王凌星， 黃紅紅 ，陳雅芳， 蔡鴻潮， 錢家強

(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 泉州 362000)

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產(chǎn)前應(yīng)激對成年子代大鼠缺血性卒中后細胞凋亡的影響*

王凌星， 黃紅紅△，陳雅芳， 蔡鴻潮， 錢家強

(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 泉州 362000)

目的：研究產(chǎn)前應(yīng)激對雄性子代大鼠大腦中動脈缺血/再灌注后神經(jīng)功能的影響。方法：SD孕鼠隨機進行產(chǎn)前應(yīng)激處理(孕期每日3次限制活動)和無產(chǎn)前應(yīng)激處理，并對其雄性子代大鼠采用線栓法制備大腦中動脈局灶性腦缺血(MCAO)模型，共分為假手術(shù)組、產(chǎn)前應(yīng)激+假手術(shù)組、MCAO模型組、產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組(n=10)。于再灌注24 h后進行神經(jīng)功能評分，并檢測腦梗死面積、神經(jīng)細胞凋亡情況和凋亡相關(guān)蛋白表達。結(jié)果：產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組子代大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死面積百分比、TUNEL陽性細胞、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3)和活化的Caspase 3蛋白表達均較MCAO組顯著增加(P<0.05)，而B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表達較MCAO組減少(P<0.05)。結(jié)論：產(chǎn)前應(yīng)激可能通過促進子代大鼠腦缺血/再灌注后神經(jīng)細胞凋亡，加重神經(jīng)功能缺損。

產(chǎn)前應(yīng)激；子代大鼠； 腦缺血； 調(diào)亡

妊娠期應(yīng)激是一種常見的宮內(nèi)不良環(huán)境，可能來自生活或工作事件，包括戰(zhàn)爭、自然災(zāi)害、失業(yè)、家庭或婚姻的不和諧、家人或配偶的死亡等因素。在動物實驗中已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前應(yīng)激會引起成年子代對不利刺激的高反應(yīng)性[1], 并且新生兒期的應(yīng)激會加重子代成年對腦缺血性損害的易感性[2]，提示圍產(chǎn)期不良因素與成年缺血性卒中的愈后存在一定的關(guān)系。而產(chǎn)前應(yīng)激對子代腦缺血性卒中的影響及機制尚不明確。本研究通過使用大鼠產(chǎn)前應(yīng)激模型和子代大

鼠缺血/再灌注模型，檢測產(chǎn)前應(yīng)激對子代腦梗死面積、神經(jīng)功能缺損和細胞凋亡的影響，并探討潛在機制，從而明確產(chǎn)前應(yīng)激對子代腦缺血/再灌注的影響，為治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康SD雌性12周齡大鼠20只，體重200～250 g，健康雄性12周齡大鼠9只，體重300～350 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。動物飼養(yǎng)條件：光照7∶00-19∶00，溫度為22℃±1℃，自由攝取食物和水。大鼠按雌：雄1∶1比例隨機合籠，以發(fā)現(xiàn)陰栓為妊娠第0天。孕鼠按隨機數(shù)字表法分為產(chǎn)前應(yīng)激處理和無產(chǎn)前應(yīng)激處理。所有孕鼠均自然分娩，仔鼠每窩隨機留8只飼養(yǎng)，以避免奶水攝入不足對新生仔鼠生長的影響。子代大鼠滿3周后斷乳，僅保留雄性子代大鼠(3～4只/窩)。雄性子代大鼠于2月齡(體重約250～300 g)時建立大腦中動脈局灶性腦缺血(middle cerebral artery occlusion model ，MCAO)模型。實驗共分四組：假手術(shù)組、產(chǎn)前應(yīng)激+假手術(shù)組、MCAO組、產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組(n=10)。

1.2 動物模型

1.2.1 產(chǎn)前應(yīng)激模型 參考文獻方法建立產(chǎn)前應(yīng)激模型[3]：于妊娠第15～21天，每日3次(每天10∶00、14∶00和18∶00)被限制在塑料質(zhì)地的圓柱形裝置內(nèi)(直徑7 cm，長19 cm)，每次45 min。無產(chǎn)前應(yīng)激處理的孕鼠于整個妊娠期均飼養(yǎng)于塑料籠內(nèi)不被干擾。除應(yīng)激處理外，孕鼠均不受其他打擾。

1.2.2 MCAO模型 采用右側(cè)頸外動脈插入線栓法[4]建立MCAO模型，大鼠分別于右側(cè)大腦中動脈缺血90 min，將栓線向外輕輕拉出，制造再灌注模型。動物清醒后具有右眼Horner征，提尾時左側(cè)前肢屈曲內(nèi)收者為研究對象，并剔除有蛛網(wǎng)膜下腔出血者。假手術(shù)組采用同樣的手術(shù)過程，但線栓插入較淺，未造成大腦中動脈閉塞。

1.3 神經(jīng)功能評分

各組大鼠分別于再灌注后24 h，參照Longa評分標準[4]進行神經(jīng)功能評分。0分：無明顯神經(jīng)功能缺損；1分：不能完全伸直對側(cè)前爪；2分：行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.4 HE染色

于再灌注24 h，各組取5只大鼠，10%水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛灌注內(nèi)固定，斷頭取腦，石蠟包埋。切片行常規(guī)HE染色檢測腦梗死情況，并在普通光鏡下觀察腦組織形態(tài)學改變。取視交叉后3 mm處切面(病變最大切面)，采用NIH圖像軟件測量梗死面積，腦梗死嚴重程度以橫截面上腦梗死面積占整個腦組織截面面積百分比代表[5, 6]。

1.5 細胞凋亡檢測

取視交叉后3 mm處腦組織塊，采用TUNEL法檢測神經(jīng)細胞凋亡，具體步驟按試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說明書進行，細胞核中出現(xiàn)黃褐色顆粒者為TUNEL染色陽性，即為凋亡細胞。每張切片在鏡下(×400)于缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)隨機采集5個視野，采用Image Pro-plus 6.0圖像分析軟件計數(shù)凋亡細胞，取平均值。

1.6 Western blot檢測

于再灌注24 h，各組取5只大鼠，10%水合氯醛麻醉后，低溫開顱取缺血側(cè)紋狀體及周邊皮質(zhì)，假手術(shù)組區(qū)與手術(shù)組相對應(yīng)的腦區(qū)，液氮凍存。提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后,轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉后分別加入一抗：Caspase 3(Cell Signaling Technology，USA，1∶500)；cleaved Caspase 3(Cell Signaling Technology，USA，1∶500)；Bcl-2(Santa Cruz Inc.，1∶200)；β-肌動蛋白(β-actin，北京博奧森生物制劑有限公司，1∶2 000)，4℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化酶標記的二抗孵育。ECL顯影，掃描后用凝膠成像處理系統(tǒng)(美國SYNGENE公司)進行吸光度分析，以目的條帶吸光度與β-actin條帶吸光度之比表示目的蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評分

假手術(shù)組，產(chǎn)前應(yīng)激+假手術(shù)組子代大鼠均為0分，無神經(jīng)功能缺損；產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組(2.8±0.6)和MCAO組(2.0±0.7)，子代大鼠于麻醉清醒后出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損。與MCAO組比較，產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組子代大鼠神經(jīng)功能評分顯著增加(P<0.05)。

2.2 腦梗死面積測定

假手術(shù)組及產(chǎn)前應(yīng)激+假手術(shù)組均未見腦梗死灶(圖1A、圖1B)。HE染色后可見MCAO組梗死局限在皮質(zhì)及皮質(zhì)下(圖1C)，產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組梗死相對彌散，尚累及胼胝體和尾狀殼核(圖1D)。產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組梗死面積百分比(27.62±2.69)%明顯大于MCAO組(17.28±2.07)%(P<0.05)。

2.3 腦組織HE染色

光鏡下可見假手術(shù)組和產(chǎn)前應(yīng)激+假手術(shù)組額頂葉皮質(zhì)神經(jīng)細胞形態(tài)正常，排列整齊(圖2A、圖2B)；MCAO組同一部位的神經(jīng)細胞排列紊亂，大部分神經(jīng)細胞喪失正常細胞形態(tài)，細胞體積縮小,出現(xiàn)核固縮、組織疏松、細胞質(zhì)淡染(圖2C)；產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)不清,排列疏松，細胞呈三角形或長條形,細胞質(zhì)空泡狀,核固縮，可見大量篩狀空泡樣結(jié)構(gòu)(圖2D)。

Fig. 1 Representative photographs of infarct volume after transient MCAO(HE) A: Sham group; B: Prenatal stress+sham group; C: MCAO group; D: Prenatal stress+MCAO group； MCAO： Middle cerebral artery occlusion model

Fig. 2 Representative light micrographs of HE-stained brain sections obtained from four experimental groups after transient MCAO (Scale bar= 100 μm) A: Sham group; B: Prenatal stress+sham group; C: MCAO group; D: Prenatal stress+MCAO group； MCAO： Middle cerebral artery occlusion model

2.4 神經(jīng)細胞凋亡計數(shù)

光鏡下假手術(shù)組和產(chǎn)前應(yīng)激+假手術(shù)組子代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞幾乎全為TUNEL陰性反應(yīng)細胞(圖3A、圖3B)；在MCAO組可見散在TUNEL陽性反應(yīng)細胞，即凋亡細胞，核呈棕色，部分細胞體積縮小且形態(tài)不規(guī)則，核固縮深染，呈深棕色(圖3C)，MCAO組凋亡陽性細胞數(shù)明顯高于假手術(shù)組和產(chǎn)前應(yīng)激+假手術(shù)組(表1，P<0.01)；產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組TUNEL陽性細胞顯著增加(圖3D，表1，P<0.01)。

Fig. 3 Representative photomicrographs of brain sections obtained from four experimental groups after transient MCAO (TUNEL,Scale bar=100 μm) A: Sham group; B: Prenatal stress+sham group; C: MCAO group; D: Prenatal stress+MCAO group； MCAO： Middle cerebral artery occlusion model

2.5 Western blot檢測Caspase 3、cleaved Caspase 3和Bcl-2蛋白表達情況

假手術(shù)組和產(chǎn)前應(yīng)激+假手術(shù)組子代大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)有少量Caspase 3和cleaved Caspase 3蛋白表達，MCAO組、產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組Caspase 3和cleaved Caspase 3蛋白表達增加，與假手術(shù)組和產(chǎn)前應(yīng)激+假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組Caspase 3和cleaved Caspase 3蛋白表達也較MCAO組增加(P<0.05)。MCAO組、產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組Bcl-2蛋白表達較假手術(shù)組和產(chǎn)前應(yīng)激+假手術(shù)組減少(P<0.05)；產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組Bcl-2蛋白表達也較MCAO組減少 (圖4,表1，P<0.05)

Fig. 4 Expression of Caspase 3, cleaved Caspase 3 and Bcl-2 in four experimental groups after transient MCAO A: Sham group; B: Prenatal stress+sham group; C: MCAO group; D: Prenatal stress+MCAO group； MCAO： Middle cerebral artery occlusion model

GroupTUNEL-positivecells(number/field)CleavedCaspase3Caspase3Bcl-2Sham4.2±1.30.15±0.050.11±0.040.69±0.06Prenatalstress+sham4.4±1.10.24±0.040.18±0.050.70±0.07MCAO15.2±2.8*#0.51±0.07*#0.29±0.05*#0.59±0.06*#Prenatalstress+MCAO23.6±2.3*#△0.80±0.10*#△0.56±0.06*#△0.50±0.05*#△

MCAO: Middle cerebral artery occlusion

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsprenatal stress+sham group;△P<0.05vsMCAO group

3 討論

卒中是由于腦血管的不正常而出現(xiàn)的突發(fā)、局灶神經(jīng)功能缺損。在中國，卒中是死亡和致殘的首要原因[7]。大約50%～70%卒中患者最終生活可自理，而15%～30%遺留永久性癱瘓。因此，卒中是常見且能對患者及其家庭產(chǎn)生嚴重影響的疾病，對這些病人的愈后進行預測并尋找相關(guān)影響因素具有極其重要的意義。已有研究表明，產(chǎn)前不良環(huán)境，如妊娠期缺氧可能使子代具有不利的卒中后神經(jīng)功能恢復[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組較之MCAO組具有明顯的神經(jīng)功能缺損評分和更大的腦梗死面積，提示產(chǎn)前應(yīng)激會加重子代大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)損傷，進一步證明圍產(chǎn)期不良事件會產(chǎn)生持久反應(yīng)，影響子代缺血性卒中的預后。

本實驗中，產(chǎn)前應(yīng)激+假手術(shù)組或假手術(shù)組子代大鼠均未見明顯神經(jīng)細胞形態(tài)學改變且僅有少量凋亡細胞，而產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組和MCAO組均出現(xiàn)明顯細胞形態(tài)改變和細胞凋亡，產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組較之MCAO組更顯著，這說明產(chǎn)前應(yīng)激雖未直接引起子代大鼠神經(jīng)細胞損傷，但會使神經(jīng)細胞具有易損傷性，從而使子代大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)細胞損傷加重，并促進細胞凋亡。已有研究表明[9]細胞凋亡在腦缺血再灌注后的細胞死亡中起重要作用，因此我們推測在本實驗中，細胞凋亡很可能是產(chǎn)前應(yīng)激加重子代大鼠腦缺血再灌注損傷的主要環(huán)節(jié)。

腦缺血會引起缺血區(qū)域細胞的快速死亡。腦部缺血通過內(nèi)部和外部途徑引起Caspase 3活化，并裂解重要的DNA修復酶—多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)，最終引起DNA片段化和細胞死亡[10]。動物和人類實驗均證實了卒中后存在Caspase 3表達和效應(yīng)增加，Caspase 3的活化在凋亡過程中具有重要作用[9, 11]。實驗性缺血性動物模型表明消除和抑制Caspase 3可通過減小腦梗死面積和延長治療時間窗而發(fā)揮明顯的神經(jīng)保護作用[12]。本研究中，我們觀察到MCAO組子代大鼠大腦中動脈缺血再灌注后皮質(zhì)Caspase 3和cleaved Caspase 3的表達增加，而cleaved Caspase 3是Caspase 3的活化形式，這說明缺血再灌注導致大腦局部活化Caspase 3表達增加并誘導細胞凋亡，且在產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組這兩個指標表達均較MCAO組明顯增加，提示產(chǎn)前應(yīng)激很可能是通過促進活化Caspase 3表達加劇細胞凋亡，從而加重腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺損。

與此同時，細胞可以通過啟動生存途徑拮抗卒中引起的凋亡。Bcl-2蛋白是重要的抗凋亡蛋白，可通過與Bax蛋白結(jié)合減少線粒體膜的通透性而抑制線粒體凋亡途徑[13]。但自然啟動的Bcl-2蛋白并不足以挽救缺血的腦組織和促進功能轉(zhuǎn)歸。研究表明通過基因轉(zhuǎn)移使Bcl-2過表達可以抑制缺血半暗帶凋亡并減少神經(jīng)元丟失[14]。本實驗中，MCAO組Bcl-2蛋白表達減少，這和既往的研究一致[15]，而產(chǎn)前應(yīng)激+MCAO組Bcl-2蛋白表達較MCAO組減少，提示產(chǎn)前應(yīng)激可能通過減少腦缺血再灌注后凋亡抑制蛋白Bcl-2表達而促進凋亡，進而增加神經(jīng)細胞損傷和梗死面積，影響神經(jīng)功能恢復。

總之，產(chǎn)前應(yīng)激對子代大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能的影響與局部凋亡相關(guān)蛋白表達的改變有關(guān)，可能通過改變子代大鼠腦缺血再灌注后Caspase 3和Bcl-2蛋白表達，促進局部神經(jīng)細胞凋亡，加重神經(jīng)功能缺損，并可能改變子代大鼠缺血性卒中的預后。

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The effects of prenatal stress on the cell apoptosis after MCAO in adult offspring rats

WANG Ling-xing, HUANG Hong-hong△, CHEN Ya-fang, CAI Hong-chao, QIAN Jia-qiang

(Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Quanzhou 362000, China)

Objective: To evaluate the effects of prenatal stress on neurological functions after middle cerebral artery occlusion (MCAO) in adult offspring rats. Methods: Pregnant rats were randomly assigned to prenatal stress treatment, which was exposed to restraint three times daily in the last week of pregnancy, and no prenatal stress treatment. Adult male offspring rats were subjected to transient focal cerebral ischemia by MCAO. They were randomly divided into four groups: sham group, prenatal stress + sham group, MCAO group and prenatal stress + MCAO group (n=10). After 24 hours of reperfusion, the neurological deficits were evaluated. The infarct size, cell apoptosis and expression of Caspase 3, cleaved Caspase 3 and Bcl-2 were detected. Results: Compared with MCAO group, the neurological deficits, infarct size and apoptotic cells in prenatal stress + MCAO group were increased significantly (allP<0.05). The expressions of Caspase 3 and cleaved Caspase 3 were much greater in prenatal stress + MCAO group than those of MCAO group, while the expression of Bcl-2 was significantly decreased in prenatal stress + MCAO group compared with MCAO group (allP<0.05). Conclusion: Prenatal stress might exacerbate neurological deficits in the offspring rats after MCAO by increasing cell apoptosis.

prenatal stress; offspring rat; cerebral ischemia; apoptosis

福建省自然科學基金項目(2015J01449)；省教育廳項目(JB13067)；泉州市技術(shù)研究與開發(fā)項目(2012Z35)；福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院苗圃基金資助(2012MP65)

2014-12-22 【修回日期】2015-06-10

R73-3

A

1000-6834(2015)05-427-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.012

△【通訊作者】Tel： 13600766682； E-mail： minghuaxin@139.com