李 曙， 金 鑫， 龍雪峰， 賈金禮， 張根葆， 洪 云

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 2. 藥理學(xué)教研室， 3. 臨床醫(yī)學(xué)院， 4. 弋磯山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科， 安徽 蕪湖 241002)

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尖吻蝮蛇毒抑瘤組分Ⅰ對血管內(nèi)皮細胞遷移活性的影響*

李 曙1， 金 鑫2， 龍雪峰3， 賈金禮1， 張根葆1， 洪 云4△

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 2. 藥理學(xué)教研室， 3. 臨床醫(yī)學(xué)院， 4. 弋磯山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科， 安徽 蕪湖 241002)

目的：觀察尖吻蝮蛇毒抑瘤組分Ⅰ(AAVC-Ⅰ) 對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)遷移活性的影響，探討AAVC-Ⅰ抑制血管生成的可能機制。方法：體外培養(yǎng)HUVECs，分別用AAVC-Ⅰ(0、20、40、80 μg/ml)處理細胞后再孵育24 h。劃痕實驗和趨化小室實驗觀察AAVC-Ⅰ對內(nèi)皮細胞遷移活性的影響；采用RT-PCR、Western blot法檢測藥物作用前后P選擇素(P-selectin)和細胞間粘附因子(ICAM-1)mRNA和蛋白水平的變化。結(jié)果：與正常組HUVECs比較，AAVC-Ⅰ各濃度組細胞遷移能力都有不同程度降低，P-selectin和ICAM-1 mRNA表達均明顯下降。結(jié)論：AAVC-Ⅰ可能通過下調(diào)P-selectin和ICAM-1 mRNA和蛋白水平抑制內(nèi)皮細胞遷移活性。

蝮蛇毒抑瘤組分; 人臍靜脈內(nèi)皮細胞; 遷移

血管內(nèi)皮細胞是血管內(nèi)壁形成的重要組成部分，其遷移活性影響血管的生成[1]，而血管生成在生理和病理活動中發(fā)揮重要的作用，尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要[2,3]。因此抑制血管內(nèi)皮細胞遷移生成血管是治療腫瘤的重要靶點，已成為尋找抗癌藥的重要方向。

蛇毒是含有多種生物活性蛋白的混合物，研究證明蛇毒具有廣泛的生物學(xué)活性。目前已經(jīng)從蛇粗毒中成功的分離出多種酶類和肽類物質(zhì)，這些物質(zhì)被證實除了具有抗栓、止血、鎮(zhèn)痛作用外，還具有抗腫瘤的作用[4]。近年已有報道，一種名為Salmosin的蝮蛇毒抑瘤成分主要通過干擾內(nèi)皮細胞粘附過程

阻止血管生成起到抗瘤作用[5]。以往本課題組以尖吻蝮蛇蛇毒為對象，提取、分離和純化出蛇毒抑瘤活性物質(zhì) (component I from agkistrodon acutus venom，AAVC-Ⅰ)[6]，具有明顯地抑制腫瘤細胞增殖活性[7,8]。為了深入了解該蛇毒組分抗腫瘤增殖的可能特性，本實驗以人血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)為靶細胞，觀察AAVC-Ⅰ對內(nèi)皮細胞遷移的作用，及其抑制內(nèi)皮細胞生成血管的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVECs(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，AAVC-Ⅰ(皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所，純度99%)，細胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清(Hyclone公司)，0.25%EDTA胰酶(碧云天生物技術(shù))，Transwell小室(Corning公司)，鼠抗 GAPDH抗體、兔抗P-selectin抗體、兔抗ICAM-1抗體(BOSTER生物公司)，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG/ HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(ZSGB生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將原代培養(yǎng)的HUVECs接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，當(dāng)生長至90%融合時，PBS沖洗3次，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～5代生長良好的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 劃痕實驗 將1 ml的細胞懸液接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，使每孔含有2.8×105cells，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，用槍頭在鋪滿細胞的孔板上劃痕。水平和垂直的劃十字形，去除劃痕導(dǎo)致脫落的細胞，顯微鏡下拍照，測量劃痕寬度，隨機分為四組：空白組，不加任何處理因素；AAVC-Ⅰ低濃度組(20 μg/ml)；AAVC-Ⅰ中濃度組(40 μg/ml)；AAVC-Ⅰ高濃度組(80 μg/ml)組；放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出拍照。計算細胞劃痕愈合率，劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%[9]。

1.2.3 Transwell小室實驗 每孔上室(即BD小室中)加入2×104cells，用300 μl無血清培養(yǎng)液重懸，下室(即24孔板中)加入680 μl含血清培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育36 h，用棉簽擦掉上層小室內(nèi)HUVEC，將小室放入，固定液，室溫固定 15 min之后，用 0.1%結(jié)晶紫染色 20 min，用 PBS 洗4次，晾干，顯微鏡下拍照、計數(shù)。按照公式計算加藥對細胞侵襲的抑制率：抑制率%=(空白組-給藥組) /空白組×100%[10]。

1.2.4 PCR檢測P-selectin和ICAM-1 mRNA的表達Trizol一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA作為模板，進行PCR擴增，采用凝膠分析系統(tǒng)分析，條帶強度用積分光密度值(IOD)表示(積分光密度=平均光密度×發(fā)光面積)。GAPDH引物上下游：5-CCACTAGGCGCTCACTGTTC-3，5-ATGGAATTTGCCATGGGTGGA-3；ICAM-1引物上下游：5-CAACCTCAGCCTCGCTATGG-3，5-AACAACTTGGGCTGGTCA CA-3；p-selectin引物上下游：5-ACATCAAGAGTCCGTCAGCC-3，5-CAGAAGCCAAGCATTCCAGC-3

1.2.5 Western印跡檢測法檢測P-selectin和ICAM-1 蛋白的表達 細胞培養(yǎng)、分組，24 h后，各組均采用一步提取法提取總蛋白，-80℃冰箱保存，SDS-PAGE電泳(10%)。NC膜放入封閉緩沖液室溫封閉1 h；孵育一抗，4℃過夜；孵育二抗，37℃×1 h；最后用PBS漂洗3次，每次5 min；采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，拍照、顯影。自動圖像分析儀對蛋白條帶掃描、分析。

2 結(jié)果

2.1 劃痕實驗結(jié)果

HUVECs培養(yǎng)、劃痕后，與空白組比較，實驗組分別用20、40和80 μg/ml AAVC-Ⅰ培養(yǎng)24 h，爬行速度降低，遷移距離明顯縮短，劃痕愈合率低于空白組(P<0.05，圖1，見彩圖頁Ⅰ)，且濃度越高，抑制效果越明顯。

Tab. 1 Migratory ability of HUVECS after treated by AAVC-Ⅰobserved by scratch assay

GroupMigratoryability(%)Blank82.6±6.53AAVC-I20μg/ml55.4±6.18*AAVC-I40μg/ml41.5±4.39**AAVC-I80μg/ml29.7±2.18**

AAVC-I：Component I from agkistrodon acutus venom； HUVECs： Human umbilical vein endothelial cells

*P<0.05,**P<0.01vsblank group

2.2 內(nèi)皮細胞侵襲能力的變化

通過對Transwell小室侵襲實驗結(jié)果的觀察，AAVC-Ⅰ處理后穿過人工基底膜的HUVECs比未經(jīng)處理的細胞少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，表2，圖2，見彩圖頁Ⅰ)?？梢夾AVC-Ⅰ對HUVECs細胞體外的侵襲力具有抑制作用。

Tab. 2 Image of HUVECS invasion after treated by AAVC-Ⅰ

GroupInhibilityrateofinvasive(%)Blank 100AAVC-I20μg/ml72.3±8.31*AAVC-I40μg/ml57.4±6.59**AAVC-I80μg/ml48.8±6.02**

AAVC-I： Component I from Agkistrodon acutus venom； HUVECs： Human umbilical vein endothelial cells

*P<0.05,**P<0.01vsblank group

2.3 AAVC-Ⅰ對人臍靜脈HUVECs細胞P-selectin和ICAM mRNA表達水平的影響

通過對RT-PCR檢測結(jié)果分析，與空白組比較，AAVC-Ⅰ各濃度組內(nèi)皮細胞中P-selectin和ICAM-1 mRNA表達水平均有不同程度的下降，差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，表3)。

2.4 AAVC-Ⅰ對人臍靜脈HUVECs細胞P-selectin和ICAM-1蛋白表達水平的影響

通過Western blot檢測結(jié)果分析，與空白組比較，AAVC-Ⅰ各濃度組內(nèi)皮細胞中P-selectin和ICAM-1蛋白表達水平均有不同程度的下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，表4)。

Tab. 3 Expression of P-selectin and ICAM-1 mRNA in HUVECS in all groups

GroupP-select/GAPDHICAM/GAPDHBlankgroup1.15±0.141.42±0.11AAVC-I20μg/ml0.73±0.09*0.89±0.12*AAVC-I40μg/ml0.48±0.04**0.68±0.08**AAVC-I80μg/ml0.39±0.05**0.37±0.02**

AAVC-1： Component I from agkistrodon acutus venom； HUVECs： Human umbilical vein endothelial cells

*P<0.05,**P<0.01vsblank group

Tab. 4 Protein expression of P-selectin and ICAM-1 in HUVECs in all groups

GroupP-select/GAPDHICAM/GAPDHBlankgroup0.86±0.060.82±0.04AAVC-I20μg/ml0.59±0.07*0.76±0.06AAVC-I40μg/ml0.27±0.02**0.48±0.03**AAVC-I80μg/ml0.19±0.03**0.35±0.03**

AAVC-1： Component I from agkistrodon acutus venom； HUVECs： Human umbilical vein endothelial cells

*P<0.05,**P<0.01vsblank group

3 討論

內(nèi)皮細胞遷移活性在多種生理活動中起著重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞遷移是毛細血管和微靜脈的新毛細血管性血管生成的關(guān)鍵[11]，同時內(nèi)皮細胞增殖及遷移活性失調(diào)可直接影響心血管疾病[12,13]和腫瘤[2,3]發(fā)生發(fā)展，尤其以腫瘤最為突出。其生長過程需要持續(xù)的血管生成來為其輸送血液及提供營養(yǎng)物質(zhì)，因而內(nèi)皮細胞遷移活性異常，導(dǎo)致新生血管加快，最終有利于心血管疾病和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14,15]。選擇素家族是一類異親型結(jié)合Ca2+依賴的細胞粘著分子，能與特異糖基識別并結(jié)合，P-選擇素是粘附分子選擇素家族的重要成員，分布在血管內(nèi)皮、血小板上，主要參與介導(dǎo)白細胞與內(nèi)皮細胞的起始粘附，在內(nèi)皮細胞遷移活性中起著重要的作用。Morbidelli等[16]證明P-選擇素能促進內(nèi)皮細胞遷移。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，其分布很廣[17]，在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中起著重要作用[18]，且在血管內(nèi)皮細胞上的表達最強。內(nèi)皮細胞中ICAM-1的表達增強，促進白細胞與內(nèi)皮細胞之間的黏附和內(nèi)皮細胞的遷移，最終誘導(dǎo)血管生成。

因此了解內(nèi)皮細胞功能與臟器損傷的關(guān)系, 使人們能更好掌握某些疾病發(fā)生發(fā)展。近年來也開發(fā)出多種以內(nèi)皮細胞為靶點的血管生成抑制劑，并在臨床腫瘤治療中取得較好療效。蛇毒是一類天然混合毒素，含有許多活性成分，已有報道在蝮蛇毒、蝰蛇毒中含有抗血管生成活性物質(zhì)，最近Kim DS等[19-21]從蝮蛇中提取的名為Salmosin的抑瘤成分能夠在體外抑制血小板聚集和腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移，且發(fā)現(xiàn)與抗腫瘤內(nèi)血管生成有一定關(guān)系；同時通過對該成分調(diào)節(jié)金屬蛋白酶-9和金屬蛋白酶組織抑制因子-1的轉(zhuǎn)錄表達進行研究，對其抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制進行初步實驗研究。這些都表明蛇毒中的活性成分是開發(fā)靶向抗腫瘤藥物的重要生物資源。本課題組前期從皖南尖吻蝮蛇中純化的AAVC-Ⅰ抑瘤成分可以在體外明顯抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集、腫瘤生長[6,22]。同時實驗結(jié)果表明，AAVC-Ⅰ能夠有效的抑制腫瘤(K562/A549)細胞的增殖，藥物濃度和作用時間呈依賴關(guān)系。但該成分能否靶向作用于內(nèi)皮細胞抑制血管生成，抑腫瘤細胞的增殖值得進一步探討。

本實驗以HUVECs細胞作為靶細胞，通過劃痕實驗和Transwell小室侵襲實驗研究發(fā)現(xiàn)，HUVEC細胞具有較強的遷移活性，AAVC-Ⅰ可降低HUVEC細胞遷移活性，并具有濃度依賴性。并且RT-PCR和Western blot實驗證明AAVC-Ⅰ可能通過降低P-selectin 和ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平抑制內(nèi)皮細胞遷移活性及血管生成，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果一定程度上提示了該抗瘤組分對腫瘤細胞生物學(xué)特性具有一定的影響。

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Effect of AAVC-I on the migration of human umbilical vein endothelial cells

LI Shu1, JIN Xin2, LONG Xue-feng3, JIA Jin-li1, ZHANG Gen-bao1, HONG Yun4△

(1. Department of Pathophysiology, 2. Department of Pharmacology, 3. Department of Clinical Medicine, 4. Department of Ultrasonography, Yijishan Hospital, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China)

Objective: To investigate the effect of component I from agkistrodon acutus venomon (AAVC-I) the migration of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), and to elucidate the possible anti-angiogenic mechanism of AAVC-I . Methods: The effect of AAVC-I on the migration of HUVECs which was cultivated in vitro and treated with AAVC-1 at four concentrations: 0、20、40、80 μg/ml, was observed by methods of scratch wound-healing and Transwell assay. The expression level of mRNA and protein of P-selectin and intercellular cell adhension molecule-Ⅰ(ICAM-1) were examined by RT-PCR and Western blot assay. Results: Compared with the blank group, the migration ability of HUVECs in each AAVE-I treated group was reduced in a dose-dependent manner, and the expression level of the mRNA and protein of P-selectin and ICAM-1 were decreased. Conclusion: AAVC-I inhibits the migration of endothelial cell, which is acted by down-regulation of the expression content of mRNA and protein of P-selectin and ICAM-1.

component I from agkistrodon acutus venomon; human umbilical vein endothelial; migration

校重點科研基金項目(wk2014ZF06)；安徽省自然科學(xué)基金項目(1408085QH169);省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃(AH20 1410368138)

2014-01-05 【修回日期】2015-02-25

R73-3

A

1000-6834(2015)05-407-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.007

△【通訊作者】Tel： 0553-3932476； E-mail： yxx2003@126.com