馬 俊， 曾遠生， 劉 煒

(1. 重慶大學(xué)體育學(xué)院， 重慶 400044； 2. 重慶工商大學(xué)體育學(xué)院， 重慶 400067； 3. 重慶第二師范學(xué)院教師教育學(xué)院， 重慶 400067)

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美洲大蠊提取物對力竭運動大鼠心血管氧化損傷的保護作用*

馬 俊1△， 曾遠生2， 劉 煒3

(1. 重慶大學(xué)體育學(xué)院， 重慶 400044； 2. 重慶工商大學(xué)體育學(xué)院， 重慶 400067； 3. 重慶第二師范學(xué)院教師教育學(xué)院， 重慶 400067)

目的：通過美洲大蠊提取物(PAE)對力竭運動大鼠心肌自由基代謝的影響，探討其對心肌氧化損傷的保護作用。方法：雄性SPF級健康SD大鼠40只，隨機分為安靜組、運動組、美洲大蠊提取物安靜組、美洲大蠊提取物運動組(n=10)。服藥組每天灌服2 ml美洲大蠊提取物 (美洲大蠊提取物按50 mg/kg配制,溶于2 ml蒸餾水中灌胃給藥)，對照組每次灌蒸餾水2 ml。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃14 d后，美洲大蠊提取物運動組與運動組大鼠進行一次性力竭游泳運動建立力竭模型，記錄大鼠力竭運動時間。力竭運動結(jié)束時即刻取樣，檢測血清中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，并檢測觀察心肌組織中一氧化氮合酶(NOS)基因的表達情況。結(jié)果：與安靜組相比，一次力竭游泳后, 運動組心肌SOD、GSH-Px 的活性明顯降低(P<0.01), 而MDA 含量顯著升高(P<0.01); 而美洲大蠊提取物能夠顯著提高力竭SD大鼠的心肌SOD、GSH-Px的活性(P<0.01), 降低MDA 含量(P<0.01)，eNos基因表達增高。結(jié)論：大鼠力竭運動后心肌會發(fā)生氧化損傷，美洲大蠊提取物干預(yù)后能夠增加力竭運動后大鼠心肌的抗氧化能力，對力竭運動所致心肌損傷具有一定的保護作用，進而增強大鼠運動能力。

美洲大蠊提取物；大鼠；力竭運動；心血管；氧化損傷

periplaneta Americana extract; rats; exhaustive exercise; cadiovascular; oxidative damage

美洲大蠊俗稱蜚蠊，又稱蟑螂等，是蜚蠊科中體積最大的昆蟲，原產(chǎn)于南美洲。它是一種傳統(tǒng)的中藥材?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊表皮含有鞏膜質(zhì)和甲殼質(zhì)，鉀、鈣、鋁、鎂等元素。肌肉水解13種氨基酸。此外，身體不同部位分別含有豐富的甘氨酸、維生素、腺嘌呤等。據(jù)大量相關(guān)文獻報道，美洲大蠊的醇提取物對癌細胞增殖具有明顯的抑制作用，對心血管疾病的治療有明顯的效果[1]。人體在力竭運動時，機體能量需求量急劇增加，心肌細胞能量代謝加速，容易引起冠

狀動脈供血不足。心肌細胞缺血缺氧，誘發(fā)自由基(reactive oxygen species, ROS)的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致運動性氧應(yīng)激及心肌細胞膜的脂質(zhì)過氧化損傷[2-4]，從而使機體運動能力下降。在正常情況下，生物體內(nèi)存在的強大氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)，可將自由基維持在一個穩(wěn)定的范圍內(nèi)。當平衡系統(tǒng)受到破壞，體內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，導(dǎo)致細胞氧化損傷，促使細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。篩選一種高效無毒高效抗氧化劑已成為運動醫(yī)學(xué)日益關(guān)注的焦點。目前在劇烈運動應(yīng)激時，給予美洲大蠊提取物對心肌氧化損傷是否發(fā)揮作用的研究尚無報道。因此，本研究對處于力竭運動訓(xùn)練的SD大鼠灌服美洲大蠊提取物，通過心肌自由基代謝、抗氧化酶、心肌組織中MDA含量等指標的測定，探討美洲大蠊提取物對力竭運動大鼠心肌過氧化損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要儀器

選取40只SPF級健康SD雄性大鼠，體重(180±20)g，動物由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號：SCXK(渝)2007-0003)。美洲大蠊干蟲體(云南大理禾源賓館美蠊養(yǎng)殖基地)；酪氨酸(中國藥品生物制品檢定所，批號：1687-200811)；硅膠G(上海原葉生物科技有限公司)；RT-PCR Kit(北京中杉金橋生物有限公司)；2×Taq PCR MasterMix(北京天根生物有限公司)；Marker I (北京天根生物有限公司)；DZKW-4水浴鍋上?？莆鲈囼瀮x器廠)；大鼠丙二醛(malondialdehyde, MDA)定量檢測試劑盒(ELISA)、大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 定量檢測試劑盒(ELISA)、大鼠谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)定量檢測試劑盒(ELISA)；梅特勒電子天平AE240(瑞士)；島津UV2550紫外-可見光分光光度儀(日本島津)；1708176凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；梯度PCR儀(Bio-Rad公司)；H-2050R臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 美洲大蠊提取物的制備[5]預(yù)處理蟲體：分別用75%乙醇和蒸餾水緩和清洗美洲大蠊成蟲干體表面各2次，去除觸須和翅后，放入60℃烘箱烘干后，放置凍存盒里于-20℃冰箱中過夜保存。

水提：稱取10 g蟲體在碾缽中磨細后，加入蒸餾水10 ml再研磨成漿液，放置于-20℃冷凍20 min，如此反復(fù)研磨3次，使蟲體充分被研磨成勻漿。

離心處理：將研磨后的蟲體勻漿小心轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，加入蒸餾水30 ml,以4 000 r/min離心15 min，去除上層油狀物，取下層懸液用濾膜過濾，用蒸餾水反復(fù)沖洗濾膜3次，收集濾液。

濃縮醇析：水浴鍋中加熱(60℃～70℃)濃縮濾液至原有體積的1/4,室溫冷卻，以10 000 r/min離心10 min，去除上層油狀物，過濾并清洗濾膜，濾液合并后水浴加熱至60℃～70℃，趁熱加入95%乙醇并不斷攪拌，冷卻至室溫后，10 000 r/min離心15 min后過濾除去上清液，得白色沉淀提取物，用乙醇反復(fù)沉淀3次。

精制：往白色沉淀提取物中加入少量蒸餾水和1/10的活性炭，80℃加熱溶解30 min，不斷攪拌，趁熱過濾。重復(fù)上面操作2次，合并濾液和洗液，加入95%乙醇重結(jié)晶，得到大蠊水提取物。參考并依據(jù)相關(guān)文獻[6,7]對實驗用的大蠊提取物的母液做了定量的含量測定試驗和定性鑒別試驗。在含量測定中，以大蠊提取物溶液中的酪氨酸作為測定對象，并以此通過轉(zhuǎn)換計算總氨基酸的濃度。

1.2.2 動物分組及訓(xùn)練方案 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，將40只大鼠隨機分為安靜組、運動組、美洲大蠊提取物+安靜組、美洲大蠊提取物+運動組(n=10)。實驗期間動物正常進食, 飲水。連續(xù)灌胃14 d，每天灌胃1次，對照組每次灌蒸餾水2 ml，服藥組每天灌服2 ml美洲大蠊提取物 (美洲大蠊提取物按50 mg/kg配制,溶于2 ml蒸餾水中灌胃給藥)。最后一次灌胃后1 h，運動組和美洲大蠊提取物PAE+運動組大鼠分別放入2個相同的恒溫玻璃水槽(100 cm×60 cm×70 cm)中，水深為30 cm，水溫維持在(31±1)℃，進行一次性力竭游泳試驗，記錄力竭游泳時間。力竭標準參照Thomas等[8]報道文獻。標準為SD大鼠沉入水下超過10 s。

1.2.3 血清氧化應(yīng)激指標測定 SD大鼠力竭運動后，立即經(jīng)心臟抽取全血4 ml，并迅速取出心肌組織。室溫靜置30 min、5 000 r/min離心12 min，并取上清血清，采用ELSIA的方法檢測血清中 SOD、MDA、GSH-Px指標。

1.2.4 心肌組織中一氧化氮合酶表達的檢測 處死SD大鼠后，立即取出心臟在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙上拭干，并在冰上切成約100 mg 大小，用DEPC 水處理過的錫箔紙包裹，放入-70℃冰箱保存。用時取出，操作時避免RNA 酶污染。采用RT-PCR 方法對eNOS基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行定性與半定量檢測。制備含溴乙錠2%的瓊脂糖凝膠, 取上述6 μl PCR 擴增產(chǎn)物進行含溴乙錠的瓊脂糖凝膠(2%)電泳，用Bio-Rad 凝膠圖像成像分析系統(tǒng)掃描結(jié)果，Quantity One 軟件進行分析。

1.2.5 組織病理學(xué)觀察 HE染色光鏡觀察大鼠心臟組織形態(tài)變化：每組隨機選取3只大鼠的心臟、主動脈弓，取小塊組織修整齊后置于中性福爾馬林固定液中固定，72h后常規(guī)石蠟包埋切片(4 μm)。二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)各15 min，100%乙醇5 min，95%乙醇 5 min，80%的乙醇 5 min，75%的乙醇 5 min，蒸餾水洗 2 min，蘇木素染色 5 min，水洗，1%鹽酸酒精分化 30 s，氨水返藍，置伊紅染 15 min，水洗，80%的乙醇 5 min，95%的乙醇 5 min，100%乙醇(Ⅰ、Ⅱ)各 5 min，二甲苯(Ⅰ)5 min，二甲苯(Ⅱ)5 min，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

2 結(jié)果

2.1 美洲大蠊提取物對SD大鼠力竭性游泳運動耐力的影響

與力竭組比較, 美洲大蠊提取物運動組能夠顯著提高SD大鼠的耐力(P<0.01，表1)。

GroupFrequencyActiontime(min) Resting1080.25±4.56PAE+resting1087.78±6.79Exhausted10118.45±8.76PAE+exhaus-ted10160.18±7.47**##

PAE： Periplaneta americana extract

**P<0.01vsresting group;##P<0.01vsexhausted group

2.2 美洲大蠊提取物對力竭性游泳運動后SD大鼠心血管氧化-抗氧化系統(tǒng)的影響

與安靜組相比, 運動組一次力竭游泳后, 心肌SOD、GSH-Px 的活性明顯降低(P<0.01，表2), 而MDA 含量顯著升高(P<0.01，表2); 而美洲大蠊提取物能夠顯著提高力竭SD大鼠的心肌SOD、GSH-Px活性(P<0.01，表2), 降低MDA 含量(P<0.01，表2)。

GroupFrequencyMDA(ng/L)SOD(U/L)GSH-Px(U/L)Quiet1016.16±9.4030.20±2.67190.26±48.54Exhausted1024.49±7.38**19.40±4.44**159.85±50.59**PAE+Quiet1016.21±8.8529.59±45.82187.24±57.90PAE+Exhaus-ted1019.30±8.99##28.47±44.59##179.77±58.71##

MDA: Malondialdehyde； SOD： Superoxide dismutase； GSH-Px： Glutathione peroxidase； PAE： Periplaneta Americana extract

**P<0.01vsquiet group;##P<0.01vsexhausted group

2.3 美洲大蠊提取物對力竭游泳運動大鼠心肌組織eNOS表達的影響

RT-PCR半定量分析。美洲大蠊提取物作用后能夠增加力竭運動大鼠心肌組織中eNOS基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(圖1)。安靜組大鼠心肌組織中eNOS mRNA表達為0.7647±0.0387； PAE給予安靜組后大鼠心肌組織中eNOS mRNA表達變較安靜組比較不明顯為0.7584±0.0124；力竭游泳運動大鼠心肌組織eNOSmRNA表達明顯降低為0.1467±0.0263,較安靜組和PAE+安靜組相比差別顯著性意義(P<0.05)；而PAE+力竭游泳運動大鼠心肌組織eNOS mRNA表達為0.687±0.0241，較力竭游泳運動組明顯升高，具有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 美洲大蠊提取物對力竭游泳運動大鼠主動脈弓、心肌組織病變的影響

力竭游泳運動主動脈弓基本正常，局部可見粘液變性,心臟間質(zhì)略顯疏松水腫，可見較多脂肪組織。部分纖維間可見肌漿凝聚，但不明顯。美洲大蠊提取物作用力竭運動主動脈弓基本正常，局部可見粘液變性，心臟組織也基本正常(圖2，見彩圖頁Ⅰ)。

Fig. 1 Cardiac tissue eNOS mRNA expression levels in each group A: Quiet group； B: PAE+quiet group； C: PAE+exhausted group； D: Exhausted group； PAE： Periplaneta Americana extract

3 討論

機體在正常狀態(tài)下，存在完善的氧化-抗氧化的平衡體系[9,10]。內(nèi)源性的抗氧化酶SOD可以有效清除氧自由基[11], 保護細胞免受氧化損傷，減少細胞毒性。多項研究報道[10]，當人體進行力竭運動后，機體負荷急劇增加, 機體耗氧量也急速升高，從而引起機體抗氧化酶系統(tǒng)活性的降低，氧自由基ROS大量產(chǎn)生，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 生成增加。低濃度的ROS能夠調(diào)節(jié)血管細胞的功能，但是大量的ROS產(chǎn)生，超過了機體抗氧化防御的能力，就會攻擊細胞膜的多不飽和脂肪酸，啟動脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改變細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和酶的活性和功能，誘發(fā)心血管內(nèi)皮細胞凋亡，導(dǎo)致整個機體的運動能力下降，進而造成力竭運動性心血管疾病的發(fā)生[12]。進一步的研究表明，給予抗氧化劑干預(yù)后，可以提高機體抗氧化酶的活性，清除大量自由基, 降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng), 從而延緩或消除運動性疲勞的產(chǎn)生[13-15]，提高運動機體的耐力。目前，通過從天然藥物中探尋能夠清除體內(nèi)自由基的物質(zhì)，利用這些物質(zhì)與自由基結(jié)合，以阻斷自由基對人體的攻擊，將成為現(xiàn)代醫(yī)藥、保健業(yè)的熱點[16,17]。美洲大蠊是傳統(tǒng)的中藥材，其全身不同部位分別含有豐富的多元醇、肽類及氨基酸等，對心血管疾病具有明顯的療效。本實驗給予美洲大蠊提取物干預(yù)力竭運動大鼠后，通過觀察其對SD大鼠力竭運動后心肌氧化應(yīng)激損傷的各項指標的影響，來探討美洲大蠊提取物抗運動性疲勞的機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在力竭運動過程中，美洲大蠊提取物通過提高抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，降低MDA 含量，同時又可刺激血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激相關(guān)基因eNOS的表達，使心肌組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減少，從而細胞免受脂質(zhì)過氧化的損傷，延長了大鼠力竭運動時間，提高機體運動能力，從而在保護心臟的過程中發(fā)揮作用，實現(xiàn)其抗運動性疲勞的目的。以美洲大蠊提取物作為研究目標，有望為日后揭示美洲大蠊提取物在力竭運動過程中保護機體免受過氧化損傷的機制提供理論依據(jù)。

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