張紫娟， 郭美霞， 邢 瑩

(1. 河南中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院， 鄭州450046； 2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院, 河南 新鄉(xiāng)453003；3. 鄭州大學醫(yī)學院生理學教研室， 鄭州450003)

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ERK激活對SDF-1引起的大鼠海馬神經元 GABA分泌抑制的影響*

張紫娟1， 郭美霞2， 邢 瑩3△

(1. 河南中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院， 鄭州450046； 2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院, 河南 新鄉(xiāng)453003；3. 鄭州大學醫(yī)學院生理學教研室， 鄭州450003)

目的：觀察細胞外調節(jié)激酶(ERK)信號通路激活對基質細胞衍生因子(SDF-1)引起離體培養(yǎng)的大鼠海馬神經元γ-氨基丁酸(GABA)分泌的影響。方法：新生SD大鼠海馬神經元離體培養(yǎng)， Western blot法觀察ERK1/2信號通路的磷酸化水平；ELISA法和RT-PCR技術檢測ERK1/2特異性阻斷劑PD98059作用于離體培養(yǎng)的海馬神經元后GABA分泌的改變；谷氨酸脫羧酶(GAD65/67)和γ-氨基丁酸轉運體(GAT)的蛋白表達量及GAD65和GAT-1 mRNA表達水平。結果：SDF-1作用于海馬神經元可引起ERK1/2磷酸化水平明顯升高，同時加用CXCR4受體阻斷劑AMD3100，可阻斷SDF1引起的ERK1/2激活；SDF-1可明顯抑制離體培養(yǎng)的海馬神經元GABA的分泌，同時加用ERK1/2特異性抑制劑PD98059，可部分逆轉SDF-1對GABA分泌的抑制作用；SDF-1作用于離體培養(yǎng)的海馬神經元，可抑制谷氨酸脫羧酶GAD65和GABA轉運體GAT-1 mRNA的生成；ERK抑制劑PD98059可有效翻轉SDF-1的作用。Western blot結果發(fā)現SDF-1可抑制海馬神經元GAT-1和GAD65/67蛋白的表達，加用ERK1/2抑制劑可部分恢復GAT-1和GAD65/67蛋白合成。結論：SDF1作用于離體培養(yǎng)的海馬神經元CXCR4，通過激活ERK1/2信號通路進而抑制GAD蛋白表達，可能是其介導GABA分泌抑制的通路之一。

海馬神經元;γ-氨基丁酸;細胞外調節(jié)激酶;基質細胞衍生因子-1；大鼠

基質細胞衍生因子(stromal cell derived factor,

SDF-1)是骨髓基質細胞產生的CXC類趨化蛋白。已有研究證實，SDF-1及其受體CXR4在海馬組織中廣泛表達，可以促進海馬神經元的遷移和突起延伸。本室最近的實驗發(fā)現SDF-1可通過作用于CXCR4抑制離體培養(yǎng)的大鼠海馬神經元γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)的分泌。有報道在大鼠體內SDF-1作用于CXCR4可引起細胞外調節(jié)激酶(extracellular regulating kinase1/2, ERK1/2)信號通路激活，進而調節(jié)骨髓間充質干細胞的遷移。但是SDF-1作用于海馬神經元CXCR4是否也通過激活ERK而引起GABA分泌的改變，目前尚未報道。為闡述上述問題進行本實驗，旨在進一步揭示帕金森病和阿爾茨海默病的發(fā)病機理，為其防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

大鼠γ-氨基丁酸ELISA檢測試劑盒(上海郎頓生物有限公司)，兔抗γ-actin多克隆抗體(Sigma-Aldrich)，兔抗ERK1/2抗體和兔抗phospho-ERK1/2 (碧云天)，兔抗GAD65/67和GAT抗體(Abbiotec)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋), AMD3100(Sigma)，PD980599(Sigma)，RevertAid cDNA Kit試劑盒(Fermentas)，Taq DNA Polymerase (上海申能博彩公司)，GAD65、GAT-1和GAPDH引物由博尚生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經元的培養(yǎng)及鑒定 新生24 h內的SD大鼠 (河南省實驗動物中心提供許可證號SCXK(豫)2010-0002),無菌條件下斷頭、取腦、分離兩側海馬組織，將海馬組織置0.25%胰蛋白酶37℃消化5～10 min，過濾單個細胞后置于離心管中1 000 r/min 離心10 min,棄上清,加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基(含有15%胎牛血清,2%B27,20 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF)制備成細胞懸液。取少量細胞懸液用臺盼蘭染色,檢查細胞成活率在95%以上,調整細胞密度為1×106cells/ml, 將細胞接種于預先涂有多聚賴氨酸的12孔培養(yǎng)板中，每孔接種細胞懸液1 ml 后，置入37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后,用含阿糖胞苷培養(yǎng)液替換原種植培養(yǎng)液,抑制神經膠質細胞生長。培養(yǎng)5 d的新生大鼠海馬神經元,經神經元特異性烯醇化酶(NSE)免疫組織化學方法進行神經元鑒定以及測定神經細胞數量。

1.2.2 實驗分組 離體培養(yǎng)的SD大鼠海馬神經元隨機分為六組(n=4):對照組( control)、SDF-1組(細胞培養(yǎng)至第5天培養(yǎng)液中加入100 mg/L SDF-1，終濃度為 50 μg/L作用6 h)、AMD3100組(細胞培養(yǎng)至第5天培養(yǎng)液中加入100 mmol/L AMD3100，終濃度為 50 μmol/L作用30 min)、PD98059組(細胞培養(yǎng)至第2天培養(yǎng)液中加入200 mmol/L PD98059，終濃度為 100 μmol/L作用3 d)、SDF-1+AMD3100組和SDF-1+PD98059組也做相應的處理，采用六孔培養(yǎng)板在同樣實驗條件下進行培養(yǎng)。

1.2.3 Western blot 檢測SDF-1對細胞外調節(jié)激酶(ERK1/2)信號通路的磷酸化水平的影響以及PD98059阻斷ERK1/2信號通路后GAD和GAT蛋白的表達變化 清除各組細胞培養(yǎng)液，PBS沖洗三遍,每孔加入50 μl細胞裂解液提取各組細胞蛋白，濃度一致后以50 μg蛋白上樣，用10%的SDS、PAGE膠垂直電泳分離電泳1 h后轉至PVDF膜，用含5%脫脂奶室溫封閉1 h，加1∶1 000稀釋的一抗過夜，TBS清洗3次，每次5 min，加入1∶2 000辣根過氧化物酶標記的抗體室溫孵育2 h，再用TBS清洗3次，ECL發(fā)光劑于暗室中曝光和顯影。所用內參為β-actin，條帶灰度分析使用Quantity One軟件系統(tǒng)。

1.2.4 ELISA方法檢測ERK1/2特異性阻斷劑PD98059分別作用于離體培養(yǎng)的海馬神經元后觀察GABA分泌的改變 收集對照組、SDF-1組、PD98059組和SDF-1+PD98059組海馬神經元培養(yǎng)上清液，分別于包被了GABA抗體的酶標板中加入10 μl培養(yǎng)上清液，常規(guī)ELISA方法檢測GABA的濃度。450 nm波長檢測吸光度，并根據標準曲線計算出相應的GABA含量。

1.2.5 RT-PCR檢測PD98059阻斷ERK1/2信號通路后GAD65和GAT-1mRNA表達水平 參照Trizol法提取對照組、SDF-1組、PD98059組和SDF-1+PD98059組的總RNA，以用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度并調成等濃度后，取500 ng總RNA，經逆轉錄酶轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列如下：GAD65PCR反應條件為94℃預變性1 min后, 94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min,共31個循環(huán), 72℃延伸4 min。GAT-1 PCR反應條件為: 94℃預變性2 min后, 94℃ 30 s、61℃ 30 s、72℃ 1 min,共35個循環(huán), 72℃延伸10 min。反應產物經 1.5 %瓊脂糖凝膠電泳后經電泳凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像, 測定灰度值。以GAD65、GAT-1與參照基因GAPDH灰度值之比作為GAD65、GAT-1 mRNA的相對表達量。

Tab. 1 Primer sequences used for GAD and GAT-1 detection by RT-PCR

GeneSequenceGAP-DHF5'GGTGAAGGTCGGTGTCAACG-GATT3'R5'GATGCCAAAGTTGTCATGGAT-GACC3'?GAD65F5'CGCCCCTGTATTTGTACT-AC3'R5'GCCAAGAGAGGATCAAAAGC3'GAT-1F5'ACGCTTCGACTTCCTCATGTC-CTGT3'R5'GAATCAGACAGCTTTCG-GAAGTTGG3'

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 離體培養(yǎng)大鼠海馬神經元形態(tài)學觀察

體外接種的海馬神經元最初呈圓形或錐形，均勻分散生長。24 h后基本可貼壁，開始出現小的突起，部分細胞呈梭形。3 d后細胞生長加快，細胞明顯變大，細胞膜完整清晰，胞體發(fā)亮，周邊有光暈，神經元突起增多。細胞培養(yǎng)5 d后胞體、樹突及軸突生長迅速，交織成網，細胞呈現融合性生長(圖1A)。神經元特異性烯醇化酶NSE鑒定，體外培養(yǎng)的海馬神經元70%以上表達陽性(圖1B)。

Fig. 1 Morphological characteristics of hippocampus neurons A: Hippocampus neurons (×100)；B: NSE expression in hippocampus neurons (×40)

2.2 SDF-1對海馬神經元中ERK信號通路的影響

Total-ERK無明顯變化的情況下，對照組灰度比值為(0.80±0.03)而SDF-1組灰度比值為(0.94±0.05)，兩者相比有顯著差異性(P<0.05,圖2)。說明在離體培養(yǎng)的海馬神經元中SDF-1激活了ERK信號通路。SDF-1+AMD3100組灰度比值為(0.68±0.27)，與SDF-1組相比有顯著差異(P<0.05)。SDF-1與受體CXCR4結合后，激活了下游信號ERK信號通路，但是并未出現ERK磷酸化過程完全阻斷，提示SDF-1可能與CXCR4之外的其他受體結合，改變ERK的磷酸化過程。

Fig. 2 Phosphorylation of ERK1/2 signaling pathway induced by SDF-1

2.3 ERK1/2信號轉導通路對SDF-1介導的分泌GABA的影響

SDF-1組的GABA含量與對照組GABA含量明顯下降(P<0.05)，這和研究已經證實了的在離體培養(yǎng)的海馬神經元中SDF-1通過其受體CXCR4抑制了神經遞質GABA的分泌結論相一致。SDF-1+PD98059組的GABA含量相對于只加入SDF-1的實驗組GABA含量有所上升，可以部分逆轉SDF-1對GABA分泌的抑制作用，結果表明ERK1/2信號轉導通路直接參與了SDF-1介導的海馬神經元神經遞質GABA的分泌。

GroupGABAControl722.39±37.46SDF-1566.62±69.15*PD98059740.32±43.15*SDF-1+PD98059613.94±96.66#

SDF-1: Stromal cell derived factor

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSDF-1 group

2.4 ERK信號通路對SDF-1介導的對 GAD和GAT的mRNA和蛋白的表達的影響。

RT-PCR檢測PD98059阻斷ERK1/2信號通路后GAD65和GAT-1 mRNA的表達。GAT-1/GAPDH灰度比值表示GAT-1 mRNA相對表達程度；GAD65/GAPDH比值表示GAD-65 mRNA相對表達程度。結果顯示：SDF-1通過ERK信號通路抑制GAD65和GAT-1 mRNA的表達。GAT-1和GAD65 mRNA灰度比值SDF-1組與SDF-1+PD98059組有顯著差異性(圖3)。

Western blot檢測GAD和GAT蛋白在PD98059阻斷ERK1/2信號通路后的表達，GAT/Actin灰度比值表示GAT蛋白相對表達程度；GAD/Actin比值表示GAD蛋白相對表達程度。結果顯示與對照組相比，SDF-1組GAD和GAT蛋白降低(P<0.05)；與SDF-1組相比，SDF-1+PD98059組GAD蛋白表達升高和(P<0.05)，而GAT蛋白表達量升高，不具有統(tǒng)計學意義(圖4)。

3 討論

帕金森病和阿爾茨海默病等是常見的老年性疾病，但其發(fā)病機制尚不明確。存在遺傳因素、興奮性毒性、氧化應激、環(huán)境毒素等假說[1]，基質細胞衍生因子SDF-1由Shirozu等[2,3]首先克隆發(fā)現。研究表明SDF-1和其受體CXCR4在海馬組織中廣泛表達，并且參與小腦、海馬和大腦新皮質的發(fā)育[4]，提示其對神經系統(tǒng)有調控作用。ERK1/2信號通路主要通過影響細胞周期機制來調節(jié)細胞增殖[5]。ERK1/2最先由Ray和Sturgill在1988年從3T3-L1脂肪母細胞中純化出來的，是細胞外信號與核反應間信息傳遞的共同通路[6]。ERK1/2信號轉導通路的激活與海馬的長時程增強(LTP)和學習記憶功能密切相關[7]。有研究證明大鼠學習記憶能力和癲癇發(fā)作程度與海馬內P-ERK1/2表達量呈同向性。許多研究已經證實在離體培養(yǎng)的人臍帶血干細胞中SDF-1/CXCR4可以活化ERK信號轉導通路[8]。但是在離體培養(yǎng)的大鼠海馬神經元中SDF/CXCR4如何激活ERK信號通路的機制還不清楚。為了進一步研究在離體培養(yǎng)的海馬神經元中SDF-1對ERK磷酸化的影響，以及ERK信號轉導通路與神經遞質GABA分泌的關系。

Fig. 3 Effect of SDF-1 on GADPHmRNA and GAT-1mRNA after blocked ERK signaling pathway

Fig. 4 Effect of ERK signaling pathway on the protein expression of GAT-1 and GAD65/67 induced by SDF-1

GABA是一種重要的抑制性神經遞質，參與調節(jié)突觸可塑性，對學習記憶起負調節(jié)作用。本實驗室的研究證實在離體培養(yǎng)的大鼠海馬神經元中SDF-1通過CXCR4受體活化細胞內通路可以引起乙酰膽堿(Ach)分泌的增加和GABA分泌的減少。但是期間的信號通路是否與ERK有關,尚未見報道。本實驗中選用離體培養(yǎng)的大鼠海馬神經元作為實驗材料，將其分泌的GABA作為觀察指標，以觀察ERK信號轉導通路的激活對SDF-1引起的神經元GABA分泌的影響及機制。結果證明了ERK1/2信號轉導通路可能參與了SDF-1/CXCR4對神經元GABA分泌的影響。

SDF-1通過與其相應受體CXCR4結合使細胞內Ca2+大量釋放降低細胞內的腺苷酸環(huán)化酶cAMP，來活化多種信號通路，包括PI3K 、核轉錄調控因子NFKB和MAPK/ERK1/2等信號通路[10]。這暗示SDF-1/CXCR4除了通過ERK1/2信號轉導通路影響離體培養(yǎng)的GABA的分泌還有其他信號通路的參與。

為進一步研究離體培養(yǎng)的海馬神經元中SDF-1/CXCR4通過ERK信號通路直接介導神經遞質GABA的分泌。PD98059可以通透細胞，選擇性抑制MEK1/2，從而抑制ERK1/2的磷酸化和激活，用PD98059可以確定在生物反應中是否有ERK1/2信號通路的參與。

GABA是中樞神經系統(tǒng)內最重要的抑制性氨基酸類神經遞質，GABA在神經末梢中由谷氨酸經谷氨酸脫羧酶(GAD)脫羧后生成。神經系統(tǒng)中谷氨酸的含量豐富，大約是GABA含量的四倍，GABA的合成主要受GAD含量的影響，所以GAD在腦內的分布與GABA的濃度呈正相關。SDF-1/CXCR4通過ERK1/2信號通路對GABA分泌的影響，采用選擇研究GAD和GAT-1在轉錄水平和翻譯水平的表達。結果SDF-1抑制GAD65/67的mRNA蛋白表達水平，PD98059引起GAD65/67的mRNA表達水平升高及蛋白表達量升高，說明ERK信號通路通過影響GABA的合成而影響了GABA的分泌。而在同時加入SDF-1和PD98059后GAT-1在mRNA和蛋白表達存在變化，但這種變化可能是由于阻斷ERK信號通路引起的也可能是由于GABA分泌的變化，為保持神經元興奮性的正常，GAT-1表達量隨之降低。具體機制還有待進一步的探討。

本實驗觀察到SDF-1使ERK1/2磷酸化水平升高即活化ERK1/2信號通路。SDF-1通過細胞膜表面相應受體CXCR4引起胞內GABA分泌的減少，而同時加入ERK1/2阻斷劑PD98059,可使GABA分泌出現部分逆轉性升高,這提示GABA的分泌可能與ERK1/2信號轉導通路有關。進一步的實驗證明SDF-1抑制GAD65/67和GAT-1 mRNA和蛋白表達水平，同時加入PD98059引起GAD65/67和GAT-1 mRNA表達水平升高及蛋白表達量升高，這說明ERK1/2 參與了SDF-1介導的GABA的合成和轉運。這提示GABA的分泌與ERK1/2信號通路有關，但是該阻斷劑并不能完全阻斷SDF-1刺激GABA的分泌，說明SDF-1下游可能有其他通路參與。

有關帕金森病和阿爾茨海默病的神經保護作用仍舊是難點，雖然干細胞的干預帶來了一線曙光[12]，但是由于干細胞分化的可控性極其復雜，其在臨床應用尚存在許多困難[13]。因此，直接觀察大鼠海馬神經元信號轉導通路的作用仍是研究的熱點。并且經研究證實，在離體培養(yǎng)的大鼠海馬神經元中ERK1/2信號轉導通路參與了SDF-1對GBAB分泌的影響。為帕金森和阿爾茨海默病等疾病的防治提供新的途徑。

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ERK activation effects on GABA secretion inhibition induced by SDF-1 in hippocampal neurons of rats*

ZHANG Zi-juan1, GUO Mei-xia2, XING Ying3△

(1. Basic Medical College of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046; 2. Three Full College Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003; 3. Department of Physiology, Medical School of Zhengzhou University, Zhengzhou 450003, China)

Objective: To investigate the effect of extracellular regulating kinase (ERK) signaling pathway on the secretion of γ-aminobutyric acid(GABA) in cultured rat hippocampal neurons induced by stromal cell derived factor-1(SDF-1). Methods: The hippocampal neurons of newborn SD rats were cultured and identified in vitro; the phosphorylation level of ERK1/2 was examined by Western blot; ELISA was used to detect the effect of PD98059, a ERK1/2 specific blocker on GABA secretion of cultured hippocampal neurons and Western blot were adopted to measure the protein expression levels of glutamate decarboxylase (GAD65/67) and gamma aminobutyric acid transporter (GAT) ; after blocking ERK1/2 signaling pathway with PD98059; RT-PCR was used to detect the mRNA expression levels of GAT-1 and GAD65 after treated with PD98059. Results: The levels of ERK1/2 phosphorylation were increased significantly by SDF1 acting on hippocampal neurons, and CXCR4 receptor blocker AMD3100,could inhibit SDF-1 induced ERK1/2 activation; SDF-1 could inhibit the secretion of GABA in cultured hippocampal neurons, and ERK1/2 specific inhibitor PD98059, could partly reverse the inhibition of GABA secretion by SDF-1. The effects of SDF-1 on cultured hippocampal neurons was to decrease the mRNA genesis of glutamic acid decarboxylase GAD65 and GABA transporter GAT-1, besides, ERK inhibitor PD98059 could effectively flip the effect of SDF-1. The results of Western blot showed that SDF-1 could inhibit the protein expression of GAT-1 and GAD65/67 in hippocampal neurons and the inhibition of GAT-1 and GAD65/67 protein expression could be partially restored by ERK1/2 blocker. Conclusion: SDF-1 acts on the CXCR4 of hippocampal neurons in vitro, and inhibits the expression of GAD by activating the ERK1/2 signaling pathway, and this may represent one possible pathway of GABA secretion inhibition.

hippocampal neuron； GABA； ERK； SDF-1

國家自然科學基金資助項目(31000514)

2015-01-19 【修回日期】2015-06-10

R338.2

A

1000-6834(2015)05-443-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.015

△【通訊作者】Tel: 13525549156； E-mail: xingyingprofessor@126.com