王芳芳， 方以群， 攸 璞， 包曉辰， 馬 駿， 張 師

(海軍醫(yī)學(xué)研究所， 上海 200433)

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不同壓力氧氣對大鼠潛水減壓病的預(yù)防作用*

王芳芳， 方以群△， 攸 璞， 包曉辰， 馬 駿， 張 師

(海軍醫(yī)學(xué)研究所， 上海 200433)

目的：研究不同壓力氧氣對大鼠減壓病的預(yù)防作用。方法：40只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為減壓病組、1 ATA預(yù)吸氧組、2 ATA預(yù)吸氧組、3 ATA預(yù)吸氧組。減壓病組置于脫險(xiǎn)艙內(nèi)，以“壓縮空氣3 min內(nèi)勻速加壓至0.7 MPa，停留60 min后，3 min內(nèi)勻速減壓”方案處理后出艙。預(yù)吸氧組分別于進(jìn)艙前吸不同壓力的氧20 min后再按上述方案加減壓出艙。出艙后30 min內(nèi)觀測大鼠死亡率、行為學(xué)改變；取大鼠肺組織，測其干濕重比、支氣管肺泡灌洗液蛋白量以及腫瘤壞死因子(TNF-α)表達(dá)含量變化。結(jié)果：和減壓病組比較，預(yù)吸氧對減壓病的死亡率及發(fā)病率無明顯影響。但1 ATA預(yù)吸氧組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白量和炎癥因子TNF-α值下降明顯，肺干濕重比升高明顯(P<0.05)。結(jié)論：預(yù)吸氧對減壓病的死亡率及發(fā)病率無明顯改善,但是常壓吸氧可減輕存活大鼠肺泡灌洗液中蛋白滲透、降低肺組織中炎癥因子的表達(dá)。

預(yù)吸氧；減壓?。谎装Y因子；大鼠

當(dāng)機(jī)體所處的環(huán)境壓力發(fā)生突然的、急劇的變化時(shí)(例如潛艇脫險(xiǎn)、水下或航空作業(yè))容易引起減壓病。減壓病嚴(yán)重威脅潛水員的健康，主要表現(xiàn)的癥狀有皮疹、關(guān)節(jié)及四肢的疼痛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、呼吸困難、偏癱等。目前常規(guī)的減壓程序無法完全避免減壓病的發(fā)生，如何采取有效措施預(yù)防減壓病的發(fā)生成為援潛救生研究的重點(diǎn)。

有研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下體內(nèi)組織中存在著氣核，在減壓過程中，這些氣核可逐漸增大并形成氣泡，導(dǎo)致減壓病的發(fā)生[1]。理論上認(rèn)為，在高壓或者常壓下呼吸純氧，增加體內(nèi)的氧含量，可減少氣核的產(chǎn)生。增加的氧氣可以快速擴(kuò)散到氣核中，置換其中的氮?dú)猓獨(dú)饪焖購浬⒊鰵夂?，被集體排出體外。同時(shí)氣核中的氧氣可以被線粒體代謝，導(dǎo)致氣核的快速降解[2,3]。以往國外文獻(xiàn)中有采用預(yù)吸氧預(yù)防減壓病發(fā)生的相關(guān)研究，因此我們采用不同壓力下預(yù)吸純氧干預(yù)減壓病大鼠模型的方法，研究其對潛水減壓病的影響，為進(jìn)一步尋找預(yù)防減壓病發(fā)生的有效措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

40只健康雄性SD大鼠，體重280～320 g，海軍醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心飼養(yǎng)。觀察和檢疫一周正常后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物隨機(jī)分為4組(n=10)：分別是減壓病(DCS)組、1 ATA預(yù)吸氧組、2 ATA預(yù)吸氧組、3 ATA預(yù)吸氧組。

1.2 主要儀器及試劑

動(dòng)物高壓氧艙(定制，上海701研究所楊園醫(yī)用氧艙廠)，動(dòng)物脫險(xiǎn)艙(定制，煙臺宏遠(yuǎn)氧業(yè)有限公司)，醫(yī)用氧氣(上海市江南氣體公司)，鈉石灰(上海五四化工廠)，BCA蛋白試劑盒(購自pierce公司)，檢測腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)的ELISA試劑盒(eBioscience，美國)，自制11通道轉(zhuǎn)籠。

1.3 減壓病動(dòng)物模型的建立及處理

采用前期實(shí)驗(yàn)確定的減壓病動(dòng)物模型，采用“壓縮空氣3 min內(nèi)勻速加壓至0.7 MPa，停留60 min后，3 min內(nèi)勻速減壓”后出艙方案。減壓病組大鼠直接置于動(dòng)物脫險(xiǎn)艙內(nèi)加減壓出艙；預(yù)吸氧組分別于進(jìn)艙前吸不同壓力的氧20 min后再按上述方案加減壓出艙。四組大鼠減壓出艙后均放入轉(zhuǎn)籠中觀察其發(fā)生減壓病的癥狀，評價(jià)指標(biāo)包括：行走困難、不正常的呼吸、前/后肢癱瘓及死亡，統(tǒng)計(jì)死亡率。觀察30 min后取各組大鼠的肺組織，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.4 肺組織干濕重比

每組取5只大鼠,分別取右下肺組織，先稱取各個(gè)肺組織的濕重。然后置于80℃烤箱中烘烤48 h后稱取干重，計(jì)算干/濕重的比例。

1.5 支氣管肺泡灌洗液蛋白含量測定

每組取5只大鼠，采用戊巴比妥鈉麻醉后(100 mg/kg，腹腔注射)，逐層剪開皮膚，分離主支氣管，剪T型切口。5 ml注射器抽取5 ml預(yù)冷的PBS，插入主支氣管，結(jié)扎固定后，反復(fù)抽吸五次，回收率達(dá)到60%以上。收獲的支氣管肺泡灌洗液 1 000 g。4℃離心10 min后，收集上清儲(chǔ)存在-70℃冰箱。灌洗液蛋白測定按照Pierce BCA蛋白試劑盒說明書操作。

1.6 肺組織TNF-α的含量測定

每組取5只大鼠，采用戊巴比妥鈉麻醉后(100 mg/kg,腹腔注射)，迅速取出左側(cè)肺組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，按比例(1 ml/100 mg肺組織)加入預(yù)冷的勻漿液，冰浴中勻漿3 min，4℃下15 000 r/min離心10 min，取上清液置于-70℃冰箱中保存待測。采用ELISA雙抗夾心法嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，檢測上清液中TNF-α的含量；并采用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定法嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，檢測上清液中蛋白含量；最后換算出每毫克蛋白中細(xì)胞因子TNF-α含量(pg/mg)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同壓力氧氣預(yù)吸對減壓病大鼠模型的影響

通過不同壓力預(yù)吸氧組與減壓病組的死亡率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然死亡率有所下降，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明1 ATA、2 ATA、3 ATA氧氣預(yù)吸對常規(guī)潛水減壓病的死亡率無明顯影響(表1)。

Tab. 1 Effect of different pressure oxygen pre-breathe on mortality rate of diving decompression sickness rats

GroupAmountofratsAmountofdeathMortalityrateDCS10770%1ATA10770%2ATA10660%3ATA10660%

DCS： Decompression sickness group; ATA: Absolute atmosphere

2.2 肺組織干濕重比

減壓病(decompression sickness, DCS)組干濕重比0.194±0.023,1 ATA組為0.215±0.014,2 ATA組為0.188±0.025,3 ATA組為0.199±0.024，與減壓病組比較，1 ATA組大鼠肺干濕重比明顯升高(P<0.05),而2 ATA組和3 ATA組差異不明顯(圖2)。

Fig. 2 Dry/wet ratio of lung DCS： Decompression sickness group; ATA: Absolute atmosphere*P<0.05vsDCS group

2.3 支氣管肺泡灌洗液蛋白量

減壓病組肺泡灌洗液蛋白量(671.33±73.36)pg/ml，1 ATA組為(262.33±59.86) pg/ml,2 ATA組(728.88±34.76) pg/ml,3 ATA組(654.50±41.25) pg/ml，相對于減壓病組，1 ATA組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白量下降明顯(P<0.05，圖3)。

Fig. 3 Protein levels in the bronchoalveolar lavage fluid of lung DCS：Decompression sickness group; ATA: Absolute atmosphere; BALF: Bronchoalveolar lavage fluid*P<0.05vsDCS group

2.4 肺組織TNF-α的含量

減壓病組肺組織TNF-α的含量為(87.99±59.40)pg/mg,1 ATA組為(38.07±6.45)pg/mg,2 ATA組為(78.49±87.27)pg/mg，3 ATA組為(65.49±43.27)pg/mg。相對于減壓病組，1 ATA組TNF-α值下降明顯(P<0.05，圖4)。

Fig. 4 Content of tumor necrosis factor TNF-α in the lung tissue DCS：Decompression sickness group; ATA: Absolute atmosphere; TNF-α: Tumor necrosis factor-α*P<0.05vsDCS group

3 討 論

高壓氧是治療減壓病的重要手段，也是預(yù)防高原和航空減壓病的主要措施。在高氣壓暴露前吸氧，可以通過排氮效應(yīng)降低暴露后發(fā)生氮?dú)膺^飽和的可能。在快速減壓前吸氧，可以降低發(fā)生減壓病的可能性和嚴(yán)重性。但是這種吸氧預(yù)防減壓病的方法需要在吸氧后即刻進(jìn)行，否則隨著間隔時(shí)間的延長，體內(nèi)含氮量又會(huì)逐漸恢復(fù)至吸氧前水平，從而達(dá)不到排氮目的[4]。目前有多篇文獻(xiàn)證實(shí)吸氧壓力、吸氧時(shí)間和再加壓的間隔時(shí)間都是影響減壓病發(fā)生率的重要因素。如Arieli等[5]發(fā)現(xiàn)吸入0.30 MPa的純氧20 min后，在常壓下間隔2 h后再加壓，發(fā)生減壓病的比例進(jìn)一步升高，為70%～90%，這可能和體內(nèi)潛在的氣核激活有關(guān)。而常壓下呼吸純氧20 min后再間隔2 h暴露于加壓環(huán)境下，減壓病的發(fā)生率是下降的，為43%，但間隔6、24 h后預(yù)吸氧的保護(hù)作用不明顯，可能的機(jī)制是體內(nèi)的氣核恢復(fù)。Bosco等[6]發(fā)現(xiàn)，在潛水前常壓下吸氧20 min可顯著降低潛水員體內(nèi)氣泡數(shù)量的產(chǎn)生，同時(shí)減輕血小板活化。

近年發(fā)現(xiàn)，數(shù)小時(shí)前的高壓氧暴露可對抗很多器官的缺血再灌注損傷，而此時(shí)高壓氧的直接理化作用(如氧容量的增加)已不存在[7]。目前認(rèn)為不安全減壓產(chǎn)生的氣泡是導(dǎo)致減壓病發(fā)生的主要原因[8]。在氣泡的致病過程中，血小板、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞之間在炎性因子等的介導(dǎo)下發(fā)生了一系列的交互作用，使得減壓病發(fā)生的嚴(yán)重程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于氣泡的機(jī)械致病作用[9]。

氣泡造成的血管內(nèi)皮組織缺血缺氧及隨后的再灌注損傷，可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，上調(diào)粘附分子表達(dá)[10]，促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放。TNF-α主要是由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)，在各種炎性病理變化中起重要作用。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，因而使單核巨噬細(xì)胞分泌TNF-α增多，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，血?dú)馄琳掀茐?，血管?nèi)皮細(xì)胞通透性增加，造成組織充血水腫、滲出增加。而肺組織是減壓病的靶器官，是靜脈氣泡的早期過濾器，因?yàn)閴毫Ρ润w循環(huán)中低，因此更容易在減壓過程中形成氣泡。所以在本實(shí)驗(yàn)中通過測定大鼠肺組織中TNF-α含量和肺泡灌洗液蛋白量發(fā)現(xiàn)，相對于減壓病組，預(yù)吸氧1 ATA組TNF-α值和肺泡灌洗液蛋白量下降明顯，提示我們常壓吸氧可以通過降低存活大鼠肺泡灌洗液的蛋白滲透性及降低肺組織炎性表達(dá)，從而減輕肺組織損傷，減緩存活大鼠發(fā)病癥狀，促進(jìn)其恢復(fù)。而高壓下預(yù)吸純氧容易并發(fā)肺型氧中毒的發(fā)生，可能對肺組織產(chǎn)生影響。

綜上所述，盡管目前仍受到吸氧設(shè)備的限制，不能實(shí)現(xiàn)吸氧和加壓間即刻轉(zhuǎn)換，可能會(huì)對大鼠減壓病的發(fā)生產(chǎn)生影響，或?qū)е挛鯚o效。但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明常壓吸氧比高壓吸氧更能夠降低存活大鼠肺泡灌洗液的蛋白滲透性及肺組織炎性表達(dá)，從而減輕肺組織損傷。對于存活大鼠的減壓病癥狀恢復(fù)是非常有益的，在緊急情況下可以作為一種輔助手段用于減壓病的預(yù)防。

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Effect of different pressure oxygen pre-breathe in diving decompression sickness of rats

WANG Fang-fang, FANG Yi-qun△, YOU Pu, BAO Xiao-chen, MA Jun, ZHANG Shi

(Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433, China)

Objective: To investigate the effect of different pressure oxygen pre-breathing in preventing decompression sickness of rats. Methods: Forty male SD rats were randomly divided into 4 groups: decompression sickness (DCS) group and three oxygen pre-breathing groups with 1 ATA, 2 ATA and 3 ATA pressure respectively. The rats of DCS group were placed in the hyperbaric chamber and the chamber was compressed evenly within 3 minutes to depths of 7 absolute atmosphere(ATA) and held at the designated depth for 60 min, then decompressed (3 min) at constant speed to the surface pressure. After that, the rats were taken out for further detection. While the rats of oxygen pretreatment groups pre-breathed different pressure oxygen for 20 min before entering into chamber. The mortality and behavioral of rats were observed with 30 min post decompression. The dry/wet ratio of the lung, protein levels in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and the inflammatory cytokine tumor necrosis factor (TNF-α) expression were also tested. Results: Compared with that of the DCS group, the mortality and morbidity of oxygen pre-breathe groups didn’t change obviously. But the total BALF protein level and the inflammatory cytokine TNF-α expression of 1 ATA oxygen pre-breathe group were obviously decreased, while the dry/wet ratio of lung as obviously increased instead(P<0.05). Conclusion: Although preoxygenation can’t obviously change the mortality and mobidity of rats, normal pressure oxygen pre-breathing can mitigate the protein infiltration in BALF and the expression of inflammatory cytokine in lung tissue.

oxygen pre-breathe; decompression sickness; inflammatory cytokine; rat

海軍后勤部科研基金項(xiàng)目(12A106)；總后十二五重點(diǎn)科研課題(BWS11J053,BHJ12J003)

2014-12-09 【修回日期】2015-02-10

R73-3

A

1000-6834(2015)05-401-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.005

△【通訊作者】Tel: 021-81883141； E-mail： yqfang126@gmail.com