PHⅡ-7對(duì)敏感和多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞相當(dāng)?shù)卮龠M(jìn)TRAIL殺傷的抗腫瘤作用，低濃度的靛玉紅衍生物PHⅡ-7聯(lián)合TRAIL分子將有希望成為今后腫瘤治療可選擇的有效治療方案。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系均為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所熊冬生教授惠贈(zèng)，實(shí)驗(yàn)工作主要在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研中心完成，在此一并感謝。)

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Study of mechanism of indirubin derivative PH Ⅱ-7 in augmenting TRAIL-induced cytotoxicity in breast cancer cell line as well as its chemo-resistant counterpart

PENG Hong-wei1, LI Fei1, ZHENG Xue-lian1, LYU Yan-ni1, SUN Xiao-chun1,DUAN Zhou-ping1, XIONG Dong-sheng2, WEI Xiao-hua1

(1.TheFirstAffilatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China;2.StateKeyLaboratoryofExperimentalHematology,InstituteofHematology,BeijingUnionMedicalCollege&ChinaAcademyofMedicalSciences,Tianjin300020,China)

Aim To investigate the effect of indirubin derivative PHⅡ-7 and TRAIL on proliferation in breast cancer cell MCF-7 and its MDR counterpart MCF-7/ADR and the mechanism.Methods Growth inhibition rate was examined respectively by MTT assay under treatment with TRAIL or PHⅡ-7 or in combination. Cell apoptosis and ROS production were examined by flow cytometry. The change of TRAIL receptors(DR4/DR5) in mRNA was analysed by realtime PCR.Results IC50of PHⅡ-7 on MCF-7 and MCF-7/ADR was (4.49±1.55), (3.44±0.90) μmol·L-1respectively;MDA-MB-231 was TRAIL sensitive cell line, and apparently TRAIL induced apoptosis in MDA-MB-231.Low concentration of PHⅡ-7 in combination with TRAIL could augment TRAIL-induced cytotoxic effect including apoptosis while TRAIL or PHⅡ-7 treatment alone had limited cytotoxity to those cells. Besides, PHⅡ-7 at this concentration had little toxicity to human peripheral blood mononuclear cells even if in combination with TRAIL. PHⅡ-7 generated ROS production inside MCF-7 and MCF-7/ADR cells and up-regulated DR4/DR5 expression concentration dependently.Once upon ROS scavenger NAC involved, the effect of TRAIL receptors up-regualtion by expression was abrogated.Conclusions PHⅡ-7 at low concentration could improve the sensitivities of breast cancer cell MCF-7 and MCF-7/ADR to TRAIL, the mechanism of which may be the ability of ROS production by PHⅡ-7 help up-regulated TRAIL receptor DR4,DR5. Our research set a solid foundation for PHⅡ-7 in combination with TRAIL in future clinical application.

indirubin; PHⅡ-7; multidrug resistance in breast cancer; TRAIL; ROS; death receptor

時(shí)間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.018.html

2015-02-17,

2015-03-19

江西省教育廳科技項(xiàng)目(No GJJ13027)

彭洪薇(1985-)，女，博士，主管藥師，研究方向：腫瘤靶向治療與多藥耐藥,Tel:0791-88694216，E-mail:wavypeng1985@126.com; 魏筱華(1964-)，女，學(xué)士，主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué),通訊作者,Tel:0791-88692736,E-mail:wxh-hello@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.018

A

1001-1978(2015)05-0679-07

R284.1；R329.24；R392.11；R737.902.2；R979.1