韓圣娜， 王 沛， 張 衛(wèi)， 張莉蓉△

(1. 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 2. 鄭州大學(xué)藥學(xué)院， 河南 鄭州 450001； 3. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科， 河南 鄭州 450052)

?

咪達(dá)唑侖對(duì)hERG鉀通道的作用*

韓圣娜1， 王 沛2， 張 衛(wèi)3， 張莉蓉1△

(1. 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 2. 鄭州大學(xué)藥學(xué)院， 河南 鄭州 450001； 3. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科， 河南 鄭州 450052)

目的：觀察咪達(dá)唑侖對(duì)人胚腎上皮細(xì)胞(HEK-293)中異源表達(dá)的人類相關(guān)基因(hERG)鉀電流作用及其機(jī)制。方法：利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察咪達(dá)唑侖對(duì)hERG鉀通道的抑制作用，分析其對(duì)通道激活、失活動(dòng)力學(xué)過(guò)程的影響以及咪達(dá)唑侖對(duì)Y652A和F656C突變型hERG鉀通道的作用。結(jié)果：咪達(dá)唑侖濃度依賴性地抑制hERG鉀電流，其IC50值為(1.31±0.32)μmol/L。1.0 μmol/L的咪達(dá)唑侖加藥前后半數(shù)激活電壓V1/2由(2.32±0.38)mV變?yōu)?-1.96±0.83)mV；加藥前后半數(shù)失活電壓V1/2由(-49.25±0.69)mV變?yōu)?-57.53±0.53)mV(P<0.05)，失活曲線左移；與野生型(WT)比較，Y652A和F656C突變型可顯著減弱咪達(dá)唑侖對(duì)hERG通道的阻斷作用。結(jié)論：咪達(dá)唑侖能阻斷hERG鉀通道，失活速度加快，Y652和F656可能是咪達(dá)唑侖與hERG鉀通道結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。

咪達(dá)唑侖； hERG鉀通道；全細(xì)胞膜片鉗；HEK-293細(xì)胞

心律失常是圍手術(shù)期常見(jiàn)的一種心血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致患者死亡的重要因素之一。其中圍手術(shù)期出現(xiàn)QT間期延長(zhǎng)，誘發(fā)藥源性長(zhǎng)QT綜合征(long QT syndrome，LQTS)，尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速(torsade de pointes，TdP)，甚至猝死等，均增加麻醉和手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)，引起臨床麻醉醫(yī)生的高度重視[1,2]。臨床上多種藥物通過(guò)抑制由人類相關(guān)基因(human ether-a-go-go,hERG)編碼的快速激活延遲整流鉀通道(rapid activating delayed rectifier K+channel，IKr)，引起心肌動(dòng)作電位復(fù)極3期K+外流減少，造成QT間期延長(zhǎng)[3-5]。

咪達(dá)唑侖是一種快速和相對(duì)短效的苯二氮卓類藥物，具有良好的鎮(zhèn)靜、催眠、順行性遺忘、抗焦慮、抗驚厥的作用，常作為全麻術(shù)前和誘導(dǎo)用藥。在臨床工作中發(fā)現(xiàn)少數(shù)病例使用咪達(dá)唑侖后出現(xiàn)心率輕度增快，血壓輕度下降，說(shuō)明其對(duì)心血管系統(tǒng)有輕微抑制作用[6,7]。

本課題采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察咪達(dá)唑侖對(duì)人胚腎上皮細(xì)胞(human embryonic kidney cells，HEK-293)上異源表達(dá)的hERG鉀電流的影響及其機(jī)制，初步探討咪達(dá)唑侖的心血管不良反應(yīng)，從而為圍術(shù)期合理用藥提供理論依據(jù)，減少圍術(shù)期心臟不良反應(yīng)的發(fā)生率。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒

編碼IKr的hERG基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體pcgi-EGFP-hERG由張朝教授饋贈(zèng)(南京師范大學(xué)生命科學(xué)院)。pcgi-Y652A-hERG(酪氨酸突變?yōu)楸彼?和pcgi-F656C-hERG突變體(苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼?由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)PCR定點(diǎn)突變技術(shù)而得并保存。

1.2 藥品和試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自Gibico公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogene公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。咪達(dá)唑侖購(gòu)自北京匯智泰康生物技術(shù)有限公司(純度99.8%)，溶于DMSO，配成10 mmol/L母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用正常臺(tái)式液稀釋，配成所需終濃度(DMSO在體系中的最大濃度<0.1%，不影響hERG電流的記錄)[8]。

1.3 HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HEK-293細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，放置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將hERG基因表達(dá)在HEK-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36～48 h后取出細(xì)胞準(zhǔn)備做全細(xì)胞膜片鉗記錄[9,10]。

1.4 hERG鉀電流的記錄

將表達(dá)有綠色熒光蛋白(EGFP)的HEK-293細(xì)胞的35 mm培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡的操作臺(tái)上，更換為細(xì)胞外液(mmol/L)：NaCl 140，KCl 5.4，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 10，Glucose 10，用1.0 mol/L的NaOH滴定pH至7.4。使用的微電極尖端約0.5～1 μm，充以電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl 140，MgCl21，EGTA 5，Na2ATP 5，HEPES 10，1 mol/L KOH滴定pH值至7.2，阻抗為2～5 MΩ。高阻封接形成后行串連電阻和電容電流補(bǔ)償，形成全細(xì)胞記錄模型。實(shí)驗(yàn)過(guò)程由計(jì)算機(jī)軟件pulse 8.67(HEKA Elektronik，Germany)完成刺激信號(hào)的產(chǎn)生、反饋信號(hào)的采集以及數(shù)據(jù)分析。用電壓鉗模式進(jìn)行刺激和記錄hERG鉀電流。采用累積加藥的方法記錄不同濃度的咪達(dá)唑侖作用5 min后對(duì)hERG鉀電流的作用[9,10]。

在形成全細(xì)胞模式后，采用維持電位-80 mV，以10 mV為階躍，施以-40 mV至+70 mV持續(xù)3 s的一系列去極化刺激，最后復(fù)極電位至-40 mV，持續(xù)2 s，采樣頻率0.25 kHz，刺激間隔15 s，記錄hERG鉀電流。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 咪達(dá)唑侖對(duì)WT-hERG鉀通道的濃度依賴性抑制作用

在大部分指令電壓下咪達(dá)唑侖均可抑制hERG時(shí)間依賴性電流和尾電流(圖1A)。以電壓為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的電流值為縱坐標(biāo)，得出1 μmol/L的咪達(dá)唑侖灌流前后電壓-電流曲線(I-V)的變化(圖1B、圖1C)。

以咪達(dá)唑侖的濃度(0.001，0.01，0.1，1.0，10，30和100 μmo/L)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，給藥前后的電流比值為縱坐標(biāo)，得量-效關(guān)系曲線(圖1D)。結(jié)果顯示，咪達(dá)唑侖抑制WT-hERG鉀通道電流的半數(shù)最大抑制濃度(half-maximum block concentrations，IC50)值為(1.31±0.32) μmol/L，Hill系數(shù)為0.24±0.02。

Fig. 1 Effects of midazolam on human ether-a-go-go-related gene (hERG) currents elicited by depolarizing voltage pulses A: Superimposed current traces elicited by 3 s depolarizing voltage pulses in 10 mV increments (upper panel) from a holding potential of -80 mV in the absence of midazolam (control, left panel) and in the presence of 1 μmol/L midazolam (right panel)；B and C: I-V relationships for (B) current measured at the end of depolarizing steps and (C) tail currents in control cells and in cells exposed to 1 μmol/L midazolam； D: Concentration-effect relationship for current inhibition by midazolam

2.2 咪達(dá)唑侖對(duì)WT-hERG鉀通道激活曲線和失活曲線的影響

標(biāo)準(zhǔn)化hERG尾電流后，數(shù)據(jù)經(jīng)Boltzmann sigmnidal方程擬合，可得WT-hERG的穩(wěn)態(tài)激活曲線(圖2A)。1 μmol/L的咪達(dá)唑侖加藥前后半數(shù)激活電壓V1/2由(2.32±0.38) mV變?yōu)?-1.96±0.83) mV，激活斜率k由(11.87±0.33) mV變?yōu)?14.68±0.76) mV，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無(wú)顯著性差異。

穩(wěn)態(tài)失活曲線的引出采用三脈沖程序的方法[10]，首先從維持電位-80 mV去極化至+20 mV，持續(xù)時(shí)間4 s，其次復(fù)極化至不同測(cè)試電壓(-130～+20)mV，持續(xù)時(shí)間 20 ms，最后再去極化至+20 mV，即可引出在各個(gè)測(cè)試電壓下從前一失活中恢復(fù)的通道產(chǎn)生的電流。

以測(cè)試電壓為橫坐標(biāo)，相應(yīng)電壓下hERG鉀電流與最大電流的比值為縱坐標(biāo)，經(jīng)Boltzmann方程擬合得穩(wěn)態(tài)失活曲線(圖2B)。結(jié)果顯示1.0 μmol/L的咪達(dá)唑侖加藥前后半數(shù)失活電壓V1/2由(-49.25±0.69)mV變?yōu)?-57.53±0.53)mV，失活斜率k由(19.66±0.61)mV變?yōu)?21.45±0.46)mV(P<0.05)。

2.3 咪達(dá)唑侖對(duì)Y652A-hERG和F656C-hERG鉀電流的作用

hERG鉀通道在S6羧基端652、656位置上分別是芳香族氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸，Y652和F656是許多藥物與hERG鉀通道相互作用的重要結(jié)合位點(diǎn)，為了判定咪達(dá)唑侖與這兩個(gè)位點(diǎn)是否也有親和力，該課題組探討了咪達(dá)唑侖對(duì)Y652A和F656C突變體的阻滯作用。選用的咪達(dá)唑侖的濃度為10、30、100 μmol/L(超過(guò)咪達(dá)唑侖抑制WT-hERG鉀通道的IC50值的7～70倍)。

圖3A比較了10 μmol/L的咪達(dá)唑侖用于WT-hERG和Y652A-hERG鉀電流的變化。圖3B具體比較了三個(gè)不同濃度下咪達(dá)唑侖對(duì)WT-hERG和Y652A-hERG鉀通道電流的變化。當(dāng)咪達(dá)唑侖濃度分別為10、30和100 μmol/L時(shí)，其對(duì)WT-hERG鉀通道分別抑制了(60.3±6.4)%、(64.0±1.3)%和(77.6±2.1)%；對(duì)Y652A-hERG鉀電流分別抑制了(27.2±3.8)%、(61.9±3.3)%和(82.1±1.5)%。

由于F656C-hERG鉀通道具有低細(xì)胞膜表達(dá)的特點(diǎn)，在正常細(xì)胞外液時(shí)不易引出外向尾電流，故實(shí)驗(yàn)中采用含高鉀的細(xì)胞外液(95 mmol/L K+)。先給與細(xì)胞一個(gè)+20 mV的去極化脈沖，隨后將細(xì)胞復(fù)極至-120 mV，引出其內(nèi)向尾電流(圖4A)。當(dāng)咪達(dá)唑侖的濃度分別為10、30和100 μmol/L時(shí)，其對(duì)WT-hERG鉀通道分別抑制了(67.1±6.9)%、(75.6±3.6)%和(81.2±4.1)%；對(duì)F656C-hERG鉀通道分別抑制了(22.5±7.4)%、(31.2±5.8%)和(56.5±8.5%，圖4B)。

3 討論

各種麻醉藥引起心電圖QT間期異常，導(dǎo)致發(fā)作性暈厥、心臟猝死的心律失常時(shí)有發(fā)生。由于臨床上麻醉藥物多和其它藥物同時(shí)使用，很難判定是麻醉藥物對(duì)QT間期的單一作用[11,12]。關(guān)于咪達(dá)唑侖對(duì)QT間期影響的臨床報(bào)道不多，有資料顯示其對(duì)QT間期無(wú)明顯影響或略有延長(zhǎng)[13]。此外，鑒于麻醉藥物對(duì)離子通道影響的復(fù)雜性，增加了在體動(dòng)物研究的難度，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)又有其局限性，因此本實(shí)驗(yàn)為了解咪達(dá)唑侖對(duì)QT間期的影響及其機(jī)制，應(yīng)用異源表達(dá)系統(tǒng)HEK-293細(xì)胞，觀察其對(duì)QT間期影響的分子機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)[14]，咪達(dá)唑侖的臨床效應(yīng)與血藥濃度相關(guān)，40 ng/ml(約0.12 μmol/L)時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)效應(yīng)，80 ng/ml(約0.24 μmol/L)時(shí)出現(xiàn)催眠作用，而該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示咪達(dá)唑侖濃度依賴性地抑制hERG鉀通道，其IC50值為(1.31±0.32)μmol/L。這說(shuō)明咪達(dá)唑侖在正常劑量適用范圍內(nèi)通常是安全的，但若超過(guò)血藥濃度的5～10倍時(shí)有發(fā)生QT間期延長(zhǎng)的潛在危險(xiǎn)。

咪達(dá)唑侖不影響hERG鉀通道激活動(dòng)力學(xué)，但使穩(wěn)態(tài)失活動(dòng)力學(xué)曲線左移，加快了失活速度，這說(shuō)明咪達(dá)唑侖可使動(dòng)作電位時(shí)程的復(fù)極時(shí)間延長(zhǎng)，可能會(huì)引起QT間期延長(zhǎng)，是其致心律失常的主要原因。hERG鉀通道在其跨膜片段S6的羧基端656、652位置上對(duì)應(yīng)的是苯丙氨酸和酪氨酸，而這兩個(gè)芳香族氨基酸殘基(F656和Y652)已被證實(shí)與許多藥物有高度的親和力，是藥物與hERG鉀通道相互作用的重要結(jié)合位點(diǎn)[15]。如果這些位點(diǎn)發(fā)生突變，將會(huì)削弱藥物抑制hERG鉀通道的作用能力。本課題研究發(fā)現(xiàn)Y652和F656位點(diǎn)的突變削弱了咪達(dá)唑侖對(duì)hERG鉀通道的阻斷能力，說(shuō)明Y652和F656可能是咪達(dá)唑侖阻斷hERG通道的重要結(jié)合位點(diǎn)。

咪達(dá)唑侖是圍手術(shù)期常用的較安全藥物，但是根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果其仍有致QT間期延長(zhǎng)的潛在危險(xiǎn)，尤其是當(dāng)患者圍術(shù)期存在電解質(zhì)紊亂(如低鎂血癥、低鉀血癥等)，心臟疾病(如心肌梗塞、嚴(yán)重的心力衰竭、肥厚型心肌病、嚴(yán)重的心動(dòng)過(guò)緩、心臟瓣膜異常等)，同時(shí)使用其它易引起QT間期延長(zhǎng)的藥物，這些因素會(huì)增加咪達(dá)唑侖對(duì)hERG鉀通道作用易感性。因此患者圍術(shù)期出現(xiàn)QT間期延長(zhǎng)，往往是多種因素相互作用的結(jié)果，作為麻醉醫(yī)生我們應(yīng)高度警惕引起QT間期延長(zhǎng)的潛在因素，做全面的圍術(shù)期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，針對(duì)不同的患者的選擇合適的藥物，盡量避免心臟不良反應(yīng)的發(fā)生。

[1] Saussine M, Massad I, Raczka F,etal. Torsades de pointes during sevoflurane anesthesia in a child with congenital long QT syndrome [J].PaediatrAnaesth, 2006, 16(1): 63-65.

[2] Owcauk R, Wujtewicz MA, Sawicka W,etal. Is prolongation of the QTc interval during isoflurane anaesthesia more prominent in women pretreated with anthracyclines for breast cancer [J].BrJAnaesth, 2004, 92(5): 658-661.

[3] Gupta A, Lawrence AT, Krishnan K,etal. Current concepts in the mechanisms and management of drug-induced QT prolongation and torsade de pointes [J].AmHeartJ, 2007, 153(6): 891-899

[4] Ritter JM. Cardiac safety, drug induced QT prolongation and torsade de pointes (TdP) [J].BrJClinPharmacol, 2012, 73(3): 331-334.

[5] Roden DM. Clinical practice. Long-QT syndrome [J].NEnglJMed, 2008, 358(2): 169 -176.

[6] Odening KE, Hyder O, Chaves L,etal. Pharmacogenomics of anesthetic drugs in transgenic LQT1 and LQT2 rabbits reveal genotype-specific differential effects on cardiac repolarization [J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol, 2008, 295(6): H2264-2272.

[7] Michaloudis DG, Kanakoudis FS, Xatzikraniotis A,etal. The effects of midazolam followed by administration of either vecuronium or atracrium on the QT interval in humans [J].EurJAnaesthesiol， 1995, 12(5): 577-583.

[8] Takemasa H, Nagatomo T, Abe H,etal. Coexistence of HERG current block and disruption of protein trafficking in ketoconazole-induced long QT syndrome [J].BrJPharmacol, 2008, 153(3): 439-447.

[9] Han S, Yang SH, Zhang Y,etal. Blockage of hERG current and the disruption of trafficking as induced by roxithromycin [J].CanJPhysiolPharmacol, 2013, 91(12): 1112-1118.

[10]Han SN, Zhang Y, Chen Q,etal. Fluconazole inhibits hERG K+channel by direct block and disruption of protein traf cking [J].EurJPharmacol, 2011, 650(1): 138-144.

[11]楊云春, 周 賢, 伍佳麗, 等. 小劑量芬太尼聯(lián)合咪達(dá)唑侖對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元鈉離子通道電流的影響[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2011, 27(1): 85-87.

[12]Kies SJ, Pabelick CM, Hurley HA,etal. Anesthesia for patients with congenital long QT syndrome [J].Anesthesiol, 2005, 102(1): 204-210.

[13]Saarnivaara L, Klemola UM, Lindgren L,etal. QT interval of the ECG, heart rate and arterial pressure using propofol, methohexital or midazolam for induction of anesthesia [J].ActaAnaesthesiolScand, 1990, 34(4): 276-281.

[14]徐 波, 張興安, 曾 曉, 等. HPLC法測(cè)定人血漿中咪達(dá)唑侖的濃度[J]. 中國(guó)藥房, 2008, 19(20): 1543-1545.[15]Irie T, Kaneko Y, Saito A,etal. QT interval prolongation and Torsade de Pointes induced by propofol and hypoalbuminemia [J].IntHeartJ, 2010, 51(5): 365-366.

Effects of midazolam on hERG K+channel

HAN Sheng-na1, WANG Pei2, ZHANG Wei3, ZHANG Li-rong1△

(1. Department of Pharmacology, School of Medicine, 2. Department of Pharmacy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000;3. The First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China)

Objective: To investigate the effect of midazolam on human ether-a-go-go (hERG) K+channels exogenously expressed in human embryonic kidney cells (HEK-293) and the underlying molecular mechanisms. Methods: Whole-cell patch clamp technique was used to record WT, Y652A and F656C hERG K+current expressed in HEK-293 cells. Results: Midazolam inhibited hERG K+current in a concentration-dependent manner, the half-maximum block concentrations(IC50)values were (1.31±0.32) μmol/L. The half-activation voltage (V1/2) were (2.32±0.38) mV for the control and (-1.96±0.83) mV for 1.0 μmol/L midazolam. The half-inactivation voltage (V1/2) was slightly shifted towards negative voltages from (-49.25±0.69) mV in control to (-57.53±0.53) mV after 1.0 μmol/L midazolam (P<0.05). Mutations in drug-binding sites (Y652A or F656C) of the hERG channel significantly attenuated the hERG current blockade by midazolam. Conclusion: Midazolam can block hERG K+channel and cause the speed of inactivation faster. Mutations in the drug-binding sites (Y652 or F656) of the hERG channel were found to attenuate hERG current blockage by midazolam.

midazolam; hERG K+channel; whole-cell patch clamp; HEK-293 cells

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(81200138)

2014-09-23 【修回日期】2014-10-30△

Tel: 0371-67781855; E-mail: zhanglirongzzu@126.com

R978.1

A

1000-6834(2015)02-143-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.013