高文凡，陳飛虎，葛金芳，鄧子云，雷 靜，周仁鵬，王志森

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032)

鈣絡(luò)合劑BAPTA-AM對胞外酸化誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬作用的影響及其可能機(jī)制

高文凡，陳飛虎，葛金芳，鄧子云，雷 靜，周仁鵬，王志森

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032)

目的 觀察 BAPTA-AM 對胞外酸化誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬作用的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法 體外使用胰酶-Ⅱ型膠原酶消化法分離提取大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，分為正常組(pH 7.4)、酸化組(pH 6.0)、以及分別經(jīng) BAPTA-AM 處理的正常組和酸化組，激光共聚焦技術(shù)檢測軟骨細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子變化，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法檢測細(xì)胞自噬基因 Beclin-1、ULK1 mRNA 的表達(dá)，Western blot 法檢測自噬蛋白 LC3 的表達(dá)，吖啶橙染色分析細(xì)胞自噬溶酶體形成情況。結(jié)果 與 pH 7.4 正常組比較，pH 6.0 酸化刺激明顯增加大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi) Ca2+的濃度，且自噬標(biāo)志物 Beclin-1、ULK1 mRNA 及 LC3Ⅱ 蛋白表達(dá)均明顯升高，酸性自噬溶酶體形成增多，同時(shí)酸化刺激能引起 CaMKKβ 及 p-AMPK 蛋白表達(dá)水平增高，磷酸化蛋白 p-mTOR 水平明顯降低。BAPTA-AM 酸化組自噬水平和 CaMKKβ 及 p-AMPK 表達(dá)明顯降低，p-mTOR 表達(dá)明顯升高。結(jié)論 BAPTA-AM 能明顯減弱胞外酸化誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞自噬作用，其機(jī)制可能與抑制胞內(nèi)Ca2+有關(guān)。

BAPTA-AM；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；細(xì)胞自噬；Ca2+；胞外酸化

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA) 是一種慢性、系統(tǒng)性不明病因的自身免疫性疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康，其中關(guān)節(jié)軟骨和骨組織破壞是其致殘的根本原因[1]。軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)唯一存在的細(xì)胞類型，其在軟骨細(xì)胞外基質(zhì) (extracellar matrix, ECM) 的合成及修復(fù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在RA等一些病理?xiàng)l件下，軟骨細(xì)胞代謝異?？梢灾苯訉?dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)和功能的改變。自噬(autophagy)是一種細(xì)胞依賴溶酶體的自我代謝過程，通過更新和降解一些長壽命、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器等來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[2]。眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，自噬活化不僅可以為細(xì)胞提供能量抵御代謝應(yīng)激等保護(hù)作用，同時(shí)亦發(fā)現(xiàn)其與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，受到廣泛關(guān)注[3]。且有研究證實(shí)，在RA進(jìn)程中存在著自噬的活化，但是軟骨細(xì)胞自噬的活化在RA進(jìn)程中具體的保護(hù)或破壞作用目前仍然存在著爭議[4]。

BAPTA-AM [1，2-bis ( 2-aminophenoxy) ethane-N，N，N′N′-tetraacetic acid]是一種高選擇性高效的鈣絡(luò)合劑，廣泛被用于控制細(xì)胞內(nèi)鈣水平，能有效降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，是一種公認(rèn)的科研工具藥物[5]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子與細(xì)胞自噬有著密切的關(guān)系，游離鈣離子既可以誘導(dǎo)自噬的活化，亦可抑制自噬的發(fā)生，其具體的作用尚不明確[6]。

本課題組前期研究結(jié)果表明，胞外酸化(pH 6.0)可以明顯誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的發(fā)生，但機(jī)制不明[7]。本研究以大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，胞外酸化誘導(dǎo)細(xì)胞自噬活化，探究 BAPTA-AM 對軟骨細(xì)胞自噬作用的影響及其可能機(jī)制，揭示胞外酸化誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞自噬過程細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度[Ca2+]i與細(xì)胞自噬的可能關(guān)系。 1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF 級 Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂，體質(zhì)量180～200 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：皖動準(zhǔn)字 01 號。

1.2 藥物與試劑BAPTA-AM 購自日本 Dojindo 公司(C34H40N2O18，分子量764.68)；抗 LC3 抗體購自 Cell Signaling Technology 公司；抗 AMPKa1 抗體、抗 p-AMPKa1 抗體和抗 CaMKKβ 抗體購自 Biosynthesis 公司；抗 β-actin 抗體、抗 mTOR 抗體和抗 p-mTOR 抗體購自 Santa Cruz 公司；胎牛血清購自Gibco 公司；Ⅱ型膠原酶購自 Sigma 公司；高糖 DMEM 液體培養(yǎng)基購自 Hyclone 公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG 為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；胰蛋白酶消化液、D-Hanks 液購自碧云天公司； TRIzol 試劑購自 Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑盒和 SYBR Green 染料購自 Fermentas 公司；ECL 顯色試劑盒購自 Thermo Scientific 公司。

1.3 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離[8]，接種入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。置于 37℃、5 % CO2孵育箱中培養(yǎng) 48 h 后首次換液。每隔 2～3 d更換培養(yǎng)液 1 次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底 70%～90 %時(shí)，即可開始實(shí)驗(yàn)。

1.4 軟骨細(xì)胞自噬誘導(dǎo)及藥物處理軟骨細(xì)胞分組如下：pH 7.4 正常組、 pH 6.0 酸化組、 pH 7.4 + BAPTA-AM (10 μmol·L-1)組、pH6.0 + BAPTA-AM(10 μmol·L-1) 組。細(xì)胞給予相應(yīng)處理后，酸化處理組加入 pH 6.0 的培養(yǎng)基培養(yǎng) 3 h，收集細(xì)胞，檢測 BAPTA-AM 對酸化誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬的影響。

1.5 激光共聚焦檢測大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 濃度將軟骨細(xì)胞接種于激光共聚焦專用細(xì)胞培養(yǎng)皿中，藥物處理后，用 Hanks 液沖洗 2 遍, 將10 μmol·L-1Fluo-3/AM 和 0.02% F-127 的 100 μL 混合工作液滴于平皿中央, 37℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中避光孵育 30 min, 再用 Hanks 液沖洗蓋玻片 3 遍，保留少許 Hanks 液于皿內(nèi)平衡細(xì)胞 10 min，于10 min 內(nèi)檢測細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度。激光共聚焦顯微鏡下動態(tài)掃描細(xì)胞 20 s，用微量加樣器將 pH 6.0 的細(xì)胞外液滴注到平皿中，動態(tài)觀察胞內(nèi) Ca2+的熒光強(qiáng)度變化。激發(fā)光波長為 488 nm、發(fā)射光波長 525 nm。

1.6 軟骨細(xì)胞自噬水平檢測

1.6.1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測軟骨細(xì)胞 Beclin-1 、ULK1 mRNA 表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組同“1.4”。相應(yīng)藥物處理后，按 TRIzol 三步法提取細(xì)胞總 RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書和引物反應(yīng)條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和目的基因擴(kuò)增，GAPDH 為內(nèi)標(biāo)。引物序列詳見 Tab 1。反應(yīng)體系為 10 μL，其中 SYBR Green Mix (2×) 5 μL， cDNA 0.5 μL，引物各 0.3 μL，用無酶水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為：Step1：95℃，10 min; Step2：95℃，15 s； 60 ℃，30 s；72℃，30 s; 45 cycles。

1.6.2 Western blot 法檢測自噬蛋白 LC3 的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組同“ 1.4”。相應(yīng)藥物處理后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷 PBS 洗滌 3 遍，每瓶加入 400 μL RIPA 裂解液(含 10 % PMSF)裂解 30 min，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 1.5 mL EP 管中，離心取上清，使用 BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。將上清與上樣緩沖液按 4 ∶1的比例進(jìn)行分裝，100℃煮10 min 變性，-80℃保存待用。等量的蛋白樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 膠分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。TBST 洗脫 10 min。室溫下用含 5 % 脫脂奶粉(TBST 溶解)封閉 3 h。隨后加入一抗(1 ∶500)4℃孵育過夜。TBST 洗脫 3 次，加入相應(yīng)的二抗，孵育 1 h，漂洗 3 次。將 PVDF 膜用化學(xué)發(fā)光劑 ECL 染色，曝光拍照。結(jié)果采用 Image-Pro Plus 圖像分析管理系統(tǒng)分析。

Tab 1 Oligonucleotide primer sequences used for quantitative real-time PCR analysis

1.6.3 吖啶橙(acridine orange，AO)染色分析酸性自噬囊泡 實(shí)驗(yàn)分組同“1.4”。相應(yīng)處理后，PBS 洗滌2次，用AO染液進(jìn)行染色(最終濃度為 2 mg·L-1)，室溫避光 15 min，然后用 PBS 洗滌 2 次，熒光顯微鏡觀察酸性囊泡自噬體。

1.7 Western blot 法檢測CaMKKβ、AMPKa1、p-AMPKa1、mTOR、p-mTOR蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分組同“1.4”。試驗(yàn)步驟同“1.6.2”。

2 結(jié)果

2.1 BAPTA-AM 對胞外酸化誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的影響

2.1.1 BAPTA-AM 對LC3 蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果如Fig 1所示，與 pH 7.4 正常組相比，酸化刺激組 ( pH 6.0 ) 軟骨細(xì)胞 LC3Ⅱ 蛋白表達(dá)明顯增加，且差異具有顯著性(P<0.01)。與酸化組比較，BAPTA-AM 處理組可明顯下調(diào)LC3Ⅱ 蛋白水平(P<0.01)，但是 BAPTA-AM對正常組細(xì)胞的 LC3Ⅱ 蛋白表達(dá)無明顯影響。

2.1.2 BAPTA-AM 對 Beclin-1、ULK1 mRNA 表達(dá)的影響 如Fig 2 所示，酸化刺激組 (pH 6.0) 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 Beclin-1、ULK1 mRNA 表達(dá)與正常組相比較明顯增加(P<0.01)。與酸化組比較，BAPTA-AM 處理組可明顯降低 pH 6.0 組細(xì)胞 Beclin-1、ULK1 mRNA 表達(dá)(P<0.01)。

2.1.3 BAPTA-AM 對自噬囊泡的影響 AO染色觀察自噬關(guān)鍵的形態(tài)學(xué)特征酸性自噬溶酶體的形成，結(jié)果如 Fig 3 所示，與正常組(Fig 3A)相比，pH 6.0酸化刺激能明顯增加酸性自噬溶酶體的形成(Fig 3C)；BAPTA-AM 能夠明顯減少酸性自噬溶酶體的形成(Fig 3D)。

Fig 1 Effects of BAPTA-AM on expressions of LC3 in acid-induced articular chondrocytes(n=3)

**P<0.01vspH 7.4 normal group；##P<0.01vspH 6.0 group

Fig 2 Effects of BAPTA-AM on expressions of Beclin-1 and ULK1 in acid-induced articular chondrocytes(n=3)

**P<0.01vspH 7.4 normal group；##P<0.01vspH 6.0 group

2.2 BAPTA-AM 對胞外酸化誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響激光共聚焦結(jié)果顯示，pH 7.4 正常組軟骨細(xì)胞，前、中、后各時(shí)段大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞熒光強(qiáng)度基本沒有變化(Fig 4A)；給予 BAPTA-AM 后對細(xì)胞胞質(zhì) Ca2+濃度無明顯影響(Fig 4B)。pH 6.0 酸化刺激組軟骨細(xì)胞，酸化刺激前細(xì)胞胞質(zhì) Ca2+濃度無明顯變化，酸化刺激導(dǎo)致細(xì)胞 Ca2+明顯增強(qiáng)，隨后熒光開始減弱(Fig 4C)；在給予 BAPTA-AM 后，酸化刺激對細(xì)胞胞質(zhì) Ca2+影響較小(Fig 4D)；數(shù)據(jù)分析后結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞熒光變化曲線接近平坦，酸化誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中熒光曲線先明顯升高后降低，BAPTA-AM 處理后軟骨細(xì)胞中熒光曲線較酸化組平坦。

Fig 3 Effects of BAPTA-AM on acid-induced acidic vesicle formation of autophagic vacuoles of articular chondrocytes

A: pH 7.4 normal group; B: pH 7.4+ BAPTA-AM group; C: pH 6.0 group; D: pH 6.0+BAPTA-AM group

Fig 4 Effects of BAPTA-AM on acid-induced elevation of [Ca2+]i in articular chondrocytes

1: Before exposure to acid solution; 2: Increased Ca2+intensity when pH was decreased to 6.0; 3: A few minutes after exposure to the acid solution. A: pH 7.4 normal group; B: pH 7.4+BAPTA-AM group; C: pH 6.0 group; D: pH 6.0+BAPTA-AM group

2.3 CaMKKβ、AMPK、mTOR在 BAPTA-AM調(diào)控大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬中的作用Western blot結(jié)果如Fig 5所示，與 pH 7.4正常組比較，酸化刺激組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 CaMKKβ、p-AMPK 蛋白表達(dá)均明顯增加，p-mTOR 蛋白表達(dá)明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與酸化組相比，BAPTA-AM組可明顯抑制CaMKKβ、p-AMPK蛋白表達(dá)，升高 p-mTOR 蛋白表達(dá)(P<0.01)。

Fig 5 Effects of BAPTA-AM on expressions of CaMKKβ, AMPK and mTOR in articular chondrocytes(n=3)

**P<0.01vspH 7.4 normal group；#P<0.05,##P<0.01vspH 6.0 group

3 討論

自噬是一種溶酶體依賴的細(xì)胞降解過程，通過將自噬小體中的細(xì)胞“貨物”轉(zhuǎn)移至溶酶體，自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，隨后自噬溶酶體的“貨物”開始降解，這種細(xì)胞內(nèi)的“貨物”可以是一些錯(cuò)誤折疊的大分子蛋白、脂類以及完整的細(xì)胞器等[9]?；A(chǔ)水平的自噬可以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和自身代謝[10]。同時(shí)自噬可在一些應(yīng)激條件下被激活，如低氧、營養(yǎng)缺失、熱休克、微生物感染、酸化等[11-12]。這些情況下，自噬可以為細(xì)胞提供構(gòu)建成分，并納入一些新合成的大分子為細(xì)胞抗應(yīng)激反應(yīng)和能源生產(chǎn)所需，確保細(xì)胞的生存。近年來大量研究表明，自噬與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如炎癥、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等[3]。在RA中，也存在著自噬的活化，但具體機(jī)制尚不明確[4]。RA 關(guān)節(jié)局部組織酸化導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞是其致殘的主要原因[8]。本課題組前期研究表明，pH 6.0 酸化條件能明顯激活軟骨細(xì)胞自噬，自噬標(biāo)志性蛋白 LC3Ⅱ 表達(dá)明顯升高，但具體機(jī)制尚不明確[7]。同時(shí)也有研究表明，鈣離子在細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮重要作用，但是具體誘導(dǎo)自噬或抑制自噬目前尚存在著爭議[6]。

本文以大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，pH 6.0 胞外酸化為誘導(dǎo)自噬活化條件，使用 Ca2+絡(luò)合劑 BAPTA-AM，探討 Ca2+在胞外酸化誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞自噬中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胞外酸化大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞可以誘導(dǎo)自噬活化，酸化刺激組加入 BAPTA-AM 后，胞內(nèi)游離鈣離子水平下降，并且自噬標(biāo)志物 LC3Ⅱ、Beclin-1、ULK1 表達(dá)水平明顯降低，提示 Ca2+可能參與胞外酸化誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬，同時(shí)，BAPTA-AM 處理后正常組自噬水平并無明顯改變，這與 Furuta等[5]研究結(jié)果相一致。

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，與細(xì)胞內(nèi)一些重要的生理病理過程具有密切的聯(lián)系，其微小的改變都可以影響到細(xì)胞的正常生理功能。Ca2+的信號通路有很多組件，這些組件可以相互連接來創(chuàng)建一個(gè)廣泛的空間和時(shí)間信號[13]。研究表明，升高的細(xì)胞質(zhì)Ca2+及一系列信號通路在自噬中發(fā)揮著重要作用[14]，同時(shí)有研究表明，mTOR作為一個(gè)細(xì)胞的重要信使，在自噬激活中起負(fù)性調(diào)控作用[15]，并且其上游的調(diào)節(jié)因子如 AMPK 和 CaMKKα/β 參與Ca2+調(diào)控自噬的過程[16]。我們的研究結(jié)果表明，與 pH 7.4 正常組相比，pH 6.0 酸化刺激組 CaMKKβ蛋白水平增加，p-AMPK 水平升高，p-mTOR 表達(dá)下調(diào)，證實(shí) CaMKKβ、AMPK和mTOR可能參與胞外酸化誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞自噬的過程，同時(shí)，酸化刺激組加入BAPTA-AM處理后，CaMKKβ、p-AMPK表達(dá)下調(diào)，p-mTOR表達(dá)上調(diào)，表明CaMKKβ、AMPK和mTOR可能作為Ca2+下游信號分子參與調(diào)控胞外酸化誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬過程。這一研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[16]。

綜上所述，本研究證實(shí)胞外酸化刺激激活關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬，鈣離子絡(luò)合劑BAPTA-AM 可明顯抑制酸化刺激誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬，其機(jī)制可能與阻斷細(xì)胞內(nèi) Ca2+水平，調(diào)控 CaMKKβ、AMPK 和 mTOR 表達(dá)有關(guān)。這為研究RA的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。

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Effects of BAPTA-AM on acid-induced autophagy of rat articular chondrocytes and its possible mechanisms

GAO Wen-fan, CHEN Fei-hu，GE Jin-fang, DENG Zi-yun, LEI Jing, ZHOU Ren-peng, WANG Zhi-sen

(SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Aim To observe the effect of BAPTA-AM on extracellular acid-induced autophagy in rat articular chondrocytes and its possible mechanisms. Methods Rat articular chondrocytes were isolated from Sprague-Dawley rats and incubated with different pH medium. The states of autophagy were examined by acridine orange (AO) staining .Moreover, the expressions of LC3, Beclin-1, ULK1, CaMKKβ, AMPK and mTOR were detected using Western blot or quantitative real-time PCR(qRT-PCR). Intracellular calcium ([Ca2+]i) was analyzed by a Ca2+-imaging method. Results Compared with pH 6.0 group, BAPTA-AM could significantly decrease the activation of autophagy induced by acid exposure, and the expressions of autophagy markers including LC3Ⅱ, Beclin-1 and ULK1 were also decreased, accompanied with reduced acid-induced [Ca2+]iinflux, decreased proteins expression of CaMKKβ and phosphorylated-AMPK, and increased phosphorylation of mTOR. Conclusion BAPTA-AM can significantly restrain acid-induced autophagy in rat articular chondrocytes, the mechanism of which may be associated with decreased Ca2+influx.

BAPTA-AM; rheumatoid arthritis ;chondrocytes; autophagy; Ca2+；extracellular acidification

時(shí)間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.014.html

2015-01-29,

2015-03-11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81271949)

高文凡(1991-)，女，碩士生，研究方向：分子藥理學(xué)，E-mail:gaowenfan0829@163.com; 陳飛虎(1962-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)、分子藥理學(xué),通訊作者，E-mail: cfhchina@sohu.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.013

A

1001-1978(2015)05-0655-05

R-332；R322.72；R329.24；R394.2；R977.3