林 巖，肖 薇，李 波，金 莉，王國忠，王 珺，趙雅君，徐長慶，劉吉成

(齊齊哈爾醫(yī)學院 1.醫(yī)藥研究所、2.病理生理教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.哈爾濱醫(yī)科大學病理生理教研室， 黑龍江 哈爾濱 150086；4.黑龍江中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合博士后流動站，黑龍江 哈爾濱 150040)

二氟甲基鳥氨酸對異丙腎上腺素誘導的心肌細胞肥大與凋亡的影響

林 巖1，2，4，肖 薇2，李 波2，金 莉2，王國忠2，王 珺2，趙雅君3，徐長慶3，劉吉成1

(齊齊哈爾醫(yī)學院 1.醫(yī)藥研究所、2.病理生理教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.哈爾濱醫(yī)科大學病理生理教研室， 黑龍江 哈爾濱 150086；4.黑龍江中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合博士后流動站，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的 探討二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylornithine，DFMO)對異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)誘導的心肌細胞肥大和凋亡的影響。方法 實驗分為4組：Control組、ISO組、ISO+ DFMO組和ISO+DFMO+Pu 組。利用ISO建立心肌細胞肥大模型，0.5 mmol·L-1DFMO和0.5 mmol·L-1腐胺預處理后檢測ANP基因表達和心肌細胞表面積；檢測各組細胞培養(yǎng)液中LDH活性和MDA含量，Annexin V/PI法檢測心肌細胞凋亡率，real time-PCR和Western blot檢測Bcl-2和Bax基因及蛋白表達。結果 與ISO組相比，DFMO預處理后心肌細胞表面積和ANP基因表達降低(P<0.05)，培養(yǎng)液中LDH和MDA釋放量均下降 (P<0.05)，心肌細胞凋亡率降低(P<0.05)；同時，DFMO上調Bcl-2基因和蛋白水平(P<0.05)，上調Bcl-2/Bax比值 (P<0.05)，下調Bax基因和蛋白水平(P<0.05)。結論 DFMO對ISO誘導的心肌細胞肥大和凋亡有保護作用，其機制可能與Bcl-2和Bax 表達有關。

多胺；二氟甲基鳥氨酸；心肌肥大；細胞凋亡；Bcl-2；Bax

多胺是包括腐胺、精脒和精胺在內的一類小分子脂肪族化合物，在生物體的各種組織細胞內廣泛存在，其作為體內的代謝調控物質，在細胞增殖分化中發(fā)揮重要作用[1]。近年研究表明，多胺在細胞凋亡過程中也扮演著重要角色[2]。鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)是多胺合成途徑中的關鍵限速酶。二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylornithine，DFMO)已成為公認的最有效的ODC特異性抑制劑，它同鳥氨酸的結構類似，可作為ODC的底物進行脫羧反應，導致ODC發(fā)生不可逆的結構改變，明顯抑制多胺含量[3]。

我們前期研究表明[4-5]，異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO) 誘導心肌肥大的同時上調ODC蛋白表達水平，多胺含量增加，從而激活ODC/多胺通路，本研究將進一步探討ODC特異性抑制劑DFMO 對病理性心肌肥大細胞凋亡的保護作用，為其在心肌肥厚的臨床防治提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物新生2～5 d SD大鼠乳鼠共30只，雌雄不拘，由齊齊哈爾醫(yī)學院動物研究所提供。

1.2 藥品與試劑TRIzol試劑和real-time PCR反轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司；ISO、DFMO、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；DEME培養(yǎng)基、新生牛血清購自Gibco；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH )試劑盒、丙二醛(malonic dialdehyde, MDA )測試盒購于南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術公司；β-actin 抗體購自美國Santa Cruz生物公司；Bcl-2、Bax一抗和辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔和兔抗鼠二抗購自武漢博士德生物科技有限公司。

2 方法

2.1 乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)取新生乳鼠，無菌條件下開胸取心，D-Hanks液洗去殘血，剪成1 mm3大小碎片，加入0.25%胰蛋白酶，分次消化制成單細胞懸液后，正常培養(yǎng)液于37℃、5% CO2飽和濕度條件下差速貼壁1 h后，調整細胞濃度接種到培養(yǎng)板上，置入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，細胞貼壁24 h后出現自發(fā)性同步搏動，于接種48 h 后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 實驗分組培養(yǎng)4 d的心肌細胞隨機分為4組：① Control組：無血清DMEM培養(yǎng)液； ② ISO組：加入ISO，終濃度為1 μmol·L-1，作用48 h；③ ISO+DFMO 組：細胞在加入ISO前24 h加入0.5 mmol·L-1DFMO；④ ISO+DFMO+Pu 組：細胞在加入ISO前24 h加入DFMO和腐胺(putrescine, Pu), 終濃度分別為0.5 mmol·L-1。

2.3 心肌細胞表面積測定將細胞以1×105·L-1密度接種于6 孔板中，24 h后爬片，藥物干預后95% 乙醇固定15 min，行HE染色。采用Leica2Q500 圖像分析系統(tǒng)測定心肌細胞表面積，隨機選取5個視野，每個視野測定5個細胞，取其平均值。

2.4 實時定量PCR檢測基因表達按照TRIzol試劑說明書提取心肌細胞總RNA。參照TaKaRa 公司提供的real time-PCR 試劑盒說明書進行逆轉錄反應，由上海生工生物工程有限公司設計合成特異性引物用于定量檢測ANP、Bcl-2和Bax 基因的表達。ANP上游引物：5’- GGGAAGTCAACCCGTCTCA -3′，下游引物：5’- GGGCTCCAATCCTGTCAAT -3′；Bcl-2上游引物：5′-TGAACCGGCATCTGCACAC-3′，下游引物：5′-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3′； Bax上游引物：5′-AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG-3′，下游引物5′-GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3′。同時采用β-actin為內參，mRNA的表達倍數改變采用2ΔCt表示。

2.5 Western blot 檢測蛋白表達取各組心肌細胞，加裂解液，離心后吸取上清液，Bradford法測定蛋白質濃度。各組取30 μg上樣，SDS-PAGE 電泳，蛋白轉至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h后分別加入一抗Bcl-2、Bax多克隆抗體和 β-actin 單克隆抗體，濃度均為1 ∶500，4℃孵育過夜，相應二抗孵育1.5 h，濃度1 ∶5 000?；瘜W發(fā)光ECL顯色。電泳成像系統(tǒng)定量掃描分析，結果以 β-actin 校正。

2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率采用 Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒檢測心肌細胞凋亡。細胞培養(yǎng)48 h后，PBS清洗后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙錠(PI)至細胞懸液中，輕輕搖勻，置冰浴中反應10 min，加入400 μL預冷binding buffer至樣品中，1 h內上機檢測(激發(fā)光488 nm，發(fā)射光578 nm)，各組陽性細胞百分率表示細胞凋亡率。

2.7 細胞培養(yǎng)液中LDH 和MDA含量檢測分別按各自檢測試劑盒操作說明書步驟，取各組培養(yǎng)液上清，測定LDH和MDA釋放量。

3 結果

3.1 DFMO抑制ISO誘導的心肌細胞肥大由Tab 1顯示，與Control相比，ISO作用48 h后心肌細胞表面積明顯增加 (P<0.01)，ANP 基因表達增高(P<0.05)；DFMO預處理后明顯抑制心肌細胞表面積(P<0.01)，同時ANP基因表達降低(P<0.01)。與ISO+DFMO 組比較，ISO+DFMO+Pu組心肌細胞ANP 基因表達增加(P<0.05)，細胞表面積略有增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

GroupCellsurfacearea/μm2·cell-1ANP/β-actinControl3904.4±218.31.00±0.2ISO4730.2±202.5**1.48±0.3*ISO+DFMO4043.6±246.7##1.16±0.2##ISO+DFMO+Pu4692.6±235.91.41±0.2▲

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsISO group;▲P<0.05vsISO+DFMO group

3.2 DFMO減少細胞培養(yǎng)液中LDH活性和MDA含量Tab 2結果可見，ISO作用心肌細胞后 LDH 和 MDA 釋放量均明顯增加 (P<0.01)，表明ISO誘導心肌細胞肥大的同時伴有細胞損傷。與ISO組相比，DFMO預處理后，LDH 和 MDA 釋放量均降低(P<0.05)，表明心肌細胞損傷有所減輕，補充外源性腐胺后，LDH 和 MDA 釋放量增加 (P<0.05)。

3.3 DFMO抑制心肌細胞凋亡Annexin V/PI 凋亡檢測結果表明(Tab 2)，ISO組與Control組比較，心肌細胞凋亡率增加 (P<0.05)。 DFMO干預后，心肌細胞凋亡率下降 (P<0.05)， 補充外源性腐胺后，心肌細胞凋亡率增加 (P<0.05) 。

Tab 2 Effect of DFMO on the contents of LDH and MDA in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsISO group;▲P<0.05vsISO+DFMO group

3.4 DFMO對心肌細胞Bcl-2和Bax基因表達的影響實時定量PCR結果顯示(Fig 1)，ISO誘導心肌細胞肥大后Bcl-2基因表達下降(P<0.05)， Bax基因表達增加(P<0.05)。DFMO預處理后，Bcl-2基因表達上調，Bax基因表達下調(P<0.05)。與ISO+DFMO組比較，ISO+DFMO+Pu組逆轉了Bcl-2和Bax基因表達(P<0.05)。

3.5 DFMO對心肌細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響Western blot 結果表明(Fig 2、3)，ISO作用心肌細胞可下調Bcl-2蛋白表達(P<0.05)，增加Bax 蛋白表達(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值明顯下降(P<0.01)。DFMO預處理后，Bcl-2 蛋白水平上調，Bax 蛋白水平下調(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯增加(P<0.01)。 補充外源性腐胺后，Bcl-2蛋白水平下調，同時Bax 蛋白水平上調(P<0.05)。Bcl-2/Bax比值降低明顯(P<0.01)。

Fig 1 Effect of DFMO on the gene expression of Bcl-2

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsISO group;▲P<0.05vsISO+DFMO group

Fig 2 Effect of DFMO on the protein expression of Bcl-2

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsISO group;▲P<0.05vsISO+DFMO group

Fig 3 Effect of DFMO on Bcl-2/Bax ratio of

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsISO group;▲▲P<0.01vsISO+DFMO group

4 討論

心肌肥大是心律失常、高血壓、心力衰竭等臨床多種心血管疾病的共同病理過程。病理情況下，長期激動β腎上腺素受體可誘發(fā)心肌細胞肥大、凋亡以及心肌細胞壞死等心肌重塑[6]。本研究運用異丙腎上腺素誘導乳鼠心肌細胞肥大的同時，心肌細胞凋亡率明顯增加，同時伴有細胞培養(yǎng)液中LDH和MDA 漏出量增加，表明心肌肥大的發(fā)展與體內抗氧化功能減弱以及氧自由基的增多密切相關。DFMO預處理后明顯抑制心肌肥大和細胞凋亡，降低LDH和MDA漏出量，推測DFMO可能通過減少心肌細胞氧自由基生成，降低膜脂質過氧化，增加膜穩(wěn)定性和有氧氧化，從而保護心肌細胞。

生理條件下，多胺能通過其多價正電荷與核苷酸、蛋白質等生物分子相互作用，從而影響和調節(jié)其功能。生物體內存在一套完整的機制以調節(jié)多胺的濃度并維持多胺池的動態(tài)平衡。小分子多胺參與眾多病理過程，如腫瘤細胞多胺水平增加[7]，腦組織多胺穩(wěn)態(tài)失衡[8]。鳥氨酸脫羧酶是多胺合成反應的限速酶，催化鳥氨酸轉變?yōu)楦?，DFMO作為鳥氨酸脫羧酶的特異性抑制物，通過抑制鳥氨酸脫羧酶活性降低細胞內多胺水平，從而減弱許多組織的增生反應[9]。

近年研究發(fā)現，心肌細胞凋亡可能參與心血管疾病，如心肌梗死、心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展。心肌細胞凋亡導致心肌細胞數量持續(xù)減少，是心肌肥大向心力衰竭轉化的重要機制，細胞凋亡與眾多基因調控有關[10]。抑制肥大心肌的細胞凋亡率是防治心力衰竭的有效藥物靶點之一。關于多胺對心肌細胞凋亡的影響，國內外報道甚少。Cetrullo等[11]最新研究表明，去甲腎上腺素誘導心肌細胞多胺合成限速酶ODC活性增加，同時伴心肌細胞凋亡。ODC特異性抑制劑DFMO通過介導AMP-激活的蛋白激酶等信號轉導通路，從而抑制心肌細胞凋亡。Tipnis 等[12]研究表明DFMO通過抑制ODC活性，降低多胺含量從而抑制心肌細胞肥大和纖維化。本研究結果與上述報道相似，但DFMO抑制心肌細胞凋亡時，如何影響凋亡相關基因Bcl-2與Bax表達未見報道。

Bcl-2 蛋白C 末端由21個疏水氨基酸組成鏈狀結構, 存在于線粒體外膜及胞質中。Bcl-2 通過抑制線粒體膜通透性轉變孔的開放，減少細胞色素C 及凋亡因子的釋放，并提高線粒體的鈣緩沖能力。Bcl-2 家族對線粒體內一些促凋亡因子的釋放具有重要的調控作用，發(fā)揮抗細胞凋亡的功能[13]。Bax 是Bcl-2的同源基因，它的過表達可拮抗Bcl-2的保護效應，從而促進細胞凋亡[14]。促凋亡基因Bax 可以與Bcl-2 形成異二聚體, 因此Bax 與Bcl-2 之間的比例可能決定了細胞凋亡的敏感性。本研究表明，ISO促進心肌細胞凋亡的同時，Bcl-2/Bax比值明顯下降。DFMO預處理抑制心肌細胞凋亡率，同時上調 Bcl-2/Bax比值。補充多胺后逆轉了DFMO對心肌細胞Bcl-2和Bax的蛋白表達。結果提示DFMO可能通過抑制促凋亡基因，同時上調抗凋亡基因的表達，保護線粒體的結構和功能，并進而發(fā)揮細胞保護作用。 Tantini 等[15]研究發(fā)現，DFMO 通過耗竭H9c2心肌細胞內多胺含量，對缺血誘導的心肌細胞凋亡發(fā)揮保護作用，其機制與抑制線粒體細胞色素C 釋放和caspase激活關系密切，補充外源性腐胺后拮抗DFMO對心肌的保護作用。結合我們的研究表明多胺在心肌缺血和心肌肥大的細胞凋亡中均發(fā)揮重要作用。

綜上所述，DFMO抑制異丙腎上腺素誘導的心肌細胞肥大及凋亡，其作用與Bcl-2、Bax基因和蛋白表達密切相關。多胺在心血管方面的作用具有潛在的開發(fā)價值，許多問題還需深入研究。

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Effects of difluoromethylornithine on the cardiomyocytes hypertrophy and apoptosis induced by isoproterenol

LIN Yan1,2,4, XIAO Wei2,LI Bo2, JIN Li2, WANG Guo-zhong2, WANG Jun2，ZHAO Ya-jun3，XU Chang-qing3，LIU Ji-cheng1

(1.InstituteofMedicine, 2.DeptofPathophysiology,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar,Heilongjiang161006,China;3.DeptofPathophysiology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China; 4.ITCWMPostdoctorResearchCenterinHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Aim To study the effects of difluoromethylornithine (DFMO) on cardiomyocytes hypertrophy and apoptosis induced by isoproterenol (ISO). Methods The cardiomyocytes were divided into four groups randomly：Control group, ISO group, ISO+DFMO group and (ISO+DFMO+Putrescine) group. The hypertrophic model of cardiomyocytes was induced by ISO, the cardiomyocytes were pretreated with 0.5 mmol·L-1DFMO and 0.5 mmol·L-1putrine, the gene expression of ANP, the surface area of cardiomyocytes and the contents of LDH and MDA were measured. Apoptotic value of cardiomyocytes was observed by Annexin V/PI, the gene and protein expressions of Bcl-2 and Bax were detected by real-time PCR and Western blot. Results Compared with ISO group, the cell surface area, the gene level of ANP, the apoptosis value of cardiomyocytes and the contents of LDH and MDA were decreased in ISO+DFMO group (P<0.05). Meanwhile, DFMO pretreatment upregulated the gene and protein expressions of Bcl-2 (P<0.05), increased the ratio of Bcl-2/Bax (P<0.05), downregulated the gene and protein levels of Bax (P<0.05). Conclusion The cardiomyocyte hypertrophy and apoptosis induced by ISO can be protected by DFMO pretreatment, which may be associated with the expression of apoptotic gene Bcl-2 and Bax.

polyamine; difluoromethylornithine; cardiac hypertrophy; apoptosis;Bcl-2; Bax

時間：2015-4-15 15:44 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.016.html

2015-02-22,

2015-03-27

國家自然科學基金資助項目(No 81100170, 81170178)；黑龍江省教育廳面上項目(No 12521617)；齊齊哈爾醫(yī)學院科研基金資助項目(No QY2014Z-08)

林 巖(1975-)，女，博士，教授，研究方向：心血管疾病的發(fā)病機制和防治策略，Tel：0452-2663126，E-mail：yanlinqqhr@aliyun.com； 劉吉成(1958-),男,博士,教授,博士生導師,研究方向:分子藥理學和腫瘤藥理學,通訊作者,Tel：0452-6731303,Fax:0452-6712437,E-mail:qyybliu@126. com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.016

A

1001-1978(2015)05-0668-05

R-332；R322. 11；R329. 25；R542. 202；R977.3；R977.6