王園園， 鄭夢曉， 趙美平， 黃林靜， 王萬鐵△

(1. 溫州醫(yī)科大學病理生理學教研室， 浙江 溫州 325035； 2. 浙江省立同德醫(yī)院病理科， 杭州 310012)

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ERK1/2 對低氧大鼠肺動脈平滑肌細胞Kv1.5通道表達的影響*

王園園1,2， 鄭夢曉1， 趙美平1， 黃林靜1， 王萬鐵1△

(1. 溫州醫(yī)科大學病理生理學教研室， 浙江 溫州 325035； 2. 浙江省立同德醫(yī)院病理科， 杭州 310012)

目的：探討ERK1/2 對低氧大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)電壓門控性鉀離子通道(Kv1.5)表達的影響及其機制。方法：原代培養(yǎng)SD大鼠PASMCs，選3～6代PASMCs隨機分組：①正常組(N)；②低氧組(H)；③DMSO組(HD)；④U0126組(HU)：10 μmol/L U0126；⑤茴香霉素組(HA)：10 μmol/L茴香霉素。每組3皿細胞，正常組于常氧培養(yǎng)箱(5% CO2，37℃)，其余各組均加入0.05%二甲基亞砜(DMSO)于低氧培養(yǎng)箱(5%CO2，2%O2，37℃)，均培養(yǎng)60 h。采用RT-PCR和Western blot法測定PASMCs Kv1.5 mRNA和蛋白表達。結(jié)果：與N組相比，H、HD、HA 組Kv1.5 mRNA和蛋白表達均明顯降低(P<0.05)；較之H 和HD組，HU組Kv1.5 mRNA和蛋白表達明顯上升((P<0.05)，與HU組比較，HA組Kv1.5 mRNA和蛋白表達均明顯降低(P<0.05)。結(jié)論：低氧降低Kv1.5 mRNA和蛋白表達，U0126能夠?qū)沟脱跻鸬腒v1.5通道的低表達，茴香霉素對低氧條件下Kv1.5通道表達無明顯影響，但其表達仍顯著低于常氧組，提示低氧可能通過干預(yù)ERK1/2 信號通路抑制Kv1.5通道表達引起低氧性肺動脈高壓。

低氧；Kv1.5通道；ERK1/2；肺動脈高壓；大鼠。

電壓門控性鉀離子通道(Kv)是決定肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells， PASMCs)靜息膜電位的主要通道，PASMCs的Kv通

道對肺動脈張力起重要作用[1]，因其具有顯著的氧敏感性而參與低氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction， HPV)和低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension ，HPH)的形成和發(fā)展。持續(xù)性低氧通過NADPH氧化酶(NOX4)誘導活性氧簇(reactive oxygen species ，ROS)增加，從而降低Kv通道電流[2]。另外，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein inases,MAPKs)信號通路在HPH發(fā)生發(fā)展中的作用也越來越受到重視。低氧[3]引起肺動脈高壓大鼠肺組織磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK1/2)表達明顯增強。慢性低氧時肺動脈細胞外過氧化物歧化酶 (extracellular superoxide dismutase， EC-SOD)的降低導致肺動脈氧化劑/抗氧化劑平衡失調(diào)，通過激活ERK1/2導致早期生長反應(yīng)，引起肺血管重建[4]。那么低氧過程中ERK1/2通路和Kv1.5通道之間是否存在某種聯(lián)系？因此本研究在低氧大鼠模型上觀察ERK1/2MAPK通路抑制劑U0126和激活劑茴香霉素對Kv1.5通道表達的影響，探討HPH的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Gibco公司。SM α-actin、羊抗兔二抗購自abcam公司，Ⅰ型膠原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白、U0126、茴香霉素、Kv1.5抗體購自Sigma公司。RT-PCR試劑盒購自Fermentas life sciences公司。BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司。β-actin抗體購自上?？党枪?。顯微外科用顯微鏡、恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma)、低氧O2/N2培養(yǎng)箱(Herareus)、PCR儀(Thermo Hybaid)、電泳槽，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-3型，北京六一儀器廠)、蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad), EXL-808酶標儀(USA ),凝膠定量軟件Quantity One(Bio-Rad) 等。

1.2 大鼠PASMCs培養(yǎng)與分組

SPF級雄性SD大鼠，體重200～250 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，5%水合氯醛腹腔麻醉后，迅速取出肺組織，置于50 ml 4℃無菌生理鹽溶液中(PBS(mmol/L)： NaCl 135， KCl 4.7，KH2PO41.2，NaHCO325，CaCl22.5，EDTA 0.026，glucose 5.0，pH7.4)，超凈工作臺內(nèi)體式顯維鏡下分離3～4級肺動脈分支，去除內(nèi)皮和外膜，將平滑肌層剪成1 mm×1 mm大小，1 000×g,離心5 min棄PBS液，加入含有消化酶的低鈣溶液(Ⅰ型膠原酶，牛血清白蛋白，木瓜蛋白酶，二硫蘇糖醇)，37℃孵育18 min，加入培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打，靜置3 min，吸出細胞懸液于無菌離心管中。余未消化組織塊繼續(xù)37℃消化5 min，重該步驟，直至完全消化，收集細胞懸液，1 000×g離心5 min，棄上清。用含20%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。選3～6代對數(shù)生長期PASMCs按5×105cells/ml的密度接種，待細胞融合成單層時，換成無血清培養(yǎng)基饑餓24 h使細胞周期同步化并隨機分組：(1)正常組(N)：5%CO2，37℃；(2)低氧組(H)：5%CO2，2%O2， 37℃；(3)DMSO對照組(HD)：0.05%DMSO，5%CO2，2%O2，37℃；(4)U0126組(HU)：10 μmol/L U0126,0.05%DMSO，5%CO2，2%O2，37℃；(5)茴香霉素組Anisomycin(HA)：10 μmol/L茴香霉素 0.05%DMSO，5%CO2，2%O2，37℃。每組3皿細胞，培養(yǎng)60 h。因U0126和茴香霉素均由DMSO溶解，所以本實驗設(shè)計了DMSO對照組(HD)以消除DMSO對研究結(jié)果的影響。采用血氣分析儀評估低氧狀態(tài)(PO2: 25～35 mmHg),低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后達到低氧狀態(tài)。

1.3 觀察指標

1.3.1 RT-PCR 測定PASMCs Kv1.5 mRNA表達 按試劑盒說明提取總RNA,于260 nm、280 nm測吸光度比值確定純度和量，取總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(42℃ 60 min，1循環(huán)，70℃ 5 min，1循環(huán)，4℃ 5 min，1循環(huán))，反應(yīng)體系為20 μl。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)(95℃ 6 min，1循環(huán)；95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，40循環(huán)； 72℃ 10 min，1循環(huán))，反應(yīng)體系為25 μl ，Kv1.5上游序列 5＇-ACT TCG CAG AGG CAG ACA ATC A-3＇，下游序列 5＇-GGT TGC CTT GTT CTT CCT TCA G-3＇，擴增片段為267 bp。β-actin引物：上游序列 5＇-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3＇,下游序列 5＇-TCG GGG GAT CGG AAC CGC TCA-3＇，擴增片段為400 bp,PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性6 min，95℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用MUVB-20凝膠照相分析系統(tǒng)測定吸光度值(A)，以Kv1.5與β-actin A值之比作為Kv1.5 mRNA的相對表達量。

1.3.2 Western blot 法測定PASMCs Kv1.5蛋白表達 每皿細胞加入含1 mmol/L PMSF的細胞裂解液100 μl，冰上靜置20 min，12 000×g,離心20 min，吸取上清蛋白，分裝于200 μl去酶EP管中，-70℃保存。SDS-PAGE凝膠電泳，上樣體積為20 μl，上樣量為50 μg。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜55 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。TBST稀釋的兔抗鼠Kv1.5多克隆抗體(1∶400)、內(nèi)參β-actin(1∶10 000)， 4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(1∶50 000)，室溫孵育1 h。顯影液中顯影、定影液中定影。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 激光共聚焦免疫熒光法鑒定PASMCs

Fig. 1 Rat PASMCs by primary culturing(×100)

PASMCs呈典型的“峰-谷”狀生長。鏡下顯示細胞呈梭形，折光性好，細胞核位于細胞中央，呈卵圓形(圖1)。細胞經(jīng)小鼠抗大鼠α-actin單克隆抗體孵育，F(xiàn)ITC-PI 染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察，約99%呈陽性反應(yīng)，即高倍鏡下可見胞漿內(nèi)大量發(fā)綠色熒光、與細胞長軸平行的纖維細絲，此為平滑肌α-肌動蛋白，核卵圓形居中，呈紅色 (圖2)。這說明PASMCs培養(yǎng)成功，細胞純度高，可以用于模型復(fù)制。

Fig. 2 Immunofluorescence identification of rat PASMCs(×600)

2.2 各組Kv1.5 mRNA和蛋白表達比較

與N組相比，H組、HD組、HA 組Kv1.5 mRNA和蛋白表達均明顯降低(P<0.05)；較之H 組和HD組，HU組Kv1.5 mRNA和蛋白表達明顯上升，差異具有顯著性(P<0.05)，與HU組比較，HA組Kv1.5 mRNA表達明顯降低(P<0.05，表1，圖3、圖4)。這說明低氧能夠明顯降低Kv1.5通道表達，而U0126能夠抵抗低氧引起的Kv1.5通道的低表達；低氧條件下茴香霉素并未明顯影響Kv1.5通道的表達，但Kv1.5通道的表達仍顯著低于常氧組及U0126組。

Fig. 3 Espression of Kv1.5 mRNA in N,H,HD,HU and HA groups N: Normal group; H: Hypoxic group; HD: DMSO group; HU: U0126 group; HA; Anisomycin group

Fig. 4 Espression of Kv1.5 protein in N,H,HD,HU and HA groups N: Normal group; H: Hypoxic group; HD: DMSO group; HU: U0126 group; HA; Anisomycin group

GroupmRNAProteinN0.457±0.0890.486±0.070H0.370±0.091*0.377±0.058*HD0.366±0.083*0.385±0.070*HU0.473±0.085#△0.493±0.086#△HA0.372±0.099*▲0.389±0.098*

N: Normal group; H: Hypoxic group; HD: DMSO group; HU: U0126 group; HA; Anisomycin group

*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsHD group;▲P<0.05vsHU group

3 討論

HPH是由缺氧引起的，肺動脈持續(xù)性收縮和肺血管結(jié)構(gòu)重建。HPH可以導致肺循環(huán)系統(tǒng)血流動力學改變，引起右心室肥厚，右心衰竭。HPH發(fā)病機理并未完全明確，因此臨床上仍無十分有效的治療方法。明確HPH的發(fā)病機制，尋求有針對性的治療方案對指導臨床用藥和提高患者生存質(zhì)量有著極其重要的意義。

電壓門控性鉀通道(Kv)，是鉀通道超家族中的重要成員。低氧抑制Kv通道電流，導致PASMCs去極化，胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度升高，引起肺血管收縮。肺Kv通道在細胞增殖和凋亡過程中也起關(guān)鍵性的作用[5]。有研究表明：左向右分流性肺動脈高壓的發(fā)病原因是因為Kv通道受抑制[6]。因此認為低氧通過抑制Kv通道導致肺血管收縮和肺血管結(jié)構(gòu)重建，從而引起HPH。

PASMCs表達Kv1～9亞型，但認為Kv1.5，Kv1.2，Kv2.1亞型或單獨或共同參與HPV的形成和發(fā)展[7-11]。PASMCs Kv1.5通道的低表達能夠?qū)е聦m內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠成年以后慢性肺動脈高壓的形成[1]。氟西汀通過降低細胞內(nèi)Ca2+濃度對抗大劑量內(nèi)皮素-1引起的人肺動脈平滑肌細胞凋亡減少和Kv1.5通道下調(diào)[5]。本實驗結(jié)果顯示：慢性低氧可以明顯降低大鼠3～4級阻力性PASMCs Kv1.5 mRNA和蛋白表達，說明低氧下調(diào)Kv1.5通道表達，這與已經(jīng)有的研究結(jié)果一致。但低氧通過何種方式調(diào)節(jié)Kv1.5通道仍未可知，這關(guān)乎HPH的發(fā)病機制及治療方案，是否信號通路系統(tǒng)也參與HPH過程？

絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)家族是非常保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是信號轉(zhuǎn)導過程中一組主要的信號分子，在生長發(fā)育和疾病發(fā)生過程中起重要作用。該家族有3個主要成員，即細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERKs)，p38MAPK和C-jun N氨基末端激酶/應(yīng)激激活蛋白激酶(JNKs)。有研究表明，降鈣素基因相關(guān)肽通過ERK1/2/p27/c-fos/c-myc通路抑制缺氧誘導的PASMCs增殖[12]。pERK1/2和丙酮酸脫氫酶參與5-羥色胺抑制PASMC凋亡過程[13]。羥基前列腺素脫氫酶通過ERK1/2介導的PAR-2表達刺激肺動脈平滑肌細胞周期進程和細胞增殖，導致缺氧引起的肺血管重構(gòu)[14]。因此認為，ERK1/2是PASMC凋亡的調(diào)節(jié)因子，是肺動脈高壓的潛在治療靶點[15]。既然ERK1/2和Kv1.5通道在低氧性肺動脈高壓過程中均發(fā)揮重要作用、那么二者之間是否存在某種聯(lián)系？亦或是調(diào)節(jié)與被調(diào)節(jié)的關(guān)系？茴香霉素能夠激活絲裂原活化激酶MAPK中的幾個主要通路，即ERK1/2通路，p38MAPK通路和JNK通路[16，17]。

本實驗選用茴香霉素作為ERK1/2通路激活劑，選擇U0126作為ERK1/2通路抑制劑分別干預(yù)低氧過程，觀察Kv1.5 mRNA和蛋白表達變化，這在以往的研究中比較罕見，旨在進一步明確HPH的發(fā)病機制。結(jié)果顯示：持續(xù)性低氧60 h(PO2:25～35 mmHg)能夠明顯降低Kv1.5 mRNA和蛋白表達，而U0126能夠顯著對抗低氧引起的Kv1.5 mRNA和蛋白降低。這說明U0126能夠明顯抑制低氧條件下的ERK1/2通路，從而降低Kv1.5 mRNA和蛋白表達；茴香霉素是ERK1/2通路的激活劑，其對低氧條件下Kv1.5 mRNA和蛋白表達無明顯影響(H、HD和HA組間無顯著差異，但HA組顯著低于N組)，推測低氧可能已經(jīng)激活大部分甚至是全部的ERK1/2通路，從而引起Kv1.5 mRNA和蛋白表達降低。結(jié)論：低氧通過干預(yù)ERK1/2信號通路(可能激活ERK1/2)，下調(diào)Kv1.5通道m(xù)RNA和蛋白表達，這可能是低氧性動脈高壓的形成原因。但低氧是通過何種方式干預(yù)ERK1/2通路，而ERK1/2又是通過哪些信號分子下調(diào)Kv1.5通道表達仍有待進一步研究。本實驗組之前的研究表明低氧能夠激活p38MAPK信號通路，這與本實驗的結(jié)果相似。那么低氧是否同時或是先后激活p38MAPK和ERK1/2通路，從而抑制Kv1.5通道，兩個通路之間是否存在協(xié)同或是競爭的關(guān)系，亦有待于進一步的研究明確。

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Effect of ERK1/2 on rat pulmonary artery smooth muscle cells Kv1.5 channel in the process of hypoxia

WANG Yuan-yuan1,2， ZHENG Meng-xiao1, ZHAO Mei-ping1, HUANG Lin-jing1, WANG Wan-tie1△

(1. Department of Pathophysiology， Wenzhou Medical University， Wenzhou 3250351； 2. Department of Pathology， Tongde Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China)

Objective: To explore the effect of ERK1/2 MAPK pathway on the expression of Kv1.5 channel, a voltage-gated potassium ion channel, in rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) and its mechanisms during the process of hypoxia. Methods: The PASMCs derived from SD rats were cultivated primarily. The third to sixth generation of PASMCs were divided into 5 groups randomly: ①Normal group (N); ②Hypoxic group (H); ③Demethy sulfoxide(DMSO) group (HD); ④U0126 group (HU): 10 μmol/L U0126; ⑤Anisomycin group (HA): 10 μmol/L anisomycin. There were three dishes of cells in each group. The cells in normal group were cultured in normoxic incubator (5%CO2, 37℃), the cells in other groups were added to 0.05% DMSO in the hypoxic incubator (5%CO2, 2%O2,37℃), all cells were cultured for 60 h. RT-PCR and Western blot were used to detected the espressions of Kv1.5 mRNA and protein in PASMCs. Results: Compared with N group, the expressions of Kv1.5 mRNA and protein in H，HD and HA groups were reduced significantly (P<0.05); Compared with H group and HD groups, Kv1.5 mRNA and protein expressions in HU group were increased sharply(P<0.05). Compared with the HU group, Kv1.5 mRNA and protein expressions in HA groups were significantly lower (P<0.05). Conclusion: Low oxygen reduced Kv1.5 mRNA and protein expressions, U0126 could resistant the Kv1.5 channel lower expression caused by hypoxia. Anisomycin had no significant effect on Kv1.5 channel expression under hypoxia, but the expression of Kv1.5 was still significantly lower than the normal oxygen group. These data suggest that hypoxia may cause hypoxic pulmonary hypertension by interfering ERK1/2 signaling pathway to inhibit Kv1.5 channels.

hypoxia； potassium ion channel； ERK1/2； pulmonary hypertension； rats

浙江省中醫(yī)藥重點學科建設(shè)計劃項目(2012-XK-A28)；溫州市科技計劃一般項目(Y20120161)；溫州市醫(yī)藥衛(wèi)生科學研究項目(2013B03)

2014-11-07 【修回日期】2015-03-10

R331

A

1000-6834(2015)05-418-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.010

△【通訊作者】Tel: 0577-86689817； E-mail: wwt@wzmc.edu.cn