鄭國龍， 蘇 珍， 安禮俊， 劉海林

(南京醫(yī)科大學附屬淮安一院麻醉科， 江蘇 淮安 223300)

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脊髓GSK-3β信號通路在大鼠慢性嗎啡耐受形成中的作用*

鄭國龍， 蘇 珍， 安禮俊， 劉海林△

(南京醫(yī)科大學附屬淮安一院麻醉科， 江蘇 淮安 223300)

目的：評價脊髓糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)信號通路在大鼠慢性嗎啡耐受形成中的作用。方法：健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，經(jīng)枕骨大孔行鞘內(nèi)置管。取鞘內(nèi)置管成功的40只大鼠，采用隨機數(shù)字表法，將大鼠隨機分為5組(n=8)：生理鹽水組(C組)、慢性嗎啡耐受組(M組)、嗎啡+GSK-3β抑制劑(SB216763)組(MS組)、GSK-3β抑制劑組(S組)和二甲基亞砜組(D組)。皮下注射嗎啡10 mg/kg，每天2次，連續(xù)5 d，建立嗎啡耐受模型。在第6天皮下注射嗎啡前30 min MS組、S組和DMSO組分別鞘內(nèi)注射SB216763(溶于10 μl DMSO中) 14 pmol、SB216763 (溶于10 μl DMSO中)14 pmol和DMSO 10 μl。于皮下注射嗎啡前1 d(基礎(chǔ)值)、皮下注射嗎啡后30 min第1、2、3、4和5天，第6天鞘內(nèi)注射后1 h，測定大鼠甩尾潛伏期，以計算最大抗傷害效應(yīng)百分比(MPAE)。鞘內(nèi)注射4 h后取8只大鼠，處死后取脊髓組織，采用Western blot法測定p-GSK-3β的表達水平。結(jié)果：與第1天比較，M組和MS組第4、5天MPAE明顯降低(P<0.05)；與C組比較，M組和MS組MPAE升高，M組脊髓GSK-3β表達沒有變化，MS組脊髓p-GSK-3β表達上調(diào)(P<0.05)，DMSO組和S組上述指標差異無統(tǒng)計學意義；與M組比較，MS組MPAE升高，脊髓p-GSK-3β表達上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論：脊髓GSK-3β信號通路可能參與了大鼠嗎啡慢性耐受的形成。

嗎啡；GSK-3β；脊髓；耐受；大鼠

morphine; glycogen synthase kinase; spinal cord; tolerance; rat

阿片類藥物是臨床上治療急、慢性疼痛的重要藥物，但

長期應(yīng)用可產(chǎn)生慢性阿片耐受而影響治療效果，因此研究慢性嗎啡耐受的形成機制非常重要。以往的研究結(jié)果顯示，長期嗎啡應(yīng)用可導致脊髓神經(jīng)元產(chǎn)生可塑性改變，嗎啡耐受引起的脊髓神經(jīng)元可塑性與參與學習記憶形成的海馬神經(jīng)元可塑性有著諸多相同的細胞和分子機制[1]。脊髓糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是一種多功能酶，參與多種生物學過程，包括腫瘤發(fā)生、神經(jīng)退行性疾病和細胞死亡[2]。研究表明，GSK-3β活性與學習記憶功能密切相關(guān)，而其抑制劑有神經(jīng)保護的作用[3]。GSK-3β信號通路是否參與了慢性嗎啡耐受的形成尚不清楚。本研究擬評價脊髓GSK-3β信號通路在大鼠慢性嗎啡耐受形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 枕骨大孔鞘內(nèi)置管模型建立

健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供。參照文獻[4]介紹的方法行鞘內(nèi)置管。腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉下，從枕骨大孔開口處向下置入PE-10導管至腰膨大處(插入深度7.0～7.5 cm)。于置管后3 d，取無運動障礙的大鼠，鞘內(nèi)注射2%利多卡因10 μl，注射后30 s內(nèi)出現(xiàn)雙下肢麻痹為鞘內(nèi)置管成功。大鼠單籠飼養(yǎng)5 d后用于實驗。

1.2 實驗分組

取鞘內(nèi)置管成功的健康雄性大鼠40只，采用隨機數(shù)字表法，將大鼠隨機分為5組(n=8)：生理鹽水組(C組)、慢性嗎啡耐受組(M組)、嗎啡+GSK-3β抑制劑SB216763組(MS組)、二甲基亞砜組(DMSO組)和SB216763組(S組)于每天8∶00和20∶00分別皮下注射嗎啡10 mg/kg，連續(xù)5 d，建立嗎啡耐受模型。藥物容積均為10 μl，給藥后均以生理鹽水10 μl沖洗導管，C組同時間給予同體積的生理鹽水。

1.3 最大抗傷害效應(yīng)百分比測定

皮下注射嗎啡前1 d(基礎(chǔ)值)、皮下注射嗎啡后30 min、第1、2、3、4和5天，第6天鞘內(nèi)注射后1 h，測定大鼠甩尾潛伏期(tail flick latency, TFL)。將鼠尾末端約1/3部分浸入水浴(51.5℃～52.5℃)內(nèi)，記錄鼠尾從浸入至甩出水面的時間，連續(xù)測定4次，間隔1 min，取后3次數(shù)據(jù)的平均值。上限值為15 s，防止鼠尾燙傷。剔除TFL小于基礎(chǔ)值或大于15 s的大鼠。計算最大抗傷害效應(yīng)百分比(maximum analgesic efffect MPAE)，公式為MPAE=(鞘內(nèi)注射后TFL-TFL基礎(chǔ)值)÷(15-TFL基礎(chǔ)值)×100%。

1.4 Western blot法測定p-GSK-3β蛋白的表達

于最后一次鞘內(nèi)注射結(jié)束后取8只大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，快速將其胸腰段脊髓取出并放入液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)以下步驟進行蛋白提?。杭顾柘确湃腩A冷的勻漿液A (mmol/L)羥乙基哌嗪乙硫磺酸液 10, Na3VO41, MgCl21.5, KCl 10, NaF 50, 乙二胺四乙酸 (EDTA)0.1,乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)0.1,苯磺基氟化物0.5,二硫蘇糖醇 1和0.02%蛋白酶抑制劑雞尾酒,pH 7.9中，低溫勻漿，加入90 μl 10%NP-40后劇烈震蕩30 s，4℃ 800 r/min離心15 min，取上清液，即為細胞漿成分。胞漿蛋白分裝-70℃保存?zhèn)溆?。按Bradford法測定樣本蛋白濃度后加入1/3體積的4倍樣本緩沖液(250 mmol/L Tris/HCl, pH 6.8, 0.01%考馬斯亮藍G，8%十二烷基硫酸鈉、200 mmol/L蔗糖、300 mmol/L二硫蘇糖醇)，95℃變性5 min。取40 μg蛋白樣本在10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜在3%牛血清封閉3 h后與p-GSK-3β一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST沖洗，加入堿性磷酸酶標記的兔二抗(1∶1 000)，室溫振蕩孵育1.5 h，TBST沖洗，采用NBT/BCIP檢測反應(yīng)條帶，半定量分析。采用圖像分析儀測定條帶吸光度值，反映GSK-3β蛋白的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組MPAE的變化

與C組比較，M組和MS組皮下注射期間MPAE升高(P<0.05)，S組和D組差異無統(tǒng)計學意義；M組和MS組鞘內(nèi)注射期間MPAE逐漸降低(P<0.05)，與M組比較，MS組鞘內(nèi)1 h后MPAE升高(P<0.05，表1)。

Tab.

C: Control group; M： Morphine group; MS: Morphine and SB216763 group; S: SB216763 group; D: Dimethyl sulfoxide group； MAPE: Maxium analgesic effect

*P<0.05vsgroups C；#P<0.05vs1 day；△P<0.05vsgroups M

2.2 各組p-GSK-3β蛋白的表達

最后1次鞘內(nèi)注射后，M組脊髓p-GSK-3β表達沒有變化，與M組比較，MS組脊髓p-GSK-3β表達上調(diào)(P<0.05，表2)。

3 討論

本研究參照Na ramoto K介紹的方法[1]，采用連續(xù)5 d皮下注射嗎啡10 mg/kg的方法建立慢性嗎啡耐受模型，結(jié)果表明，皮下注射嗎啡期間MPAE逐漸降低，提示慢性嗎啡耐受模型制備成功。本研究參照文獻選擇GSK-3β抑制劑的SB216763的劑量[5]，結(jié)果表明，連續(xù)鞘內(nèi)注射嗎啡時對脊髓背角磷酸化GSK-3β表達沒有影響，但是給予GSK-3β的抑制劑SB216763后可明顯上調(diào)脊髓背角磷酸化GSK-3β的表達，抑制慢性嗎啡耐受的形成，大鼠MPAE升高，提示脊髓GSK-3β信號通路可能參與了大鼠慢性嗎啡耐受的形成。

Groupp-GSK-3βC1.00±0.00M1.02±0.18S0.99±0.12D1.01±0.14MS2.01±0.18*

C: Control group； M： Morphine group； MS: Morphine and SB216763 group； S: SB216763 group; D: Dimethyl sulfoxide group

*P<0.05vsgroup M

GSK-3β參與糖代謝過程，處于凋亡通路中的交叉點，GSK-3β磷酸化后活性降低，是體內(nèi)信號傳導通路的重要蛋白之一[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡耐受形成p-GSK-3β表達沒有變化，給予GSK-3β抑制劑SB216763，p-GSK-3β表達增多，同時大鼠對嗎啡的耐受得到逆轉(zhuǎn)。GSK-3β信號通路參與嗎啡耐受的可能機制如下：(1)長期應(yīng)用嗎啡作用于脊髓μ-阿片受體，導致了Gi/o蛋白的活化，激活了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)，GSK-3β是Akt激酶下游的一個重要的靶點[7]。(2)長期應(yīng)用嗎啡，上調(diào)cAMP信號通路，導致了紋狀體內(nèi)的多巴胺和cAMP調(diào)節(jié)的磷蛋白(DARPP-32蛋白)的磷酸化，引起GSK-3β的去磷酸化從而激活GSK-3β信號通路[8]。(3)長期應(yīng)用嗎啡也激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體，引起脊髓谷氨酸釋放，導致了細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路上調(diào)，活化了核糖體S6(Rsk/S6k)激酶，導致GSK-3β磷酸化[9]。

綜上所述，脊髓GSK-3β信號通路可能參與了大鼠慢性嗎啡耐受的形成和維持。

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2014-12-16 【修回日期】2015-02-11

R322.8

A

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