劉理靜，錢(qián) 紅，張 平，王在巖

(1.湖南醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，湖南 懷化 418000；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

白藜蘆醇對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC-5生長(zhǎng)的抑制作用

劉理靜1，錢(qián) 紅1，張 平2，王在巖2

(1.湖南醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，湖南 懷化 418000；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的 探討白藜蘆醇(Res)對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及相關(guān)機(jī)制。方法 以人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5為研究對(duì)象，分別予20 μL二甲基亞砜(DMSO)及0、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1Res處理細(xì)胞24、48、72 h，通過(guò)MTT法分析細(xì)胞增殖抑制率。另外，以20 μL DMSO(溶媒組)及 50、100 μmol·L-1Res孵育細(xì)胞48 h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率，行原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)測(cè)定細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1, Cyclin D1)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)mRNA與蛋白表達(dá)，Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果 隨著Res濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加(P<0.01)。在共同培養(yǎng)48 h后，50、100 μmol·L-1Res處理組S、G2/M期DNA比例及Cyclin D1、CDK4 mRNA與蛋白表達(dá)水平、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，而G0/G1期DNA比例、AI、凋亡率及Bax蛋白表達(dá)水平增加，與溶媒組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，并且100 μmol·L-1Res 效果強(qiáng)于50 μmol·L-1(P<0.01)。結(jié)論 Res能抑制MRC-5細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與阻礙細(xì)胞周期進(jìn)展及促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

白藜蘆醇；人胚肺成纖維細(xì)胞；增殖；細(xì)胞周期；凋亡；細(xì)胞周期蛋白D1

肺纖維化(pulmonary fibrosis)是以肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞異常增殖和膠原蛋白沉積為特征的免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，是許多病因不同的肺間質(zhì)疾病的共同結(jié)局，臨床表現(xiàn)主要為進(jìn)行性呼吸困難，患者最終因呼吸衰竭而死亡，目前仍缺乏有效的治療手段，因此，尋找抗肺纖維化的有效藥物已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)的迫切需要[1-3]。肺成纖維細(xì)胞由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)，構(gòu)成肺臟結(jié)締組織中主要的細(xì)胞成分，在病理?xiàng)l件下，這些細(xì)胞也是肺纖維化形成過(guò)程中的最重要效應(yīng)細(xì)胞，一方面，通過(guò)自身不斷增殖合成大量膠原蛋白參與肺纖維化的進(jìn)程，另一方面，分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)展[4]。白藜蘆醇(resveratrol, Res)是從植物中提取的一種非黃酮類(lèi)多酚化合物，分子式為C14H12O3，具有廣泛的藥理活性。本課題組前期研究顯示，Res對(duì)博萊霉素所致的大鼠肺纖維化具有良好的治療作用[5-8]。近年眾多研究證實(shí)[9-11]，Res也有較強(qiáng)的抗心臟成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)。然而，Res對(duì)肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響仍不清楚。因此。本研究以人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5為研究對(duì)象，觀察Res對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和凋亡的影響，旨在進(jìn)一步闡述Res抗肺纖維化的分子機(jī)制，從而為其臨床應(yīng)用提供更多的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人胚肺成纖維細(xì)胞株(MRC-5)由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。Res購(gòu)于西安天一生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：070115，純度≥98%。新生胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司。四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra-zolium bromide, MTT]試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、碘化丙啶由美國(guó) Sigma公司提供。原位缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Ferments公司。兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1, Cyclin D1)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)、Bcl-2、Bax、β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MRC-5細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%新生胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，以0.25%的胰蛋白酶消化，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量，且呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)待用。

1.2.2 細(xì)胞分組 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MRC-5細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，并接種于96孔板中，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，約 100 μL，然后加入0.18 mL培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，待細(xì)胞貼壁后分為溶媒組(DMSO)和Res(溶解于DMSO中)處理組，每組平行設(shè)置5個(gè)樣本。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 Res處理組加入0(DMSO)、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1的Res各20μL，溶媒組加入相同體積的DMSO，共同培養(yǎng)24、48、72 h后，滴加已配好的20 μL MTT溶液(5g·L-1)，繼續(xù)孵育4 h，然后結(jié)束培養(yǎng)，將每孔內(nèi)的培養(yǎng)上清液小心棄去，加入150 μL的DMSO，輕輕振蕩約10 min，使結(jié)晶能夠完全溶解，以DMSO調(diào)零，在Bio-Tek808酶標(biāo)儀上，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每個(gè)孔的吸光度(optical density, OD)值，計(jì)算不同濃度Res的細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率/%=(溶媒組OD值-Res處理組OD值)/溶媒組OD值×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率 Res處理組分別加入50、100 μmol·L-1的Res 20 μL，溶媒組加入20 μL DMSO，孵育48 h后，PBS洗細(xì)胞3次，并用胰蛋白酶消化，1 500 r·min-1離心3 min，重復(fù)以上操作3次，收集細(xì)胞沉淀，加70%并4℃預(yù)冷的乙醇固定過(guò)夜，24 h后離心去上清，加入1mL碘化丙啶染液，4℃避光30 min，用400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次。采用FACS420流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckerman coulter 公司)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞周期各時(shí)相 DNA的百分含量及凋亡率。

1.2.5 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 經(jīng)20 μL DMSO以及50、100 μmol·L-1Res分別處理MRC-5細(xì)胞48 h后，采用TUNEL檢測(cè)MRC-5細(xì)胞凋亡。凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒。在400高倍視野下，每張切片隨機(jī)取5個(gè)區(qū)域，計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域中細(xì)胞核數(shù)及凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)，取其平均值，按下式計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI)，AI/%=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 取經(jīng)20 μL DMSO以及50、100 μmol·L-1Res干預(yù)48 h 的MRC-5細(xì)胞，采用TRIzol試劑提取總RNA，并溶解于無(wú)RNase的水中，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)樣本總RNA 的A260/280，其比值均在1.8～2.0之間，符合實(shí)驗(yàn)要求。取總RNA 2 μg，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法合成cDNA。Cyclin D1、CDK4、β-actin引物序列參照文獻(xiàn)[12]，由上海生工生物工程公司合成，其中Cyclin D1引物序列：上游5′-CTCCTGGTGAACAAGCTCAAGT-3′，下游5′-GCGGTAGTAGGACAGGAAGTTG-3′，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為258 bp；CDK4引物序列：上游5′-GGGACCGTCAAGCTGGCTGA-3′，下游5′-TCGAGGCCAGTCGTCTTCTG-3′，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為267 bp；β-actin引物序列：上游5′-CCCACACTGTGCCCATCTACG-3′，下游5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3′，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為205 bp。取10 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，62℃復(fù)性40 s，72℃延伸1 min，總共35個(gè)循環(huán)。用ΔΔCt值法，以β-actin為內(nèi)參照，定量Cyclin D1、CDK4 mRNA的表達(dá)水平。

1.2.7 Western blot 細(xì)胞處理過(guò)程同上，收集細(xì)胞，通過(guò)三去污裂解液將細(xì)胞勻漿，吸出上清液，并進(jìn)行蛋白定量。常規(guī)制備SDS-PAGE膠，20 μg蛋白質(zhì)樣品上樣，在70 V電壓下電泳1.5 h，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉，分別加入1 ∶500兔抗人Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax、β-actin抗體，4℃孵育過(guò)夜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶2 500)室溫孵育1 h，ECL 顯色，暗室曝光。利用Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行掃描，得出灰度值，目的蛋白(Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax)表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

2 結(jié)果

2.1 Res對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的抑制作用通過(guò)MTT法分析Res干預(yù)對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的影響(Fig 1)，發(fā)現(xiàn)隨著Res濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的抑制率逐漸增加，在同一Res濃度(12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)組內(nèi)，干預(yù)24、48、72 h后細(xì)胞增殖抑制率兩兩之間比較，差異均有顯著性(P<0.01)。同樣，在同一時(shí)點(diǎn)內(nèi)，各Res處理組細(xì)胞增殖抑制率比較，差異均有顯著性(P<0.01)，見(jiàn)Fig 1。

2.2 Res對(duì)MRC-5細(xì)胞周期的影響以50、100 μmol·L-1Res 20 μL分別處理MRC-5細(xì)胞48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期各時(shí)相 DNA比例，結(jié)果顯示，50、100 μmol·L-1Res處理組G0/G1期DNA比例增加， S、G2/M期DNA比例降低，與溶媒組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，而且100 μmol·L-1Res處理組G0/G1期DNA比例高于50 μmol·L-1Res處理組(P<0.01)，但S、G2/M期DNA比例低于50 μmol·L-1Res處理組(P<0.01)，見(jiàn)Fig 2、3。

Fig 1 Inhibitory rate of cellular proliferation in MRC-5 cells treated with various concentration of Res for different time ±s, n=5)

Fig 2 Cell cycle distribution of MRC-5 cells among groups

2.3 Res對(duì)MRC-5細(xì)胞Cyclin D1、CDK4表達(dá)的影響為了進(jìn)一步闡明Res使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在G0/G1期的機(jī)制，通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot測(cè)定MRC-5細(xì)胞中Cyclin D1、CDK4表達(dá)，如Fig 4、5所示，與溶媒組相比，50、100 μmol·L-1Res處理組Cyclin D1、CDK4 mRNA與蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01)，此外，100 μmol·L-1Res處理組Cyclin D1、CDK4 mRNA與蛋白表達(dá)水平較50 μmol·L-1Res處理組下降(P<0.01)。

Fig 3 DNA contents of G0/G1, S and G2/M phases

1: Medium group; 2: 50 μmol·L-1Res-treated group; 3: 100 μmol·L-1Res-treated group.**P<0.01vsmedium group;##P<0.01vs50 μmol·L-1Res-treated group

Fig 4 Expression of Cyclin D1 and CDK4 mRNA in

1: Medium group; 2: 50 μmol·L-1Res-treated group; 3: 100 μmol·L-1Res-treated group.**P<0.01vsmedium group;##P<0.01vs50 μmol·L-1Res-treated group

2.4 Res對(duì)MRC-5細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，溶媒組僅有少量MRC-5細(xì)胞凋亡，給予50、100 μmol·L-1Res處理細(xì)胞48 h后，AI明顯上升，與溶媒組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，而且100 μmol·L-1Res處理組AI高于50 μmol·L-1Res處理組(P<0.01)，見(jiàn)Fig 6。此外，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組MRC-5細(xì)胞凋亡率，其變化趨勢(shì)與AI相似，見(jiàn)Fig 7、8。

Fig 5 Expression of Cyclin D1 and CDK4 proteins in

1: Medium group; 2: 50 μmol·L-1Res-treated group; 3: 100 μmol·L-1Res-treated group.**P<0.01vsmedium group;##P<0.01vs50 μmol·L-1Res-treated group

2.5 Res對(duì)MRC-5細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響通過(guò)Western blot測(cè)定MRC-5細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，由Fig 9可知，經(jīng)20 μL的50、100 μmol·L-1Res孵育MRC-5細(xì)胞48 h后， Bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)水平上調(diào)，與溶媒組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，另外，100 μmol·L-1Res處理組Bcl-2蛋白表達(dá)水平較50 μmol·L-1Res處理組減少(P<0.01)，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)水平較50 μmol·L-1Res處理組升高(P<0.01)。

3 討論

Res廣泛存在于葡萄、花生、虎杖多種植物體內(nèi)，是植物在受到紫外線照射、外來(lái)病菌入侵等不利條件下產(chǎn)生的一種植物抗毒素。隨著研究的深入，目前已發(fā)現(xiàn)Res具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、抗纖維化、降壓、抗血小板聚集、抗氧化以及抗細(xì)菌和真菌感染等[13-15]。張黎等[16]用Res處理小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Res能明顯抑制細(xì)胞增殖。另外，Res給藥呈劑量依賴性地阻礙人皮膚肥厚性瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)[17]。本研究應(yīng)用MTT法分析Res干預(yù)對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)隨著Res濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加，表明Res在體外能抑制MRC-5細(xì)胞增殖，并且具有時(shí)效和量效關(guān)系。

Fig 7 MRC-5 cell apoptosis detected by flow cytometry among groups

Fig 8 Comparison of apoptotic rate in MRC-5 cells

1: Medium group; 2: 50 μmol·L-1Res-treated group; 3: 100 μmol·L-1Res-treated group.**P<0.01vsmedium group;##P<0.01vs50 μmol·L-1Res-treated group

Fig 9 Expression of Bcl-2 and Bax proteins in

1: Medium group; 2: 50 μmol·L-1Res-treated group; 3: 100 μmol·L-1Res-treated group.**P<0.01vsmedium group;##P<0.01vs50 μmol·L-1Res-treated group

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，分為間期(G1、S、G2)與分裂期(M)兩個(gè)階段，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。已有研究證實(shí)，Res與體外培養(yǎng)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤 SH-SY5Y細(xì)胞共同孵育，能夠阻止 G1期細(xì)胞進(jìn)入 S期[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用50、100 μmol·L-1Res處理MRC-5細(xì)胞48 h后，G0/G1期DNA比例升高，而S、G2/M期DNA比例降低，并且100 μmol·L-1Res作用強(qiáng)于50 μmol·L-1，提示Res可阻止MRC-5細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，使細(xì)胞停滯于G0/G1期，減少了DNA合成和有絲分裂，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。Cyclin D1為G1期的正性調(diào)控蛋白，當(dāng)其與 CDK4結(jié)合后，驅(qū)使細(xì)胞通過(guò)R(restriction point)點(diǎn)，由G1期進(jìn)入S期而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分裂增殖。陳加順等[19]報(bào)道，Res作用于人肺腺癌 A549細(xì)胞后，Cyclin D1表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞活性降低。為了進(jìn)一步探討Res誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期的機(jī)制，本研究采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)經(jīng)50、100 μmol·L-1Res處理后的MRC-5細(xì)胞Cyclin D1、CDK4表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著Res濃度的升高，Cyclin D1、CDK4 mRNA與蛋白表達(dá)水平逐漸減少，因此，Res通過(guò)下調(diào)Cyclin D1、CDK4表達(dá)使細(xì)胞不能通過(guò)R點(diǎn)，這可能是Res抑制MRC-5細(xì)胞周期進(jìn)展的重要機(jī)制。

細(xì)胞凋亡又稱為程序性死亡，它是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而引起細(xì)胞死亡的方式。Bcl-2、Bax被認(rèn)為是調(diào)控凋亡最重要的2個(gè)因子，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，Bax則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。最近，顧生玖等[20]發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素通過(guò)下調(diào)Bcl-2表達(dá)及上調(diào)Bax表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG-2凋亡。Liu等[21]報(bào)道，Res通過(guò)激活caspase-3、9,增加人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡率。因此，Res誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡特性可能對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用。的確，將50、100 μmol·L-1Res加入MRC-5細(xì)胞后，AI、凋亡率和Bax表達(dá)水平明顯增加，Bcl-2表達(dá)水平降低，并且濃度越高，效果越明顯，表明Res通過(guò)減少Bcl-2/Bax比例刺激MRC-5細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗MRC-5細(xì)胞增殖效應(yīng)。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)了Res能有效抑制體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5生長(zhǎng)，一方面通過(guò)下調(diào)Cyclin D1、CDK4表達(dá)阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，另一方面通過(guò)降低Bcl-2表達(dá)及增加Bax表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這從新的視角闡明了Res抑制肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。因此，深入開(kāi)展Res抗肺纖維化作用的研究可能為這種疾病的治療帶來(lái)新的思路和希望。

[1] Cottin V. Current approaches to the diagnosis and treatment of idiopathic pulmonary fibrosis in Europe: the AIR survey[J].EurRespirRev, 2014, 23(132):225-30.

[2] Cottin V, Crestani B, Valeyre D, et al. Diagnosis and management of idiopathic pulmonary fibrosis: French practical guidelines[J].EurRespirRev, 2014, 23(132):193-214.

[3] Duck A. Management of idiopathic pulmonary fibrosis[J].NursTimes, 2014, 110(16):16-7.

[4] 高 建, 劉 干, 李 俊. 肺成纖維細(xì)胞在肺纖維化進(jìn)程中的作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2010, 26(9): 1125-9.

[4] Gao J, Liu G, Li J. The role of fibroblasts in pulmonary fibrosis[J].ChinPharmacolBull, 2010, 26(9): 1125-9.

[5] 劉理靜, 于小華, 張 平. 白藜蘆醇通過(guò)TGF-β1/ADAMTS-1信號(hào)通路抑制肺纖維化[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2013, 29(3): 425-31.

[5] Liu L J, Yu X H, Zhang P. Resveratrol inhibits pulmonary fibrosis through TGF-β1/ADAMTS-1 signaling pathway[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(3): 425-31.

[6] 李婉霜, 張 平, 何平平. 白藜蘆醇對(duì)大鼠肺纖維化逆轉(zhuǎn)作用的研究[J].臨床醫(yī)學(xué)工程, 2012, 19(2):185-7.

[6] Li W S, Zhang P, He P P. Reverse of bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats by the effects of resveratrol[J].ClinMedEngin, 2012, 19(2):185-7.

[7] 何平平, 王在巖, 張 平. 不同劑量白藜蘆醇對(duì)博來(lái)霉素致大鼠肺纖維化的干預(yù)比較[J].臨床肺科雜志, 2012, 17(1):3-5.

[7] He P P, Wang Z Y, Zhang P. Comparison of intervention with different dosages of resveratrol on rats of pulmonary fibrosis induced by bleomycin[J].ClinLungJ, 2012, 17(1):3-5.

[8] 王在巖, 張 平, 何平平, 等. 白藜蘆醇對(duì)博來(lái)霉素致大鼠肺纖維化和NF-κB mRNA 的影響[J] .臨床肺科雜志, 2011, 16 (9): 1315-7.

[8] Wang Z Y, Zhang P, H e P P, et al. Effects of resveratrol on bleomycin-induced pulmonary fibrosis of the rat and expression of NF-κB[J].ClinLungJ, 2011, 16(9): 1315-7.

[9] 王世君, 王興祥, 范芳華, 等. 白藜蘆醇抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2008, 28(4):334-9.

[9] Wang S J, Wang X X, Fan F H, et al. Inhibitory effect of resveratrol on cardiac fibroblast proliferation induced by angiotensin II[J].ChinIntergTCM-WMJ, 28(4):334-9.

[10] 何廣輝, 孫豐源. 白藜蘆醇對(duì)淋巴瘤BJAB細(xì)胞體外增殖及細(xì)胞周期作用的研究[J]. 天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 20(5):360-3.

[10] He G H, Sun F Y. Effects of resveratrol on the proliferation and cell cycle of lymphoma BJAB cellsinvitro[J].JTianjinMedUni, 2014, 20(5):360-3.

[11] 嚴(yán)月華, 徐 麗, 吳劍波, 盛晚香. 白藜蘆醇對(duì)人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤Hut-78細(xì)胞增殖和凋亡影響觀察[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2013, 20(23):1807-11.

[11] Yan Y H, Xun L, Wu J B, Sheng W X. Effect of resveratrol on inducing proliferation and apoptosis of T cell lymphoma cell line Hut-78 cells[J].ChinJCancerPrevTreat, 2013, 20(23):1807-11.

[12] 于明哲, 李 俊, 黃 成, 等. 蜂毒素對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制探討[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2013, 29(7):918-22.

[12] Yu M Z, Li J, Huang C, et al. Inhibitory effect of melittin on growth of human lung fibroblasts[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(7):918-22.

[13] 安 梅, 周 瑾, 陳曉宇. 白藜蘆醇藥理學(xué)作用的研究進(jìn)展[J]. 腫瘤藥學(xué), 2014, 4(4): 242-6.

[13] An M, Zhou J, Chen X Y. Pharmacological activities of resveratrol and protection research progress on the body[J].Anti-tumorPharmacol, 2014, 4(4): 242-6.

[14] Aguirre L, Portillo M P, Hijona E, et al. Effects of resveratrol and other polyphenols in hepatic steatosis[J].WorldJGastroenterol, 2014, 20(23):7366-80.

[15] 李 潔, 熊興耀, 曾建國(guó), 等. 白藜蘆醇的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2013, 15(2): 100-8.

[15] Li J, Xiong X Y, Zeng J G, et al. Advances in resveratrol[J].ChinModTradChinMed, 2013, 15(2): 100-8.

[16] 張 黎, 李 勇, 張 潔, 張秋紅. 白藜蘆醇對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2009, 25 (12): 1109-11.

[16] Zhang L, Li Y, Zhang J, Zhang Q H. Effects of resveratrol on the proliferation and cell cycle of mouse embryonic fibroblasts[J].ChinJCellMolImmunol, 2009, 25 (12): 1109-11.

[17] Zeng G, Zhong F, Li J, et al. Resveratrol-mediated reduction of collagen by inhibiting proliferation and producing apoptosis in human hypertrophic scar fibroblasts[J].BiosciBiotechnolBiochem, 2013, 77(12):2389-96.

[18] 鄭 敏, 張 黎, 劉 靖, 李 勇. 白藜蘆醇對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞周期與凋亡的影響[J]. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志, 2013, 29(1):25-9.

[18] Zheng M, Zhang L, Liu J, Li Y. Effect of resveratrol on the cell cycle and apoptosis of neuroblastoma SH-SY5Yinvitro[J].ChinJNeuroanat, 2013, 29(1):25-9.

[19] 陳加順, 呂俊明, 束永前. 白藜蘆醇對(duì)人肺腺癌 A549細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制研究[J]. 臨床腫瘤雜志, 2011, 16(6):506-10.

[19] Chen J X, Lv J M, Shu Y Q. Effects of resveratrol on cell cycle regulatory processes of human lung adenocarcinoma A549 cells and its mechanism[J].ChinClinOnco, 2011, 16(6):506-10.

[20] 顧生玖, 李美波, 朱開(kāi)梅. 虎杖中白藜蘆醇誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG-2凋亡及其對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014, 15(20):168-72.

[20] Gu S J, Li M B, Zhu K M. Apoptosis of HepG-2 cells induced by resveratrol and its effects on Bcl-2 and Bax protein expression[J].ChinJExpTradMedForm, 2014, 15(20):168-72.

[21] Liu M L, Zhang S J. Effects of resveratrol on the protein expression of survivin and cell apoptosis in human gastric cancer cells[J].JBuon, 2014, 19(3):713-7.

Inhibitory effects of resveratrol on human pulmonary fibroblast line MRC-5 growth

LIU Li-jing1, QIAN Hong1, ZHANG Ping2,WANG Zai-yan2

(1.DeptofClinicalMedicine,HunanUniversityofMedicine,HuaihuaHunan418000,China；2.DeptofRespiration,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China)

Aim To explore the inhibitory effects of resveratrol (Res) on human pulmonary fibroblast growth, and its related mechanisms. Methods Human pulmonary fibroblasts MRC-5 were culturedinvitroas research object. These cells were inoculated with 20 μL dimethyl sulfoxide (DMSO) as well as 0, 12.5, 25 50, 100 and 200 μmol·L-1Res for 24, 48 and 72 h, respectively. Inhibitory rate of cellular proliferation was analyzed by MTT. In addition, these cells were treated with 20 μL DMSO (medium group) as well as 50 and 100 μmol·L-1Res for 48 h, respectively. Subsequently, cell cycle and apoptotic rate were measured using flow cytometry. Apoptosis index (AI) was detected through terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The mRNA and protein expression of cell cycle protein D1 (Cyclin D1) and cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) was detected through fluorescence real-time quantitative PCR and Western blot, respectively. Western blot was used to measure the protein expression of Bcl-2 and Bax. Results With the increase of Res concentrations and prolongation of treated time, inhibitory rate of cellular proliferation was gradually elevated (P<0.01). After 48 h of co-culture, DNA ratio of S and G2/M periods, mRNA and protein levels of Cyclin D1 and CDK4, and Bcl-2 protein levels were significantly decreased while DNA ratio of G0/G1period, AI, apoptotic rate and Bax protein levels were significantly increased in 50 and 100 μmol·L-1Res-treated groups as compared to medium group (P<0.01). Moreover, the effects 100 μmol·L-1Res were better than those of 50 μmol·L-1Res (P<0.01). Conclusion Res can suppress the proliferation of MRC-5 cells, which may be associated with blockade of cell cycle progression and induction of cell apoptosis.

resveratrol; human pulmonary fibroblasts; proliferation；cell cycle；apoptosis；Cyclin D1

時(shí)間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.017.html

2015-01-07,

2015-02-05

湖南省教育廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No 10A107)；湖南省教育廳優(yōu)秀青年資助項(xiàng)目(No 14B142)

劉理靜(1976-)，男，碩士生，副主任醫(yī)師，研究方向：肺纖維化的防治，E-mail：wsfyz-000@163.com； 張 平(1954-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：肺纖維化的防治，通訊作者，Tel:0734-8281948，E-mail:zp9707@sohu.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.017

A

1001-1978(2015)05-0673-07

R284.1；R329.24；R329.25；R563.130.22