陳美娟，趙若琳，郭園園，寧利敏，張 旭

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

麥冬皂苷B對A549細(xì)胞株體外黏附、侵襲及遷移的抑制作用及機(jī)制研究

陳美娟，趙若琳，郭園園，寧利敏，張 旭

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

目的 探究麥冬皂苷B (ophiopogonin-B, OP-B)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549黏附、侵襲、遷移的作用及其機(jī)制。方法 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)分別檢測細(xì)胞黏附、遷移和侵襲能力。通過熒光實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測OP-B對A549細(xì)胞中MMP-2/9 mRNA表達(dá)水平的調(diào)控，Western blot法檢測細(xì)胞中MMP-2/9蛋白及其上游調(diào)控蛋白Akt及其磷酸化水平的變化。結(jié)果 10 μmol·L-1濃度的OP-B能明顯抑制A549細(xì)胞黏附、侵襲和遷移，同時能抑制其MMP-2/9 mRNA及蛋白水平的表達(dá)，并抑制其上游p-Akt的表達(dá)。 結(jié)論 OP-B有效抑制A549細(xì)胞黏附、侵襲和遷移，其作用與下調(diào)MMP-2/9 mRNA和蛋白水平的表達(dá)及抑制其上游Akt的磷酸化有關(guān)。

麥冬皂苷B; 非小細(xì)胞肺癌; 黏附; 侵襲; 遷移; 基質(zhì)金屬蛋白酶-2; 基質(zhì)金屬蛋白酶-9

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC) 是肺惡性腫瘤的主要病理類型，也是全世界范圍內(nèi)癌癥致死的主要原因之一。盡管在 NSCLC 的臨床和實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)方面的研究取得了較大進(jìn)展，但是其預(yù)后仍不理想，目前其5 年生存率僅為11%左右[1]。臨床上將近一半的患者在確診時已進(jìn)入晚期，并已發(fā)生遠(yuǎn)處臟器的轉(zhuǎn)移[2]。

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移受多因素、多步驟調(diào)控，主要包括腫瘤細(xì)胞間黏附力降低，與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)間黏附力增強(qiáng)，通過降解ECM和基底膜，其遷移、侵襲能力增強(qiáng)，從而易于進(jìn)入血流或淋巴系統(tǒng)，并最終到達(dá)靶器官形成新的腫瘤生長[3]。在此過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白，尤其是MMP-2和MMP-9的高表達(dá)能明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。另外，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MMP-2和MMP-9靶基因表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[4]。

麥冬皂苷B(ophiopogonin-B, OP-B)是從中藥麥冬中分離提取的一種單體，研究表明其對于多種NSCLC細(xì)胞株均具有明顯的增殖抑制作用[5]。近年國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制PI3K/Akt通路，OP-B能誘導(dǎo)NSCLC、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬[5-6]。但對其在抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移方面的研究尚未開展。本實(shí)驗(yàn)旨在探究OP-B對肺腺癌細(xì)胞株A549的黏附、侵襲和遷移能力的影響及其作用機(jī)制，為OP-B抑制NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 肺腺癌A549細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2 主要試劑 麥冬皂苷-B購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司 (ZL20110412B)，用二甲亞砜(DMSO)配成10 mmol·L-1濃度的貯液備用，細(xì)胞中使用時DMSO的最終濃度小于0.01%。胎牛血清及DMEM/F12培養(yǎng)液購自Gibco公司；胰酶、Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)、牛血清白蛋白(BSA)、凝膠配置試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自Millipore公司；Transwell小室購自Corning公司；MMP-2、MMP-9、p-Akt (Ser473)、β-actin一抗及羊抗兔、羊抗鼠二抗均購自Cell Signaling公司；TRIzol購自Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購自Fermentas公司；Real time PCR Master Mix (SYBR Green) 購自Toyobo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 96孔培養(yǎng)板包被：每孔加入CollagenⅠ溶液50 μL，置37℃、5% CO2孵箱中孵育1 h；PBS洗2次，加入3% BSA 0.2 mL，孵育2 h，PBS再洗2次，備用。分別取不同濃度的OP-B(0、5、10 μmol·L-1) 作用細(xì)胞24 h，經(jīng)洗滌、消化后用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×108·L-1，分別加入到包被過的96孔板，每孔100 μL，每組設(shè)5個平行復(fù)孔，37 ℃、5% CO2條件下溫育2 h。棄去各孔培養(yǎng)液，PBS沖洗除去未黏附細(xì)胞，每孔加50 μL MTT使用液(PBS溶解，1 g·L-1)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱溫育3 h。吸棄MTT使用液，每孔加DMSO 150 μL，溶解結(jié)晶后，酶標(biāo)儀檢測各孔的 OD570值。黏附抑制率(IR)/%= (1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell小室纖維膜孔徑為8 μm，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，上室加入100 μL不含胎牛血清的培養(yǎng)液，然后按照每毫升1×105個細(xì)胞的密度在上室加入OP-B(0、5、10、20 μmol·L-1)處理后的細(xì)胞懸液30 μL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，取出濾膜，甲醇固定，姬姆薩染色，顯微鏡下每張濾膜隨機(jī)取5個視野(× 200)拍照，并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.4 RNA提取和qRT-PCR檢測 使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，通過測定OD260/OD280值檢驗(yàn)其純度和濃度。使用Primer Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行qRT-PCR分析，檢測MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平，結(jié)果用磷酸甘油酸脫氫酶 (GAPDH) 的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。相應(yīng)的引物序列見Tab 1。使用 DA7600 進(jìn)行 qRT-PCR 和數(shù)據(jù)收集。分析qRT-PCR 的結(jié)果并計(jì)算其相對于臨界循環(huán)次數(shù)的值，然后轉(zhuǎn)換為相對 GAPDH 的倍數(shù)改變，采用2-△△Ct法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

Tab 1 qRT-PCR primer

1.2.5 Western blot 檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白變化 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化接種到 6 孔板中，細(xì)胞密度為 5×108·L-1。藥物處理一定時間后，收集細(xì)胞并用 PBS 洗滌 2 次，每孔加入細(xì)胞裂解液 200 μL，12 000 r·min-1離心20 min，收集蛋白并定量。取一定量的蛋白，加入 5×電泳上樣緩沖液，沸水浴變性 5 min，經(jīng) 12% 的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉后，加入一抗 4℃孵育過夜、二抗室溫孵育 1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，滴加 ECL發(fā)光液置于 BioRad 凝膠成像儀中曝光并采集圖像。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料組間比較用 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 OP-B對A549細(xì)胞黏附能力的影響不同濃度的 OP-B (0、5、10 μmol·L-1)分別作用于細(xì)胞 24 h后檢測細(xì)胞的黏附能力。結(jié)果表明，OP-B 作用后，A549細(xì)胞的黏附能力逐漸減弱，即藥物對細(xì)胞的黏附抑制率逐漸升高，并呈濃度依賴性(Tab 2)，與OP-B (5 μmol·L-1)組的細(xì)胞黏附抑制率相比，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

GroupOD570nmTheinhibitionrateofcelladhesion/%Control0.328±0.120OP-B5μmol·L-10.289±0.0111.89OP-B10μmol·L-10.221±0.0432.62**

**P<0.01vsOP-B 5 μmol·L-1group.

2.2 OP-B對A549細(xì)胞侵襲遷移能力的影響用帶Matrigel膠的Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測OP-B對A549細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2.5、5 μmol·L-1的OP-B對A549細(xì)胞的侵襲遷移沒有明顯影響，只有在10 μmol·L-1的濃度下處理細(xì)胞 24 h 后，才能明顯抑制A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力(P<0.01)(Fig 1)。

2.3 OP-B對A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9基因水平的調(diào)控MMPs是一類分解ECM組分的鋅蛋白酶，腫瘤細(xì)胞通過已存在或新形成的結(jié)合位點(diǎn)與ECM結(jié)合，進(jìn)而溶解ECM，最后經(jīng)ECM的缺損向外擴(kuò)散。qRT-PCR進(jìn)一步研究OP-B對A549細(xì)胞中MMP-2/9 mRNA表達(dá)水平的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)OP-B對A549細(xì)胞中MMP-2 和 MMP-9 mRNA表達(dá)水平的抑制呈劑量依賴關(guān)系，與Control組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(Tab 3)。

Fig 1 Effects of OP-B on the invasion and metastasis of A549 cells detected by Matrigel contained transwell chamber assay

The upper figure was the metastasis and invasion cells (SP×200); the lower figure was the analysis compared with control group.A: Control group; B～D: 2.5, 5, 10μmol·L-1OP-B treated group.**P<0.01vscontrol group

GroupMMP-2(2-ΔΔCT)MMP-9(2-ΔΔCT)Control1.000±0.0111.000±0.024OP-B5μmol·L-10.408±0.037**0.618±0.006**OP-B10μmol·L-10.121±0.004**0.107±0.001**

**P<0.01vscontrol group.

2.4 OP-B對A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的影響前面的結(jié)果顯示10 μmol·L-1濃度的OP-B能明顯抑制A549細(xì)胞的黏附和侵襲、遷移，為進(jìn)一步探究OP-B抑制A549細(xì)胞黏附、侵襲和遷移的作用機(jī)制，進(jìn)一步用Western blot法檢測了MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，與其抑制A549細(xì)胞中MMP-2 和MMP-9 mRNA水平的表達(dá)相一致，OP-B對MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)抑制呈時間依賴性，同時，對調(diào)控遷移的上游蛋白Akt的磷酸化具有明顯的抑制作用(Fig 2)。

Fig 2 Effects of OP-B on the expression of p-Akt,Akt, MMP-2 and MMP-9 in A549 cells

3 討論

腫瘤治療失敗的原因主要是復(fù)發(fā)和發(fā)生重要器官的轉(zhuǎn)移。即使同為Ⅰ期的腫瘤患者，NSCLC患者的術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險高于其他腫瘤患者，且預(yù)后也明顯差于其他腫瘤患者[7]。

臨床上，中藥在穩(wěn)定瘤體，防止腫瘤的遷移和復(fù)發(fā)上普遍具有一定的優(yōu)勢，“周氏克金巖方”在肺癌的臨床治療中同樣表現(xiàn)出相關(guān)的抑制NSCLC細(xì)胞遷移的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，麥冬皂苷B是“周氏克金巖方”中代表性的抗癌成分，其對多種NSCLC細(xì)胞株均具有明顯的增殖抑制作用，并能有效誘導(dǎo)肺鱗癌細(xì)胞株 NCI-H157及巨細(xì)胞癌細(xì)胞株 NCI-H460發(fā)生二型程序性死亡[5]，但其對肺癌細(xì)胞黏附、侵襲及遷移的影響有待研究。

本研究首先通過細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)，OP-B能明顯降低A549細(xì)胞的黏附能力，并呈濃度依賴性(Tab 2)。腫瘤細(xì)胞侵襲/遷移能力的研究方法主要有細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell 小室實(shí)驗(yàn)[8]，本研究選擇了含Matrigel膠的Transwell小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥物對A549細(xì)胞侵襲、遷移能力影響的觀察，結(jié)果表明，OP-B在10 μmol·L-1濃度下能有效抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲(Fig 1)。

另外，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜、多步驟的過程，腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶后，通過降解基底膜，向外浸潤、遷移并黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，然后進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并停留于遠(yuǎn)處的血管壁，最終穿過血管侵入ECM形成轉(zhuǎn)移灶[9]。其中，ECM的降解是腫瘤浸潤正常組織及開始轉(zhuǎn)移的基本途徑。研究表明，在這一過程中MMPs發(fā)揮了重要的作用，尤其是MMPs家族成員明膠酶 (MMP-2和MMP-9)，由于其能夠特異性降解基底膜的主要成分Ⅳ型膠原和ECM，在多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10]。

qRT-PCR 和Western blot研究發(fā)現(xiàn)，OP-B作用于A549細(xì)胞后，不僅降低細(xì)胞中MMP-9 和 MMP-2 mRNA水平的表達(dá)，而且下調(diào)細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平的表達(dá)，并呈時間依賴性(Fig 2和Tab 3)。因此，OP-B抑制NSCLC細(xì)胞黏附、侵襲和遷移與抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

此外，Akt可以通過激活MMP-9和MMP-2促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移[11-12]。因此，抑制Akt的表達(dá)被作為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控靶點(diǎn)，并且研究發(fā)現(xiàn)Akt的激活即形成磷酸化的Akt(p-Akt)與NSCLC的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，p-Akt的過表達(dá)可以提高NSCLC黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[13]。本研究表明，OP-B同時能抑制A549細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)(Fig 3)

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次證明了OP-B抑制NSCLC細(xì)胞A549的黏附、侵襲和遷移，其作用與下調(diào)MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)及抑制其上游p-Akt的水平有關(guān)。由此表明，OP-B具有較好的抗NSCLC轉(zhuǎn)移作用，為OP-B的進(jìn)一步藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

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Inhibitory effect of ophiopogonin-B on adhesion,invasion and migration of A549 cellsinvitro

CHEN Mei-juan, ZHAO Ruo-lin, GUO Yuan-yuan, NING Li-min, ZHANG Xu

(NanjingUniversityofChineseMedicine，JiangsuCollaborativeInnovationCenterofTraditionalChineseMedicinePreventionandTreatmentofTumor,Nanjing210023,China)

Aim To explore the inhibitory effects of ophiopogonin-B (OP-B) on cell adhesion, invasion and migration in non-small cell lung cancer (NSCLC) A549 cellsinvitroand its possible mechanism. Methods Cell adhesion assay and transwell chamber assay were used to detect the ability of cell adhesion, migration and invasion. qRT-PCR was used to detect the mRNA levels of MMP-2 and 9. Meanwhile, Western blot assay was performed to determine the protein levels of MMP-2/9 and p-Akt. Results OP-B significantly inhibited the ability of cell adhesion, invasion and migration in A549 cells at the concentration of 10 μmol·L-1(P<0.01). Meanwhile, it inhibited the mRNA and protein levels of MMP-2 and MMP-9 and down-regulated the phosphorylation of Akt (P<0.01). Conclusion OP-B inhibits cell adhesion, invasion and migration in A549 cells through down-regulation of the mRNA and protein expression of MMP-2/ 9, and the inhibitory effect on the expression of p-Akt.

ophiopogonin-B; non-small cell lung cancer; adhesion; invasion; migration; matrix metalloproteinase-2; matrix metalloproteinase-9

時間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.015.html

2015-01-08,

2015-01-29

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No BK20131415)；江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(PAPD)；歐盟第七框架項(xiàng)目(No PIRSES-GA-2013-612589)

陳美娟(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤作用及機(jī)制研究， E-mail：mjchen9680@sina.com； 張 旭(1968-)，女，博士，教授，研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤作用及機(jī)制研究，通訊作者，E-mail：zhangxu@njutcm.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.014

A

1001-1978(2015)05-0660-05

R282.71；R284.1；R329.25；R734.202.2；R977.3