李新娟， 張 艷， 徐春陽(yáng)， 李 爽， 杜愛(ài)林， 張利彬， 張瑞嶺

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省生物精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2. 生理學(xué)教研室， 3. 免疫學(xué)教研室， 新鄉(xiāng) 453003； 4. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院二附院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

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白藜蘆醇甙對(duì)慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬Cdk5激酶活性的影響*

李新娟1，2， 張 艷1，2， 徐春陽(yáng)1，3， 李 爽1，2， 杜愛(ài)林1，2， 張利彬1，2， 張瑞嶺1，4△

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省生物精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2. 生理學(xué)教研室， 3. 免疫學(xué)教研室， 新鄉(xiāng) 453003； 4. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院二附院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的：研究白藜蘆醇甙對(duì)慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5 (Cdk5)活性的影響。方法：40只大鼠隨機(jī)分為4組(n=10)：對(duì)照組、酒精中毒模型組、酒精中毒+白藜蘆醇甙低劑量組、酒精中毒+白藜蘆醇甙高劑量組。以灌胃法(每天3.0 g/kg酒精)建立慢性酒精中毒大鼠模型。戒斷評(píng)分法觀察戒斷癥狀；Morris水迷宮測(cè)試學(xué)習(xí)記憶成績(jī)；免疫熒光法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)Cdk5蛋白表達(dá)；液閃法檢測(cè)海馬組織Cdk5 激酶活性。 結(jié)果：酒精中毒模型組戒斷評(píng)分、水迷宮測(cè)試結(jié)果、Cdk5激酶活性，均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；白藜蘆醇甙高劑量組戒斷評(píng)分、水迷宮測(cè)試結(jié)果，均明顯低于酒精中毒模型組(P<0.05)；白藜蘆醇甙高低劑量組Cdk5激酶活性均明顯低于酒精中毒模型組(P<0.05)；酒精中毒模型組大鼠海馬區(qū)Cdk5陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，給予白藜蘆醇甙干預(yù)后Cdk5陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較酒精中毒模型組減少(P<0.05)。 結(jié)論：白藜蘆醇甙能夠緩解酒精中毒所致的記憶損傷，這種作用可能與下調(diào)Cdk5激酶活性有關(guān)。

白藜蘆醇甙；慢性酒精中毒；細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5 ；學(xué)習(xí)記憶

酒精中毒所致的健康、心理和社會(huì)問(wèn)題是當(dāng)前重大的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。白藜蘆醇甙(polydatin，PD) 是從植物中提取的天然化學(xué)物質(zhì)。研究表明它有多方面的藥理作用，如對(duì)抗局部缺血/再灌注、抗血小板聚集、改善微循環(huán)[2]等。也有研究顯示，白藜蘆醇甙具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[3]，但其作用機(jī)制尚待研究。腦中細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，Cdk5)在神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)，參與神經(jīng)系統(tǒng)中突觸可塑性的形成，而且和藥物成癮有密切關(guān)系[4]。本實(shí)驗(yàn)力圖通過(guò)觀察白藜蘆醇甙對(duì)慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其與Cdk5激酶活性改變的關(guān)聯(lián)，從而探討白藜蘆醇甙的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

鄭州大學(xué)動(dòng)物中心提供清潔級(jí)健康2個(gè)月齡SD雌性大鼠40只 (許可證號(hào)：scxk(豫)2010-0001)，體質(zhì)量200～220 g。飼養(yǎng)于安靜環(huán)境下，自由進(jìn)食和飲水，自然晝夜節(jié)律光照。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(CNT)、酒精中毒模型組(CEA)、酒精中毒+白藜蘆醇甙低劑量組(ELP)、酒精中毒+白藜蘆醇甙高劑量組(EHP)，每組10只。本研究已經(jīng)河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 藥品及試劑

白藜蘆醇甙(純度99%，鄭州荔諾)；兔抗鼠Cdk5多克隆抗體(北京博奧森)；Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、抗熒光淬滅封片液(北京碧云天)；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(北京中杉金橋)。

1.3 慢性酒精中毒模型的建立

參照文獻(xiàn)[5]方法建立酒精中毒模型。每天灌胃3.0 g/kg酒精[溶于濃度為1%的蔗糖溶液]，對(duì)照組以等體積蔗糖溶液灌胃，連續(xù)灌胃30 d。

1.4 給藥

灌胃30 d后，白藜蘆醇甙高、低劑量組大鼠在酒精灌胃后2 h分別以為0.1%和0.4%的白藜蘆醇甙生理鹽水混懸液(2 ml/kg)灌胃，酒精中毒模型組和對(duì)照組以等體積生理鹽水灌胃, 連續(xù)灌胃10 d。

1.5 戒斷評(píng)分

停止灌胃后6 h，各組大鼠按照Gray等[6]戒斷評(píng)分法觀察戒斷癥狀(刻板行為、激惹性、尾巴強(qiáng)直、異常姿勢(shì)、聽(tīng)源性癲癇發(fā)作)18 min。

1.6 Morris水迷宮檢測(cè)[7]

戒斷評(píng)分后進(jìn)行，獲得性訓(xùn)練4 d，每天4次，每只動(dòng)物從四個(gè)不同象限放入迷宮水池觀察60 s，動(dòng)物找到并爬上平臺(tái)后使其適應(yīng)20 s，若超過(guò)時(shí)限未找到平臺(tái)，引導(dǎo)動(dòng)物找到平臺(tái)并讓動(dòng)物在平臺(tái)上停留20 s。每只動(dòng)物兩次訓(xùn)練時(shí)間間隔約15 min，每天在同一時(shí)間進(jìn)行訓(xùn)練。定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物訓(xùn)練4 d后，第5天撤去平臺(tái)，從離原平臺(tái)位置最遠(yuǎn)的象限放入迷宮水池，記錄120 s運(yùn)動(dòng)軌跡，以每只動(dòng)物第一次到達(dá)原平臺(tái)的時(shí)間(逃逸潛伏期)、全程距平臺(tái)的平均距離作為大鼠學(xué)習(xí)記憶的成績(jī)。

1.7 免疫熒光法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)Cdk5蛋白表達(dá)

大鼠斷頭取腦，將鼠腦置于特制大鼠腦分割槽內(nèi)，自視交叉處切開(kāi)，取視交叉后腦組織，在冷凍切片機(jī)內(nèi)切成20 μm厚切片，貼于防脫載玻片上；微波修復(fù)15 min，血清封閉20 min；然后加入兔抗鼠Cdk5多克隆抗體 (1∶100)，置于4℃過(guò)夜；加入Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶500)，于室溫下靜置2 h；DAPI核復(fù)染3 min；以抗熒光淬滅液封片；在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 液閃法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)Cdk5激酶活性

分別取各組大鼠海馬區(qū)的組織溶解液100 μg 和5 μl Cdk5 多克隆抗體，4℃環(huán)境下共孵育2 h，再加入瓊脂糖凝膠使Cdk5 沉淀, 收集免疫復(fù)合物，PBS 液洗滌5 次，去上清，加入激酶緩沖液(30 mmol/L MOPS，10 mmol/L MgCl2，pH7.4)、2 μg 組蛋白H1 多肽和5 μCi的32P 標(biāo)記的γ-ATP 溶液, 反應(yīng)終體積為50 μl，置于37℃溫箱中孵化30 min。液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定產(chǎn)物的放射性活度(CPM值，以該值反映Cdk5 活性大小, CPM 值越大表示活性越高)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠戒斷評(píng)分結(jié)果

酒精中毒模型組大鼠在酒精撤除后6 h出現(xiàn)打噴嚏、極易激惹、聽(tīng)源性癲癇發(fā)作次數(shù)和強(qiáng)度均增加，綜合評(píng)分明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予高劑量白藜蘆醇甙干預(yù)后，綜合評(píng)分降低，與酒精中毒模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

GroupAbstinencescoreEscapelatency(s)Radioactivity(countperminute)Cdk5-positivecell(numbers/field)CNT6.4±1.910.9±5.71892.8±167.38.8±1.4CEA13.2±2.7*21.8±5.2*3770.0±269.2*42.5±2.8*ELP12.8±2.917.5±6.32533.2±158.3#15.3±1.7#EHP7.7±1.6#11.1±5.8#2247.9±177.1#11.4±1.5#

CNT: Control group; CEA: Chronic ethanol administered group; ELP: Ethanol + low dose polydatin; EHP: Ethanol + high dose polydatin; Cdk5: Cyclin-dependent kinase 5

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCEA group

2.2 各組大鼠水迷宮測(cè)試結(jié)果

各組大鼠在獲得性訓(xùn)練第4天典型游泳軌跡如圖1，酒精模型組、低劑量白藜蘆醇甙干預(yù)組游泳軌跡隨機(jī)性較大，軌跡雜亂；正常對(duì)照組、高劑量白藜蘆醇甙干預(yù)組軌跡具有明顯的趨向性。定位導(dǎo)航試驗(yàn)潛伏期顯示：酒精模型組潛伏期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.05)；高劑量白藜蘆醇甙干預(yù)后，潛伏期明顯縮短于酒精模型組(P<0.05， 表1)。

Fig. 1 Typical swim- tacking path in the Morris water maze CNT: Control group; CEA: Chronic ethanol administered group; ELP: Ethanol + low dose polydatin; EHP: Ethanol + high dose polydatin

2.3 各組大鼠海馬組織Cdk5激酶活性

酒精中毒模型組大鼠海馬組織Cdk5激酶活性明顯高于對(duì)照組 (P<0.05)，給予高低劑量白藜蘆醇甙干預(yù)后，海馬組織Cdk5激酶活性明顯低于酒精中毒模型組 (P<0.05，表1)。

2.4 各組大鼠海馬區(qū)Cdk5蛋白表達(dá)

Cdk5蛋白在海馬神經(jīng)元細(xì)胞高表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)呈綠色熒光。酒精中毒組與對(duì)照組比較，鏡下見(jiàn)大量綠色熒光著色細(xì)胞，分布比較密集，且熒光強(qiáng)度增加(P<0.05)。經(jīng)圖像分析軟件分析，白藜蘆醇甙高劑量干預(yù)后，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比酒精中毒組明顯減少。(P<0.05，表1、圖2)

3 討論

海馬(hippocampus)是神經(jīng)元可塑性的重要區(qū)域，與學(xué)習(xí)記憶的形成密切相關(guān)。酒精對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞具有明顯毒性作用，并進(jìn)而造成學(xué)習(xí)記憶損傷。因此我們選取大鼠海馬組織作為慢性酒精中毒所致學(xué)習(xí)記憶損傷的研究部位。

Cdk5是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶 (cyclin-dependent kinases，Cdk)家族成員，在神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Cdk5參與神經(jīng)系統(tǒng)中突觸可塑性的形成，而且和藥物成癮有密切關(guān)系[4]。我們先前的研究也證實(shí)[8]，Cdk5與酒精暴露有密切的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢性酒精中毒大鼠海馬區(qū)Cdk5蛋白表達(dá)及其激酶活性均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig. 2 Cdk5 protein expression in the hippocampus by immunofluorescence (Alexa Fluor 488， bar=10 μm) A： Control group； B： Chronic ethanol administration group； C: Ethanol + low dose polydatin； D： Ethanol + high dose polydatin

白藜蘆醇甙(polydatin，PD) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)為3，4′，5-羥基芪-3-β-D-葡萄糖苷，具有顯著的抗神經(jīng)毒性作用，但其作用機(jī)制尚待研究[3]。目前的研究認(rèn)為白藜蘆醇甙可以快速抑制谷氨酸誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+的升高，起到鈣拮抗劑作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白藜蘆醇甙能夠?qū)孤跃凭卸舅麓笫髮W(xué)習(xí)記憶損傷，這與之前研究結(jié)果一致。

有研究顯示Cdk5 的激活蛋白p35和p39受[Ca2+]i調(diào)節(jié)水解成p25和p29，進(jìn)而使Cdk5 的活性增加，過(guò)度激活的p25/Cdk5可以導(dǎo)致明顯的神經(jīng)毒性[10]。本研究結(jié)果顯示，慢性酒精中毒后以不同劑量白藜蘆醇甙干預(yù)，大鼠海馬區(qū)Cdk5激酶活性下調(diào)，與模型組相比較，差異有顯著性。而如前所述，白藜蘆醇甙能抑制谷氨酸所誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)[Ca2+]i升高。提示白藜蘆醇甙可能是作為一種鈣通道拮抗劑起作用, 進(jìn)而抑制Cdk5的過(guò)度活化，減輕神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載所致的腦損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用。這種抑制作用的信號(hào)通路值得進(jìn)一步研究。此外，研究結(jié)果也顯示，Cdk5蛋白表達(dá)及其激酶活性在慢性酒精中毒及白藜蘆醇甙干預(yù)過(guò)程中，其變化并不完全一致，其原因尚待研究。

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Effects of polydatin on learning and memory and Cdk5 kinase activity in the hippocampus of rats with chronic alcoholism

LI Xin-juan1，2， ZHANG Yan1，2， XU Chun-yang1，3， LI Shuang1，2， DU Ai-lin1，2， ZHANG Li-bin1，2，ZHANG Rui-ling1，4△

(1. Henan Key Laboratory of Biological Psychiatry， 2. Department of Physiology， 3. Department of Immunology，4. The Second Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)

Objective: To observe the effects of polydatin on learning and memory and cyclin-dependent kinase 5(Cdk5) kinase activity in the hippocampus of rats with chronic alcoholism. Methods: Forty rats were randomly divided into 4 groups : control group, chronic alcoholism group, low and high polydatin group. The rat chronic alcoholism model was established by ethanol 3.0 g/(kg·d) (intragastric administration). The abstinence scoring was used to evaluate the rats withdrawal symptoms; cognitive function was measured by Morris water maze experiment; Cdk5 protein expression in the hippocampus was detected by immunofluorescence; Cdk5 kinase activity in the hippocampus was detected by liquid scintillation counting method. Results: The abstinence score，escape latency，Cdk5 kinase activity in chronic alcoholism group rats were significantly higher than those of control group (P<0.05). The abstinence score，escape latency in high polydatin group rats were significantly lower than those of chronic alcoholism group (P<0.05); Cdk5 kinase activity in high and low polydatin group rats was significantly lower than that of chronic alcoholism group(P<0.05); immunofluorescence showed that the Cdk5 positive cells of chronic alcoholism group were significantly increased compared with control group (P<0.05), and the Cdk5 positive cells of polydatin groups were significantly decreased compared with chronic alcoholism group (P<0.05). Conclusion: Polydatin-reduced the chronic alcoholism damage may interrelate with regulation of Cdk5 kinase activity.【KEY WORDS】 polydatin; chronic alcoholism; Cdk5; learning and memory

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目培育基金(2013ZD112)；河南省生物精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(ZDSYS2011003)；河南省科技廳基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(142300410026)

2014-12-15 【修回日期】2015-02-26

R742

A

1000-6834(2015)02-117-004

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.006

△【通訊作者】Tel： 0373-3029104； E-mail： zhangruilingxx@126.com