周 毅， 牛麗靜， 齊鳳苗， 郭 力△

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 石家莊 050000； 2. 河北省疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)研究所, 石家莊 050021；3. 冀州市醫(yī)院內(nèi)二科, 河北 冀州 053200)

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丁基苯酞預(yù)處理對(duì)大鼠腦組織缺血/再灌注后HSP70表達(dá)的影響*

周 毅1， 牛麗靜2， 齊鳳苗3， 郭 力1△

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 石家莊 050000； 2. 河北省疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)研究所, 石家莊 050021；3. 冀州市醫(yī)院內(nèi)二科, 河北 冀州 053200)

目的：探討丁基苯酞預(yù)處理對(duì)缺血/再灌注大鼠海馬遲發(fā)性神經(jīng)元死亡以及熱休克蛋白70表達(dá)的影響。方法：126只大鼠分為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(36只)、腦缺血組(36只)、丁基苯酞組(6只)、丁基苯酞+腦缺血組(36只)、槲皮素+丁基苯酞+腦缺血組(6只)、DMSO+丁基苯酞+腦缺血組(6只)。建立大鼠全腦缺血/再灌注模型后。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、腦缺血組、丁基苯酞+腦缺血組下另加設(shè)5個(gè)亞組，為手術(shù)后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d組。用硫堇以及免疫組織化學(xué)染色的方法觀察丁基苯酞對(duì)缺血/再灌注大鼠海馬神經(jīng)元遲發(fā)性死亡以及HSP70表達(dá)的影響。結(jié)果：丁基苯酞預(yù)處理可以減輕大鼠全腦缺血/再灌注損傷引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡，明顯增加CA1區(qū)HSP70的陽性表達(dá)，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)(6 h-5 d)；應(yīng)用HSP70抑制劑可以阻斷丁基苯酞預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受。結(jié)論：丁基苯酞可能參與腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)元保護(hù)作用，這一作用可能是通過上調(diào)HSP70的表達(dá)完成的。

丁基苯酞；腦缺血預(yù)處理；HSP70；全腦缺血；大鼠

恩必普(butylphthalide)即消旋-3-正丁基苯酞(DL-3-n-butylphthalide, NBP)軟膠囊是我國(guó)成功研制的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的治療急性缺血腦卒中的一類化學(xué)新藥，是人工合成的消旋體，其左旋體存在于芹菜籽中。目前有關(guān)丁基苯酞腦保護(hù)的資料多集中在對(duì)缺血性腦血管病的治療上，研究表明丁基苯酞可以增加缺血區(qū)腦血流量和改善缺血區(qū)微循環(huán)，保護(hù)線粒體功能，抑制炎癥反應(yīng)，抑制鈣內(nèi)流，縮小局灶性腦缺血后梗死面積，減輕神經(jīng)功能損傷程度，改善全腦缺血后的腦功能代謝等[1-3]，涉及腦缺血病理過程多個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)缺血性腦血管病具有較佳的治療保護(hù)作用。應(yīng)用藥物模擬或誘導(dǎo)一些物質(zhì)如腺苷、熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)等的表達(dá)，也可使神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血性損傷產(chǎn)生對(duì)抗作用，以達(dá)到對(duì)隨后的損傷性腦缺血的保護(hù)[4]。丁基苯酞預(yù)防性用藥即丁基苯酞預(yù)處理能否提高神經(jīng)細(xì)胞對(duì)腦缺血的耐受性尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。研究丁基苯酞預(yù)處理對(duì)于發(fā)生腦缺血神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，將進(jìn)一步完善丁基苯酞在治療缺血腦卒中中的生理機(jī)制研究，對(duì)于丁基苯酞應(yīng)用于更廣闊的缺血神經(jīng)細(xì)胞，缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)、治療，提供更詳盡的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠四血管閉塞全腦缺血(total cerebral ischemia,TCI)模型，觀察丁基苯肽預(yù)處理對(duì)全腦缺血/再灌注引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的影響，運(yùn)用免疫組化技術(shù)觀察腦缺血/再灌注前給與丁基苯肽預(yù)處理對(duì)海馬CA1區(qū)HSP70表達(dá)的影響，并進(jìn)一步用硫堇染色方法觀察HSP70合成抑制劑槲皮素(Quercetin)對(duì)丁基苯肽預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受的影響，探討HSP70在丁基苯肽預(yù)處理抗腦缺血/再灌注損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

健康雄性Wistar大鼠(體重280～300 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)126只，購(gòu)入后在實(shí)驗(yàn)室常溫飼養(yǎng)48 h，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后用于實(shí)驗(yàn)。

兔抗HSP70抗體(Neoumarks), 槲皮素(Johnson Matthey)，Thionin(Sigma)。

丁基苯酞原液(1g/ml，批號(hào)050406，石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司)0.75 ml溶于DMSO 150 ml中，形成5 mg/ml恩必普溶液，使用時(shí)按恩必普30 mg/kg劑量灌胃。

1.2 硫堇染色實(shí)驗(yàn)分組

36只大鼠分為6組(n=6)：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(Sham)、丁基苯酞組、腦缺血組(the total cerebral ischemia,TCI)、丁基苯酞+腦缺血組(NBP+TCI)、槲皮素(Quercetin)+NBP+TCI和DMSO+NBP+TCI。(1)Sham組：行全腦缺血的sham手術(shù)；(2)NBP組：行丁基苯酞預(yù)處理；(3)TCI組：全腦缺血8 min；(4)NBP+TCI組：丁基苯酞預(yù)處理后1 d行全腦缺血8 min；(5)Quercetin +NBP+TCI組：丁基苯酞預(yù)處理前30 min給與Quercetin(50 mg/kg，腹腔注射)，其余同NBP+TCI組。(6)DMSO+NBP+TCI：丁基苯酞預(yù)處理前30 min給與3% DMSO (4 ml/kg體重，腹腔注射)，其余同NBP+TCI組。所有大鼠在sham手術(shù)或末次手術(shù)后7 d斷頭取腦，硫堇染色確定海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(jí)(histological grade，HG)和神經(jīng)元密度(neuronal density，ND)，以反映遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(delayed neuronal death，DND)情況。

1.3 HSP70免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)分組

90只椎動(dòng)脈永久凝閉的大鼠隨機(jī)分為3組。(1)Sham組：行全腦缺血的sham手術(shù)；下設(shè)五個(gè)亞組(n=6)：分別為腦缺血sham手術(shù)后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d組，各組于手術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。(2)TCI組 全腦缺血8 min。下設(shè)五個(gè)亞組(n=6)：分別為腦缺血后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d組，各組于腦缺血后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。(3)NBP+TCI組：丁基苯酞預(yù)處理1 d后行全腦缺血8 min；下設(shè)五個(gè)亞組：分別為腦缺血后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d組，各組于腦缺血后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材(n=6)所有動(dòng)物于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)斷頭取材，石蠟包埋，免疫組織化學(xué)染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)HSP70的表達(dá)。

1.4 模型復(fù)制

采用Pulsinelli四血管閉塞法。首先在10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉下凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈。麻醉后大鼠俯臥位固定，剪毛、縱行切開枕部及后頸部皮膚，切口長(zhǎng)約1.5 cm；鈍性分離脊柱旁肌肉，暴露第一頸椎橫突；在體視顯微鏡下仔細(xì)尋找兩側(cè)的翼狀孔，將預(yù)熱的電灼針插入翼狀孔中，燒灼在翼狀孔中走行的椎動(dòng)脈，使其永久性閉塞；慶大霉素鹽水沖洗、縫合創(chuàng)口。手術(shù)完畢供以水、食，2 d后在乙醚麻醉下將大鼠仰臥位固定于鼠臺(tái)上，切開頸前皮膚，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并穿線備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)用無損傷小動(dòng)脈夾同時(shí)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行全腦缺血8 min，再松開。夾閉頸總動(dòng)脈期間，大鼠瞳孔散大，翻正反射消失，表明大鼠產(chǎn)生了全腦缺血。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組手術(shù)包括以上所有步驟，但不夾閉頸總動(dòng)脈。手術(shù)及全腦缺血過程中，創(chuàng)口局部施與局麻藥(1%普魯卡因)防止疼痛，室溫保持在20℃以上；用白熾燈照射動(dòng)物以維持其肛溫在37℃左右，直到恢復(fù)活動(dòng)。全腦缺血8 min后縫合創(chuàng)口，局部施與慶大霉素預(yù)防感染。

1.5 取材與硫堇染色

所有動(dòng)物于末次手術(shù)后7 d斷頭取材，大鼠斷頭處死，迅速取腦，用生理鹽水清洗表面血液，冠狀切取視交叉后1～4 mm腦組織，10%福爾馬林固定4℃過夜，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，5 μm厚組織切片，硫堇(thionin)染色，梯度酒精脫水，二甲苯固定后中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)椎體DND。參照Kitagawa和Kato分級(jí)方法，根據(jù)DND的程度，對(duì)海馬CA1區(qū)組織學(xué)改變進(jìn)行評(píng)價(jià)。(1)組織學(xué)分級(jí)(histological grade，HG)，標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)，無神經(jīng)元死亡；Ⅰ級(jí)，散在的神經(jīng)元死亡；Ⅱ級(jí)，大片的神經(jīng)元死亡；Ⅲ級(jí)，幾乎全部的神經(jīng)元死亡。(2)神經(jīng)元密度(neuronal density，ND)，計(jì)數(shù)雙側(cè)海馬CA1區(qū)1 mm區(qū)段內(nèi)排列整齊，細(xì)胞膜完整、細(xì)胞核飽滿、核仁清楚的錐體細(xì)胞數(shù)目，每側(cè)海馬CA1區(qū)各計(jì)數(shù)5個(gè)區(qū)段，取平均數(shù)為ND值。

1.6 HSP70免疫組織化學(xué)染色

大鼠斷頭處死，迅速取腦，冠狀切取視交叉后1～4 mm腦組織，用4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋。連續(xù)切片，片厚5 μm，展片，脫蠟，免疫組織化學(xué)染色顯示HSP70在海馬的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 硫堇染色結(jié)果及腦組織病理學(xué)評(píng)價(jià)

硫堇染色結(jié)果顯示，sham組大鼠海馬CA1區(qū)損傷不明顯，椎體細(xì)胞排列整齊致密，層次分明，尼氏小體豐富，胞核大而圓，染色較深，核仁深染，清晰；sham組和NBP預(yù)處理組大鼠海馬CA1區(qū)無明顯的DND(圖1A、C，圖1見彩圖頁Ⅲ)，HG為0～Ⅰ級(jí)，ND分別為(200.2±5.1)n/mm2、(201.3±5.4)n/mm2(表 1)。TCI組大鼠海馬CA1區(qū)組織損傷明顯(圖 1 B)，大部分椎體細(xì)胞缺失，多數(shù)細(xì)胞胞核固縮，核仁不清晰，尼氏小體減少或消失，椎體細(xì)胞周圍出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片；與sham組和NBP預(yù)處理組比較，HG明顯升高，ND顯著降低(表 1)。這些變化提示，8 min TCI損傷引起海馬CA1區(qū)出現(xiàn)了嚴(yán)重的DND。NBP預(yù)處理+TCI組中，海馬CA1區(qū)未見明顯細(xì)胞損傷(圖1 D)，椎體細(xì)胞排列整齊致密，胞核飽滿，核仁較清晰，只有個(gè)別椎體細(xì)胞胞核固縮，沒有明顯的細(xì)胞缺失，其HG和ND值與sham組相近；而與TCI組相比，其HG明顯降低，ND值明顯升高(表 1)，表明NBP預(yù)處理可誘導(dǎo)產(chǎn)生腦缺血耐受，減輕腦缺血/再灌注引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND。給予3% DMSO對(duì)丁基苯酞誘導(dǎo)的腦缺血耐受無明顯影響(圖1 E)，其HG和ND與NBP預(yù)處理+TCI組相近(表1)。然而，給予Quercetin則明顯阻斷了丁基苯酞的腦保護(hù)作用，在海馬CA1區(qū)出現(xiàn)了明顯的DND(圖 1 F)，與NBP預(yù)處理+TCI組相比，其HG明顯升高，ND值明顯降低(圖1)。

2.2 HSP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

HSP70陽性表達(dá)產(chǎn)物為棕黃色顆粒，多見于神經(jīng)元胞質(zhì)和突起，有時(shí)可見于胞核。sham組海馬神經(jīng)元中少見明顯的HSP70蛋白表達(dá)(圖2見彩圖頁Ⅲ)。8 min的單純TCI組，CA1區(qū)于再灌注各時(shí)間點(diǎn)可見少量HSP70陽性表達(dá)(圖 2)；在CA3、CA4區(qū)及齒狀回區(qū)可見大量HSP70陽性表達(dá)。在NBP+TCI組，再灌注6 h海馬CA1區(qū)可見少量的HSP70弱陽性表達(dá)(圖 2)，陽性細(xì)胞總面積和平均光密度與TCI組比較無顯著差異(圖 3)；再灌注12 h CA1區(qū)出現(xiàn)部分HSP70的陽性表達(dá)，與sham和TCI的12 h組比較，陽性細(xì)胞數(shù)量(圖2)、陽性細(xì)胞總面積和平均光密度已明顯增加(NBP+TCI組平均光密度0.134±0.002；陽性細(xì)胞總面積(165310±256)μm2，P<0.01，圖 3)；再灌注1 d后CA1區(qū)HSP70表達(dá)顯著增強(qiáng)，數(shù)量明顯增加，達(dá)到高峰，可見大量神經(jīng)元的胞質(zhì)及突起呈棕黃色HSP70陽性染色(圖 2)，陽性細(xì)胞總面積和平均光密度較sham和TCI的1 d組顯著升高(NBP+TCI組平均光密度0.217±0.006；陽性細(xì)胞總面積(185270±245)μm2，P<0.01，圖3)；再灌注3 d后海馬CA1區(qū)仍維持較高的HSP70表達(dá)水平(圖 2)，陽性細(xì)胞總面積和平均光密度仍明顯高于sham和TCI的3 d組(NBP+TCI組平均光密度0.117±0.003；陽性細(xì)胞總面積(137560±278)μm2，P<0.01)，但與1 d組相比較已開始回落(圖 3)；再灌注5 d仍可見到CA1區(qū)少量HSP70陽性表達(dá)(圖 2)，陽性細(xì)胞總面積仍明顯高于sham和TCI的5 d組(NBP+TCI組陽性細(xì)胞總面積(100120±285)μm2，P<0.01，圖3)。

Tab. 1 Effect of Quercetin, an inhibitor of HSP70, on histological grade (HG) and pyramidal neuronal density (ND) in the hippocampal CA1 region

GroupHistologicalgrade0～Ⅰ～Ⅱ～Ⅲ ND(n/mm2)Sham5100200.2±5.1NBP6000201.3±5.4TCI0024**44.3±8.3**NBP+TCI0600##157.0±6.9##DMSO+NBP+TCI0420159.5±7.9Quercetin+NBP+TCI0051△△122.8±8.2△△

NBP: Butylphthalide; TCI: Total cerebral ischemia; DMSO: Dimethyl sulfoxide

**P<0.01vssham and NBP groups;##P<0.01vsTCI group;△△P<0.01vsNBP+TCI group and DMSO+NBP+TCI group

3 討論

腦缺血性疾病是危害人類健康的重要疾病，死亡率和致死率都較高。積極疏通血管和恢復(fù)血液供應(yīng)是治療的根本。但是神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血性損傷極為敏感，缺血一定時(shí)間后，神經(jīng)細(xì)胞會(huì)大量死亡，即使恢復(fù)血液供應(yīng)，神經(jīng)細(xì)胞也很難再生，仍然會(huì)給患者留下嚴(yán)重的后遺癥。因此充分調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，提高神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血性損害的耐受對(duì)于預(yù)防腦缺血損傷具有重要意義?；A(chǔ)研究表明，丁基苯酞可以通過多種機(jī)制對(duì)抗缺血對(duì)神經(jīng)元造成的損傷。如增加線粒體的生物合成[5]，抑制細(xì)胞凋亡[6-8]，減少氧化應(yīng)激損傷[9,10]，抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化[11,12]，保護(hù)神經(jīng)元活性[13]，促進(jìn)血管再生，調(diào)節(jié)中樞膽堿能系統(tǒng)等，來預(yù)防神經(jīng)元的病理性改變。

Fig. 3 Quantitative analysis of immunostaining represented with optical density (A) and total area (B) of HSP 70 positive cells in CA1 regions of the hippocampus NBP： Butylphthalide; TCI: Total cerebral ischemia**P<0.01vssham group;##P<0.01vsTCI group

有文獻(xiàn)報(bào)道，在全腦缺血/再灌注模型中海馬CA3區(qū)與齒狀回顆粒細(xì)胞中HSP70合成最多，CA1區(qū)合成HSP70較少，因此CA1區(qū)大部分神經(jīng)元在缺血/再灌注后死亡，而海馬CA3 區(qū)與齒狀回對(duì)缺血的耐受程度較強(qiáng)，神經(jīng)細(xì)胞得以存活，海馬各區(qū)對(duì)腦缺血損傷的選擇性易損程度可能與HSP70的選擇性表達(dá)有關(guān)[14]。許多研究表明HSP70可能參與缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的缺血耐受[15]，腦內(nèi)過度表達(dá)HSP的轉(zhuǎn)基因大鼠對(duì)創(chuàng)傷和缺血的耐受性增強(qiáng)。局灶缺血預(yù)處理可使梗死區(qū)HSP70的合成增加，并誘導(dǎo)腦缺血耐受[16]，HSP70表達(dá)量的增加可能對(duì)缺血耐受的形成是必要的。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丁基苯酞預(yù)處理可以改善全腦缺血8 min引起的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡。NBP預(yù)處理+TCI組，大鼠海馬CA1區(qū)無明顯細(xì)胞缺失，與TCI組比較，組織學(xué)分級(jí)HG明顯降低，神經(jīng)元密度值ND明顯升高。在HSP70組化染色時(shí)發(fā)現(xiàn)，sham組海馬神經(jīng)元中少見明顯的HSP70蛋白表達(dá)，TCI組，CA1區(qū)于再灌注各時(shí)間點(diǎn)可見少量HSP70表達(dá)，NBP預(yù)處理+TCI組，HSP70的表達(dá)隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)存在動(dòng)態(tài)變化，與sham組相比較，大鼠海馬HSP70的表達(dá)于丁基苯酞預(yù)處理后全腦缺血8 min后再灌注6 h開始升高，1 d達(dá)到高峰，3 d維持在較高水平，再灌注5 d仍可見到CA1區(qū)少量HSP70陽性表達(dá)。說明丁基苯酞預(yù)處理能夠使大鼠海馬CA1區(qū)HSP70合成明顯增加。本實(shí)驗(yàn)中sham組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)HSP70無明顯表達(dá)。TCI組HSP70陽性表達(dá)主要位于海馬CA3區(qū)和齒狀回，這里對(duì)缺血損傷有很強(qiáng)的耐受性，單純損傷性腦缺血/再灌注各時(shí)間點(diǎn)在缺血敏感的CA1區(qū)均未見HSP70的明顯表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道HSP70的表達(dá)一致[17]。

我們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用HSP70的特異性抑制劑槲皮素可以阻斷丁基苯酞預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠腦缺血/再灌注耐受。槲皮素處理后，與DMSO組比較海馬CA1區(qū)HG升高，ND值降低。既往Fujiki等[4]在大鼠腦缺血預(yù)處理研究中發(fā)現(xiàn)，口服HSP70誘導(dǎo)劑替普瑞酮能減輕腦缺血后大鼠海馬錐體神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡。HSP70作為分子伴侶促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊、移位、修復(fù)或降解，促進(jìn)細(xì)胞的正常代謝和損傷的修復(fù)，以及抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少金屬蛋白酶基質(zhì)的產(chǎn)生等，提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的耐受性，而具有神經(jīng)保護(hù)作用[18]。HSP70在缺血預(yù)處理中可能還通過促進(jìn)再缺血后c-fos，bcl-2的表達(dá)[19]，抑制caspase-3的表達(dá)[20]，對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而誘導(dǎo)腦缺血的耐受。

HSP70作為一種內(nèi)源性保護(hù)蛋白，丁基苯酞預(yù)處理可能通過誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)HSP70的表達(dá)而發(fā)揮其腦保護(hù)作用。HSP70參與丁基苯酞誘導(dǎo)的腦缺血耐受的產(chǎn)生，其表達(dá)上調(diào)是丁基苯酞誘導(dǎo)缺血耐受的可能分子機(jī)制之一。

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Effect of 3-n-butylphthalide pretreatment on expression of the HSP70 after brain ischemia/reperfusion

ZHOU Yi1， NIU Li-jing2， QI Feng-miao3， GUO Li1△

(1. The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000; 2. Hebei Province Center for Disease Prevention and Control,Shijiazhuang 050021; 3. Jizhou City Hospital, Jizhou 053200, China)

Objective: To explore the effect of 3-n-butylphthalide pretreatment on the delayed neuronal death(DND) and the expreesion of heat shock protein70(HSP70)in rat hippocampus after ischemia/ reperfusion. Methods: All rats were randomly divided into sham group(n=36), total cerebral ischemia(TCI) group(n=36), butylphthalide(NBP) group(n=6), NBP + TCI group(n=36), quercetin + NBP + TCI group(n=6), dimethyl sulfoxide(DMSO)+NBP + TCI group(n=6). The model of total cerebral ischemia/reperfusion was established by blocking vertebral arteries and carotid arteries. In sham group, TCI group and NBP group, the animals were further divided into instantly, 6 h, 12 h, 1 d, 3 d, 5 d groups according to the time interval after sham operation or TCI. Histological changes of the hippocampus were evaluated using thionin staining under light microscope by determining the delayed neuronal death (DND) and the expression of HSP70 was assayed using immunohistochemistry. Results: NBP pretreatment could reduce delayed neuronal death in CA1 of hippocampus induced by TCI-reperfusion injury in rats， and up-regulated the expression of HSP70 in CA1 hippocampus of brain ischemic/reperfusion for 5 days. Quercetin blocked the acquirement of the brain ischemic tolerance induced by NBP preconditioning. Conclusion: 3-n-butylphthalide(NBP) prevents the neurons from ischemia/reperfusion injury through upregulating the expression of HSP70.

butylphthalide; brain ischemic preconditioning; HSP70; total cerebral ischemia; rat

2014-08-21

2014-10-31

R365

A

1000-6834(2015)02-136-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.011

△【通訊作者】Tel: 0311-66003912; E-mail: guoli6@163.com