俞愛月， 孫小紅△， 劉學(xué)紅， 周 瑾， 王 嵐

(1. 紹興文理學(xué)院元培學(xué)院， 2. 紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 紹興 312000)

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西酞普蘭對(duì)慢性應(yīng)激大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞bax mRNA、bcl-2 mRNA表達(dá)及凋亡的影響*

俞愛月1， 孫小紅1△， 劉學(xué)紅2， 周 瑾2， 王 嵐2

(1. 紹興文理學(xué)院元培學(xué)院， 2. 紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 紹興 312000)

目的：探討西酞普蘭對(duì)慢性應(yīng)激大鼠的額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞bax、bcl-2 mRNA表達(dá)的影響。方法：取24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(不進(jìn)行任何處理)、應(yīng)激組(應(yīng)激+生理鹽水灌胃)、實(shí)驗(yàn)組(應(yīng)激+西酞普蘭灌胃)，采用強(qiáng)迫游泳制造慢性應(yīng)激模型(15 min/d，共4周)，用原位雜交技術(shù)檢測(cè)bax、bcl-2 mRNA表達(dá)情況，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，尼康圖像分析(NIS DR)軟件測(cè)量各指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果：應(yīng)激組較對(duì)照組，大鼠額葉皮質(zhì)bax mRNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯增多(P<0.01)、染色加深；bcl-2 mRNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯減少(P<0.01)且染色變淺，且TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.01)，染色增強(qiáng)。而實(shí)驗(yàn)組較應(yīng)激組大鼠，額葉皮質(zhì)bax mRNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞減少(P<0.01)、染色變淺，bcl-2 mRNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯增多(P<0.05)，染色加深，且TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.01)，染色減弱。結(jié)論：大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞bax mRNA和bcl-2 mRNA的表達(dá)水平受到慢性應(yīng)激的影響，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡加劇，西酞普蘭能夠有效調(diào)控額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞bax和bcl-2 mRNA的表達(dá)水平，拮抗細(xì)胞凋亡，這可能是西酞普蘭防治慢性應(yīng)激引起的神經(jīng)精神疾病的相關(guān)機(jī)制之一。

西酞普蘭；慢性應(yīng)激；bax mRNA；bcl-2 mRNA；細(xì)胞凋亡；額葉皮質(zhì)；大鼠

慢性應(yīng)激能夠改變大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)，并且與抑郁障礙的發(fā)生密切相關(guān)[1,2]。據(jù)報(bào)道，這與額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的萎縮與凋亡相關(guān)

聯(lián)[3]，其作用機(jī)制可能與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的下調(diào)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)及其mRNA下降、c-fos/c-jun、一氧化氮(NO)、過多自由基、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2) 過磷酸化及超微結(jié)構(gòu)的變化 、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)表達(dá)水平改變有關(guān)[4-7]。研究表明，銀杏葉提取物、苯妥英鈉、帕羅西汀、文拉法辛等藥物對(duì)慢性應(yīng)激大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[8-10]。西酞普蘭是消旋二環(huán)phthalane衍生物，是一種新穎的選擇性5-羥色胺(serotonin ,5-HT)的再攝取抑制劑，臨床證明對(duì)抑郁障礙有較好的治療效果。另有實(shí)驗(yàn)證明，西酞普蘭可通過促進(jìn)慢性應(yīng)激大鼠海馬BDNF表達(dá)及海馬CA1區(qū)樹突長(zhǎng)度、分支及樹突棘密度，改善學(xué)習(xí)記憶能力，并改善大鼠的抑郁行為，對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[11-14]。然而西酞普蘭拮抗額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的詳盡機(jī)制，目前尚未見報(bào)道。本研究對(duì)西酞普蘭干預(yù)慢性應(yīng)激引起的額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制作進(jìn)一步研究，探索相關(guān)基因bcl-2 mRNA、bax mRNA表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為臨床上慢性應(yīng)激為誘因的神經(jīng)精神類疾病的有關(guān)防治提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；紹興文理學(xué)院生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地動(dòng)物室飼養(yǎng))24只，體重(239±22)g；氫溴酸西酞普蘭 (西安楊森制藥有限公司生產(chǎn))；檢測(cè)細(xì)胞凋亡脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling，TUNEL)所用試劑均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，美國(guó)羅氏公司制造。bax、bcl-2原位雜交試劑，購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠飼養(yǎng)及造模 SD大鼠24只，隨機(jī)分為3組(n=8)。分組分籠飼養(yǎng)，每籠4只，共6籠。自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)期為7 d，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)程序。飼養(yǎng)環(huán)境為光/暗各12 h，光照時(shí)間為7∶00-19∶00，室溫(23±2.0)℃。對(duì)照組不進(jìn)行任何處理；應(yīng)激組與實(shí)驗(yàn)組大鼠置于水缸(70 cm×70 cm×80 cm)中強(qiáng)迫游泳15 min/d，其水溫(23.0±2.0)℃、水深25 cm，4周后制成慢性應(yīng)激大鼠模型。同時(shí)4周內(nèi)應(yīng)激組每日采用等體積生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)組以氫溴酸西酞普蘭(4 mg/kg·d)灌胃預(yù)防性用藥。

1.2.2 標(biāo)本制備 實(shí)驗(yàn)過程第29天，使用戊巴比妥鈉(2%，65～70 mg/kg)腹腔麻醉大鼠后，開胸經(jīng)左心室快速灌注120～160 ml的生理鹽水(37℃，含適量肝素)。然后使用210～250 m1中性多聚甲醛溶液灌注(4%，pH 7.4，磷酸鹽緩沖液配制，含1/1 000的DEPC),時(shí)間30～45 min，取大鼠前腦組織于4%中性多聚甲醛溶液中固定40 min。包埋(常規(guī)石蠟)，切片4～6 μm。

1.2.3 原位雜交 常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，室溫持續(xù)5～10 min用于滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗重復(fù)3次，使mRNA核酸片段暴露；加2滴濃縮型胃蛋白酶于1 ml 3% 檸檬酸內(nèi)，充分混勻，于切片上滴加，室溫或37℃下消化15 min。原位雜交：PBS重復(fù)洗3次，持續(xù)時(shí)間5 min，蒸餾水洗1次，固定持續(xù)時(shí)間10 min：固定液為1%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(pH 7.4)，含有1/1 000 DEPC，蒸餾水洗3次,40℃恒溫箱內(nèi)預(yù)雜交4 h，吸去多余液體；不漂洗的每張切片滴25 μl雜交液，于40℃恒溫箱內(nèi)雜交過夜。雜交后洗滌：37℃水溫的2×SSC洗滌5 min×2次；37℃ 0.5×SSC洗滌15 min×2次；37℃ 0.2×SSC洗滌15 min×1次；滴加封閉液：37℃下孵育30 min，滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃下孵育60 min，PBS洗5 min×4次,滴加SABC，37℃下孵育20 min，PBS洗5 min×4次，滴加生物素化過氧化物酶，37℃下孵育20 min，PBS洗5 min×5次，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。鏡下bax、bcl-2 mRNA的細(xì)胞胞漿著色呈黃色或棕黃色。

1.2.4 TUNEL法 切片常規(guī)脫蠟至水，微波技術(shù)進(jìn)行修復(fù)(5 min)，3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加試劑1和2混合液(1∶9)，濕盒中保持37℃狀態(tài)(60 min)，滴加轉(zhuǎn)化劑-POD保持37℃狀態(tài)維持30 min，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染,中性樹膠封片，光鏡觀察。判斷陽(yáng)性細(xì)胞是否凋亡的標(biāo)準(zhǔn)如下：細(xì)胞核呈濃縮狀態(tài)，月牙形或不規(guī)則形、圓或橢圓形；顏色深淺程度不一致，多為黃色或棕色。陽(yáng)性對(duì)照采用已知陽(yáng)性片，采用標(biāo)記液做陰性對(duì)照。

1.2.5 圖像分析 用NIS DR(日本尼康圖像分析，Nikon imaging software DR)軟件處理并統(tǒng)計(jì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和灰度值，細(xì)胞bax mRNA及bcl-2 mRNA的表達(dá)情況。每只大鼠取切片2張，光鏡下每張選取額葉皮質(zhì)2-3個(gè)視野(×400)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠bax mRNA、bcl-2 mRNA表達(dá)的變化

陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)呈淺黃色或黃色。應(yīng)激組較對(duì)照組bax mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多且染色深，而實(shí)驗(yàn)組較應(yīng)激組bax-2 mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞減少且染色淺；應(yīng)激組較對(duì)照組bcl-2 mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少且染色變淺，而實(shí)驗(yàn)組較應(yīng)激組bcl-2 mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多且染色深(圖1，見彩圖頁(yè)Ⅱ)。

2.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

應(yīng)激組與對(duì)照組進(jìn)行比較,視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞體積顯著減小。細(xì)胞核呈濃縮狀態(tài)，形狀多為月牙形、橢圓形或不規(guī)則形；顏色呈棕黃色或黃色，能夠明顯看到大量凋亡小體，實(shí)驗(yàn)組觀察視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，胞核呈濃縮狀態(tài)的現(xiàn)象明顯減少，染色程度均有不同程度降低(圖2，見彩圖頁(yè)Ⅱ)。

2.3 額葉皮質(zhì)bax mRNA、bcl-2 mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

與應(yīng)激組比較，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠額葉皮質(zhì)bcl-2 mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加，bax mRNA、TUNEL表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01, 表1)。

GroupbaxmRNAbcl-2mRNATUNELControl10.37±4.2124.33±6.7516.94±6.46Stress50.45±10.42**9.01±4.13**31.69±19.89**Experimental25.19±8.07##21.6±8.72#17.31±5.41##

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsstress group

3 討論

采用強(qiáng)迫游泳方法建立大鼠抑郁應(yīng)激模型，屬于建模中的經(jīng)典方法，廣泛應(yīng)用于抗抑郁藥療效評(píng)定及應(yīng)激相關(guān)研究中[15]。我們的實(shí)驗(yàn)研究也成功制造了慢性應(yīng)激大鼠模型，也提示西酞普蘭能夠拮抗應(yīng)激造模所產(chǎn)生的體力不足狀態(tài)和心理抑郁情況[16]。

細(xì)胞程序性死亡是一個(gè)主動(dòng)的、完整的、受相應(yīng)基因調(diào)控的細(xì)胞死亡過程,該過程分為激活、傳遞、凋亡三個(gè)階段，其中基因及其表達(dá)蛋白調(diào)控是中間過程，而凋亡是程序性死亡的最后階段[17]。bcl-2基因家族，是與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的原癌基因之一,其中bax為凋亡促進(jìn)因子，bcl-2是凋亡抑制因子。本研究結(jié)果顯示：應(yīng)激組和對(duì)照組進(jìn)行比較，其大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的bcl-2 mRNA表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞染色變淺且數(shù)量明顯減少，bax mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞染色增強(qiáng)且數(shù)量明顯增多，且TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多染色增強(qiáng)(細(xì)胞出現(xiàn)核縮，多為月牙形、橢圓形或不規(guī)則形，染色呈棕黃色或黃色，出現(xiàn)大量凋亡小體)，提示慢性應(yīng)激可通過調(diào)控bax mRNA、bcl-2 mRNA，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而實(shí)驗(yàn)組較應(yīng)激組，大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞bax mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞減少且染色淺，bcl-2 mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多且染色深，且TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少染色減弱，提示西酞普蘭可通過對(duì)bax mRNA、bcl-2 mRNA調(diào)控，拮抗細(xì)胞凋亡。結(jié)合本室的前期研究結(jié)果(應(yīng)激組大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞bax蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多且細(xì)胞染色程度增強(qiáng)、bcl-2蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少且染色程度有所減輕；而使用西酞普蘭組大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞bax蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞減少且染色變淺、bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞增多且染色變深)[18]，綜上，西酞普蘭通過影響bax/bcl-2基因，調(diào)節(jié)控制相應(yīng)的bax/bcl-2蛋白表達(dá)，從而影響相應(yīng)的細(xì)胞凋亡。

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Effects of Citalopram on frontal cortical neurons’ bax mRNA、 bcl-2 mRNA expression and cell apoptosis of rat after stress

YU Ai-yue1, SUN Xiao-hong1△, LIU Xue-hong2, ZHOU Jin2, WANG Lan2

(1. Yuanpei College, Shaoxing University, 2. Medical College, Shaoxing University, Shaoxing 312000, China)

Objective: To study the effects of Citalopram on the mRNA expression of bax and bcl-2 in frontal cortical neurons and on cell apoptosis of rats after stress. Methods: Twenty-four healthy male SD rats were randomly divided into three groups (n=8). The control group did no receive any treatment, the stress group was subject to stress and given normal saline and experimental group was given Citalopram irrigation stomach after stress. Rats were forced to swim to establish chronic stress model (15min/d,4 weeks), bax、bcl-2 mRNA expression were tested by in situ hybridization technique (ISH), TUNEL assay was used to determine cell apoptosis , Nikon image analysis software were used to measure the number of positive cells in each index. Results: Compared with the control group, the stress group showed a larger number of bax mRNA expressing cells(P<0.01), a smaller number of bcl-2 mRNA expressing cells (P<0.01), and the staining intensity of positive cells was significantly reduced(P<0.01). Compared with the stress group, the experiment group showed more reduced number of bax mRNA positive cells(P<0.01)and significantly increased bcl-2 mRNA positive cells(P<0.05) , a small amount of positive cells were found, compared with that in the stress group, nuclear condensation in the experimental group was reduced significantly and the staining was obviously weaker(P<0.01). Conclusion: Citalopram significantly antagonizes bax mRNA and potentiatesbcl-2 mRNA protein expression and inhibits apoptosis of rat prefrontal cortical neurons caused by chronic stress, which might be one possible mechanism of Citalopram for prevention and treatment of psychosis caused by chronic stress.

Citalopram; chronic stress; bax mRNA; bcl-2 mRNA; apoptosis; prefrontal cortex; rat

浙江省紹興市2010重點(diǎn)科研項(xiàng)目(2010A23019)

2015-02-26 【修回日期】2015-06-11

R363

A

1000-6834(2015)05-455-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.018

△【通訊作者】Tel： 0575-88348545； E-mail： 237062814@qq.com