王冬梅， 趙 丹， 殷盛明△， 安 冬， 陳 薇， 于德欽， 徐 紅， 趙 杰, 張萬琴， 田余祥

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室， 2. 大連醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室， 3. 大連醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室， 遼寧 大連 116044)

?

蝎源活性肽對早期帕金森病大鼠強(qiáng)啡肽改變的保護(hù)作用*

王冬梅1+， 趙 丹2， 殷盛明2△， 安 冬2， 陳 薇2， 于德欽2， 徐 紅1， 趙 杰2, 張萬琴2， 田余祥3+

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室， 2. 大連醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室， 3. 大連醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室， 遼寧 大連 116044)

目的：研究蝎源活性肽對早期帕金森病(PD)大鼠強(qiáng)啡肽(DYN)改變的保護(hù)作用。方法：大鼠腦內(nèi)微量注射6-羥多巴胺(6-OHDA)制備早期PD模型，觀察蝎源活性肽對早期PD大鼠腦內(nèi)DYN的影響。結(jié)果：蝎源活性肽可以逆轉(zhuǎn)早期PD大鼠腦內(nèi)明顯降低的DYN免疫反應(yīng)活性。結(jié)論：DYN參與蝎源活性肽對早期PD大鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用。

帕金森??；多巴胺能神經(jīng)元；強(qiáng)啡肽；蝎源活性肽

Parkinson's disease; dopaminergic neurons; dynorphin; scorpion venome derived activity peptide

帕金森病(Parkinson’s disease, PD) 是一種常見于老年人的基底節(jié)神經(jīng)元進(jìn)行性改變，主要累及黑質(zhì)-紋狀體多巴胺遞質(zhì)系統(tǒng)，以靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、肌肉僵直等運(yùn)動障礙為特征[1]。PD的確切發(fā)病機(jī)制還不是很清楚，大多認(rèn)為與遺傳、衰老、環(huán)境等多種因素有關(guān)。PD的發(fā)病機(jī)制也有大量的研究，包括線粒體損傷、小膠質(zhì)細(xì)胞激活和免疫損傷等。近年研究發(fā)現(xiàn)，PD不僅與多巴胺遞質(zhì)在黑質(zhì)紋狀體通路中的減少有關(guān)，還有與內(nèi)源性阿片肽受體機(jī)制參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝障礙有關(guān)[2]，強(qiáng)啡肽(dynorphin, DYN)是基底節(jié)區(qū)神經(jīng)調(diào)節(jié)功能中具有重要作用的內(nèi)源性阿片肽[3]。蝎毒作為我國傳統(tǒng)中藥的成分之一，已經(jīng)被廣泛研究用于抗腫瘤、消炎、鎮(zhèn)痛、抗癲癇和神經(jīng)保護(hù)作用[4,5]等。由于蝎毒成分復(fù)雜，提取其中的有效成分，用于不同難治性疾病的治療也是研究的難點(diǎn)。有關(guān)蝎源活性肽對早期PD大鼠強(qiáng)啡肽改變的保護(hù)作用，未見報(bào)道。本研究采用特殊工藝，提取具有神經(jīng)保護(hù)作用的蝎源活性肽，采用大鼠腦內(nèi)微量注射6-羥多巴胺(6-OHDA)制備早期PD模型，給予蝎源活性肽處理后，觀察早期PD大鼠腦內(nèi)DYN的改變，探討蝎源活性肽對早期PD大鼠腦內(nèi)DYN的影響，這將為PD早期發(fā)病機(jī)制及早期診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

1.1.1 藥品與試劑 6-OHDA(美國Sigma 公司)、Dyn抗體(Phoenix Pharmaceuticals公司)、生物素化的羊抗兔的IgG(武漢Boster公司)和蝎源活性肽(提取于東亞鉗蝎，本課題組專利，ZL0116116-9)。

1.1.2 儀器 ZPQ-86型振動切片機(jī)(上海海天電子儀器有限公司)、DKI5600型腦立體定位儀(美國)和HPIAS 系列彩色病理圖文分析系統(tǒng)(華海電子有限公司)。

1.2 PD動物模型制備和分組

健康雄性SD大鼠30 只(許可證號為SCXXⅡ2008002)大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重180～220 g，4～5 月齡。實(shí)驗(yàn)動物按照簡單隨機(jī)化原則分為3 組(n=10)：早期PD模型組、假手術(shù)對照組和蝎源活性肽治療組。所有大鼠用4%水合氯醛(400 mg/kg，ip) 麻醉后，在腦立體定位儀上固定，門齒桿長約3.4 mm。依照George Paxinos&Charles Watson大鼠腦圖譜來定位選取靶點(diǎn)，紋狀體為早期 PD組靶點(diǎn)，定位坐標(biāo)是AP= +1.0(前囟前)， R= 3.0 mm(向右旁開)，H= -4.5 mm(硬膜下)。早期PD模型組和蝎源活性肽治療組動物腦內(nèi)注射6-OHDA溶于Vehicle(0.1%抗壞血酸，0.9% NaCl) ，20 μg/3 μl。3 min內(nèi)注射，留針后慢慢退出。假手術(shù)對照組大鼠在一樣條件下，靶點(diǎn)內(nèi)給以對應(yīng)體積的Vehicle。

蝎源活性肽治療組在完成行為學(xué)測試后給予蝎源活性肽(2.20 mg/(kg·day), i.p )一周，早期PD模型組只給予生理鹽水(2 ml/kg)。

1.3 動物行為學(xué)檢測

手術(shù)后兩周，6-OHDA處理大鼠于頸背部皮下注射阿樸嗎啡(apomorphine, Apo 0.5 mg/kg)，誘導(dǎo)其旋轉(zhuǎn)運(yùn)動。記錄30 min內(nèi)大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，左旋鼠小于7 r/min為早期PD大鼠模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)人員切忌隨意走動，注意保持安靜。

邁步試驗(yàn)：選擇木板長約1.1 m，傾斜放置，木板一端與鼠籠相連。前3 天，讓大鼠適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境，并訓(xùn)練大鼠慢慢爬回鼠籠。正式實(shí)驗(yàn)開始后，實(shí)驗(yàn)者用一只手將大鼠雙后肢固定并向上輕提，使后肢離開桌面，另一只手將一側(cè)前肢固定，使未固定一側(cè)前肢能接觸桌面。待該前肢能自動移動時起計(jì)時。記錄從邁步開始到鼠籠所需要時間。同時記錄在整個斜面的邁步數(shù)。檢測左側(cè)和后右側(cè)，重復(fù)2次，測試3天。

1.4 免疫組織化學(xué)反應(yīng)

選取中腦黑質(zhì)腦片，采用ABC法來做免疫組織化學(xué)染色。PBS振蕩漂洗腦片3 次，每次10 min， 含1%過氧化氫的PBS 10 min處理來消除內(nèi)源性過氧化物酶。PBS漂洗振蕩3 次，每次10 min。而后用封閉液(含1%牛血清蛋白的PBS)封閉20 min。加抗DYN抗體，置于4℃低溫濕潤環(huán)境中孵育過夜。PBS漂洗3 次，每次10 min，滴加生物素化的二抗，室溫孵育1.5 h，三次漂洗震蕩后與卵白素-生物素復(fù)合物室溫振蕩1 h孵育，PBS振蕩漂洗3 次，每次10 min。后用新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，適時終止。而后梯度脫水，用二甲苯來透明，用中性樹脂進(jìn)行封片。

1.5 免疫染色陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)

病理圖文分析系統(tǒng)定量計(jì)數(shù)DYN-IR陽性表達(dá)顆粒。每組選取6只大鼠。根據(jù)George Paxinos &Charles Watson大鼠腦圖譜，選取腦片的待觀察部位。首先在10×的物鏡下觀察大鼠腦片，選取黑質(zhì)致密部和紋狀體，在熒光顯示屏上設(shè)置測量框，面積為20 000 μm2(100 μm×200 μm) ,選擇四個不同部位計(jì)數(shù)，取平均值。在測量框內(nèi)計(jì)算DYN-IR陽性細(xì)胞個數(shù)。并隨機(jī)選擇6個DYN-IR陽性表達(dá)顆粒，測量其平均光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

與蝎源活性肽治療組相比，邁步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示早期PD大鼠左前肢從開始至回鼠籠的邁步數(shù)和所需要的總時間無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 DYN免疫組化結(jié)果

大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)和紋狀體的DYN免疫組化結(jié)果顯示與假手術(shù)對照組相比，6-OHDA處理的早期PD動物黑質(zhì)致密部 (substantia nigra pars compacta, SNc)和紋狀體(caudate-putamen,CPu)的DYN表達(dá)減少，(圖1B和圖1E)；而蝎源活性肽逆轉(zhuǎn)了上述腦區(qū)的DYN的異常表達(dá)(圖1C和1F)。大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)和紋狀體的DYN免疫反應(yīng)陽性顆粒數(shù)量和光密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖2)表明與假手術(shù)對照組相比，6-OHDA處理的早期PD動物黑質(zhì)致密部和紋狀體DYN的免疫反應(yīng)活性明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而蝎源活性肽治療組與假手術(shù)組相比，無明顯差異，提示蝎源活性肽逆轉(zhuǎn)了DYN異常的免疫反應(yīng)活性。我們觀察到蝎源活性肽對正常大鼠的強(qiáng)啡肽表達(dá)無明顯影響。

Fig. 1 Immunohistochemistry results of dynorphin (DYN) in the brain of the rats (DAB staining, bar=100 μm) A, B, C: Substantia nigra pars compacta； D,E,F: Caudate-putamen; A,D: Sham operation control group； B,E: Early PD group； C,F: Scorpion venom derived activity peptide therapy group

3 討論

PD是一種常見的中老年基底神經(jīng)元進(jìn)行性退行改變，主要累及黑質(zhì)-紋狀體多巴胺遞質(zhì)系統(tǒng)，是一種以中腦黑質(zhì)紋狀體多巴胺進(jìn)行性丟失為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病[6]。PD患者從發(fā)病到典型的行為障礙出現(xiàn)以明確臨床診斷的時間比較長，難以借助臨床資料研究早期PD。早期PD動物模型，方法制備成熟，重復(fù)性好，能夠很好地模擬人類早期PD的病理改變。其中，應(yīng)用最為廣泛的方法之一是通過向大鼠中腦黑質(zhì)紋狀體注射6-OHDA，導(dǎo)致其中腦黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)緩慢的退行性變，多巴胺能神經(jīng)元受損。根據(jù)6-OHDA的注藥量和不同的注藥部位制備的PD動物模型，可以模擬不同時期PD 患者的病理改變。單側(cè)紋狀體小劑量體注射可建立具有PD早期特征的動物模型[7]。

Fig. 2 Analysis of immunohistochemistry results of dynorphin (DYN) in the substantia nigra and striatum of the rats A: The statistics results of the number of DYN positive immunoreactive granules； B: The statistics results of the optical density of DYN positive immunoreactive granules*P<0.05，**P<0.01vssham operation control group 目前帕金森病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，存在遺傳因素、興奮性毒性、氧化應(yīng)激，環(huán)境毒素等假說[8]。有研究表明，阿片肽類物質(zhì)代謝障礙也參與PD的錐體外系癥狀，其原因可能是由于阿片肽與多巴胺代謝障礙密切相關(guān)。經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阿片肽可使動物出現(xiàn)靜止性震顫、動作遲緩、肌張力增高等現(xiàn)象，而納洛酮阿片肽受體拮抗劑可緩解運(yùn)動障礙，提示阿片肽參與帕金森病的多巴胺代謝障礙。內(nèi)源性阿片肽是哺乳動物內(nèi)天然生成的阿片樣作用的肽類物質(zhì)的總稱，包括內(nèi)啡肽、腦啡肽和DYN[9]。DYN是一種內(nèi)源性阿片肽，通常情況下它在阿片受體內(nèi)發(fā)揮抑制慢性疼痛的作用。DYN表達(dá)減少引起PD發(fā)生的機(jī)制不清，已有文獻(xiàn)報(bào)道，DYN能與kappa受體特異性結(jié)合，且隨著劑量的改變而對PD模型中的多巴胺能神經(jīng)元有損傷和保護(hù)作用，并且改善運(yùn)動功能障礙。黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元通路中釋放的多巴胺可調(diào)節(jié)紋狀體兩類棘狀投射神經(jīng)元的功能，主要表現(xiàn)在其抑制間接通路的和易化直接通路。在PD的典型病理改變是黑質(zhì)紋狀體通路中多巴胺的含量進(jìn)行性減少，易化直接通路的作用減弱，可表達(dá)D1受體的GABA神經(jīng)元的興奮性降低。DYN在黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)合成后，主要隨軸質(zhì)運(yùn)輸分泌至蒼白球的內(nèi)側(cè)，作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)作用于突觸前kappa受體，表達(dá)在來自于底丘腦核的谷氨酸神經(jīng)末梢，降低谷氨酸的釋放[9]。DYN是直接通路的標(biāo)志物，參與了對運(yùn)動功能的調(diào)節(jié)，而且DYN在PD發(fā)病中的作用與Kappa受體的改變有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PD大鼠損毀側(cè)紋狀體DYN的表達(dá)減少也支持上述理論推斷。

有關(guān)PD的神經(jīng)保護(hù)作用研究仍舊是難點(diǎn)，雖然干細(xì)胞的干預(yù)帶來了一線曙光[10]，但是由于干細(xì)胞分化的可控性極其復(fù)雜，離臨床應(yīng)用還是很遠(yuǎn)。相對而言，中藥開發(fā)仍是研究熱點(diǎn)。有關(guān)DYN是否參與早期PD的發(fā)生及蝎源活性多肽對早期PD的神經(jīng)保護(hù)作用，尚未見報(bào)道。我們采用特殊工藝制備無毒高效的蝎源活性肽，進(jìn)一步采用單側(cè)紋狀體小劑量注射，成功制備早期PD模型[11-12]。我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蝎源活性肽可以保護(hù)PD早期大鼠的多巴胺能神經(jīng)元，其機(jī)制與保護(hù)線粒體損傷有關(guān)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)早期PD中腦DYN的免疫反應(yīng)活性明顯降低，而蝎源活性肽可以逆轉(zhuǎn)早期PD大鼠腦內(nèi)DYN的異常表達(dá)。提示DYN參與蝎源活性肽對早期PD大鼠中腦內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用，這為PD早期臨床診斷提供線索，為研究PD的發(fā)病機(jī)制以及抗PD藥物的研發(fā)提供重要的理論依據(jù)。

[1] 高云朝， 林祥通. MPTP帕金森病動物模型研究進(jìn)展[J]. 中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)， 2005， 13(4)： 261-265.

[2] 馬維亞， 劉慶安， 何 祥， 等. 帕金森病和多系統(tǒng)萎縮患者腦脊液阿片肽含量變化的研究[J]. 中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志， 1994， 1(1)： 53-56.

[3] Sivam SP. Cocaine selectively increases striatonigral dynorphin levels by a dopaminergic mechanism[J].JPharmacolExpTher, 1989, 250(3): 818-824.

[4] 趙連信. 中藥預(yù)防及抗腫瘤機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 遼寧醫(yī)學(xué)雜志， 2014， 28(6)： 325-327.

[5] 殷盛明, 趙 丹, 于德欽, 等. 蝎毒耐熱肽對6羥多巴早期帕金森病大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用(英文)[J]. 生理學(xué)報(bào)， 2014， 66(6)： 658-666.

[6] 蘇 穎， 曹學(xué)兵， 孫圣剛， 等. 左旋多巴治療對帕金森病大鼠紋狀體強(qiáng)啡肽表達(dá)的影響[J]. 中國康復(fù)， 2004， 19(3)： 142-144.

[7] Brooks DJ. The early diagnosis of Parkinson's disease[J].AnnNeurol, 1998, 44(3 Suppl 1): S10-18.

[8] 劉重斌, 王 瑞, 潘慧斌, 等. 番茄紅素對帕金森模型小鼠氧化應(yīng)激損傷及神經(jīng)行為的影響[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2013， 29(4)： 380-383.

[9] Henry B, Crossman AR, Brotchie JM. Effect of repeated L-DOPA, bromocriptine, or lisuride administration on prepro enphalin- A and preproenkephalin-B mRNA levels in the striatum of the 6-hydroxydopamine-lesioned rat[J].ExpNeurol, 1999, 155(2): 204-220.

[10]趙鋼勇， 崔 蕾， 高 娟， 等. BDNF基因工程細(xì)胞對帕金森大鼠紋狀體多巴胺及其代謝物影響的研究[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2013， 29(1)： 82-85.

[11]彭 巖， 殷盛明， 于德欽， 等. 早期帕金森病大鼠血清抗氧化能力降低[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2011， 27(2)： 218-220.

[12]徐 紅， 董方圓， 殷盛明， 等. 早期帕金森病大鼠膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)活性的改變及其意義[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2012， 28(1)： 71-73.

國家自然科學(xué)基金(31201724)； 遼寧省大學(xué)生科研創(chuàng)新活動(201310161008)

2014-11-10 【修回日期】2015-02-25

R285.5

A

1000-6834(2015)02-120-003

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.007

△【通訊作者】Tel： 0411-86110288; E-mail: dlshengming@163.com；+為共同第一作者