秦開秀， 李醇文， 方 艷， 余 雷， 王曉龍

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急救部， 重慶 400010)

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百草枯對(duì)活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生和中性粒細(xì)胞凋亡的影響*

秦開秀， 李醇文， 方 艷， 余 雷， 王曉龍△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急救部， 重慶 400010)

目的：探討百草枯(PQ)對(duì)活性氧類物質(zhì)(ROS)和中性粒細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。方法：離體培養(yǎng)健康成人中性粒細(xì)胞，給予不同濃度百草枯刺激后培養(yǎng)6～24 h,流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞凋亡率及ROS含量，Western blot檢測信號(hào)蛋白核因子kappa B(NF-кB)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase 3)；給予ROS、NF-κB拮抗劑后，再次檢測中性粒細(xì)胞凋亡率及信號(hào)蛋白含量。結(jié)果：PQ可明顯促進(jìn)ROS產(chǎn)生及抑制中性粒細(xì)胞凋亡，這種效應(yīng)可被ROS抑制劑二聯(lián)苯碘(DPI)及NF-кB抑制劑四氫吡咯二硫代氨基甲酯(PDTC)逆轉(zhuǎn)。同時(shí)，PQ能促進(jìn)NF-κB表達(dá)增加，而Caspase 3表達(dá)則受到明顯抑制。結(jié)論：百草枯是強(qiáng)力的ROS誘導(dǎo)劑，并能抑制中性粒細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與NF-κB活化，進(jìn)而抑制Caspase 3表達(dá)有關(guān)。

百草枯；活性氧類物質(zhì)；中性粒細(xì)胞；凋亡

百草枯(paraquat,PQ)是一種強(qiáng)力快速的接觸性除草劑，對(duì)人體具極大危害性，PQ中毒目前尚無特異的治療方法。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1]，PQ誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)是百草枯中毒的中心環(huán)節(jié)。ROS一方面直接導(dǎo)致細(xì)胞成份中的脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)破壞及DNA斷裂[2]；同時(shí)ROS作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與了中性粒細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)過程[3]。已有證據(jù)表明[4]，中性粒細(xì)胞的過度活化是全身炎癥反應(yīng)(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)重要一環(huán)，其在肺內(nèi)聚集、扣押及凋亡延遲導(dǎo)致炎癥反應(yīng)進(jìn)一步被放大的“瀑布效應(yīng)”，從而進(jìn)一步發(fā)展成為急性肺損傷。嚴(yán)重PQ中毒會(huì)導(dǎo)致SIRS發(fā)生，而中性粒細(xì)胞是參與SIRS過程中最為重要的細(xì)胞之一。正常情況下，中性粒細(xì)胞在循環(huán)中生存時(shí)間僅8～20 h，其正常凋亡是炎癥局限的必要一環(huán)。大量文獻(xiàn)表明，SIRS條件下中性粒細(xì)胞凋亡顯著延遲[5]，但PQ對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡影響鮮有研究報(bào)道。我們通過離體培養(yǎng)健康人中性粒細(xì)胞，PQ刺激后檢測ROS及中性粒細(xì)胞凋亡情況，并通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子抑制劑進(jìn)一步探討ROS對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡影響及可能信號(hào)通路，為更深入探究PQ所致SIRS奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

20% PQ購于天津三農(nóng)化工有限公司；NADPH氧化酶抑制劑二聯(lián)苯碘(diphenyleneiodonium，DPI)，核因子кB(nuclear factor kappa B,NF-κB)抑制劑四氫吡咯二硫代氨基甲酯(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)，購自Sigma公司；ROS 檢測試劑盒購自美國細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)公司；熒光素標(biāo)記的連接素V-碘化丙錠(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，F(xiàn)ITC-PI)雙染色凋亡試劑盒購于美國BD公司；NF-κB pP65、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase 3)單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 中性粒細(xì)胞分離培養(yǎng)及處理

2周內(nèi)未服用藥物的健康成人志愿者為獻(xiàn)血員，參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行中性粒細(xì)胞分離純化。臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定分離中性粒細(xì)胞活性超過98%，然后以1.6×105cells/ml密度培養(yǎng)于D-PBS(含Ca2+、 Mg2+、 1 g/L葡萄糖、4 mmol/L碳酸氫鈉鹽)。中性粒細(xì)胞然后加入終濃度為5, 50 or 100 μmmol/L PQ培養(yǎng)6～24 h,流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞凋亡率，ROS試劑盒檢測ROS含量。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組予以50 μmmol/L DPI 和/或10 μmmol/L PDTC分別與中性粒細(xì)胞孵育30 min后，再予5 μmmol/L PQ刺激6 h,以生理鹽水(normal saline,NS)作為陰性對(duì)照、未加入DPI及PDTC為陽性對(duì)照，檢測中性粒細(xì)胞凋亡率、ROS、NF-κB及Caspase 3含量。以上每個(gè)濃度重復(fù)4次，取其均值為最終結(jié)果。

1.3 中性粒細(xì)胞ROS檢測

采用美國細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)公司OxiSelectTM ROS檢測試劑盒進(jìn)行檢測。首先吸除中性粒細(xì)胞培養(yǎng)液，DPBS沖洗3次，加入100 μl 1×DCFH-DA 37℃培育45 min，再予DPBS沖洗3次，流式細(xì)胞儀于488 nm激發(fā)光波長下檢測熒光強(qiáng)度。

1.4 中性粒細(xì)胞凋亡檢測

應(yīng)用熒光素標(biāo)記的Annexin V-FITC/PI 試劑盒進(jìn)行檢測。培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞用冰冷的PBS沖洗2遍，然后用結(jié)合緩沖液懸浮。然后按照說明書加入Annexin V-FITC 和PI進(jìn)行標(biāo)記，1 h后上流式細(xì)胞儀檢測。以Annexin V-FITC陽性，而PI陰性表示凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞占檢測細(xì)胞總數(shù)的百分比為凋亡率。

1.5 Western blot 檢測

蛋白提取液提取中性粒細(xì)胞蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。40 μg提取蛋白于12% SDS-PAG上電泳，然后半干轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。5%(w/v) 脫脂奶粉封閉，加入NF-κB及Caspase 3單克隆抗體(1∶1 000)，以β-actin作為內(nèi)參照，4°C過夜。1∶5 000辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗處理后，用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。測得結(jié)果與內(nèi)參照相比的比值作為最終結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PQ對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡的影響

與陰性對(duì)照組(NS )相比，5 μmmol/L PQ及以上濃度時(shí)，同時(shí)點(diǎn)中性粒細(xì)胞凋亡比例顯著下降(P<0.05)，但這種抑制效應(yīng)并未隨PQ濃度增加而呈現(xiàn)濃度依賴性(表1)。

Group6h12h18h24hNS66.3±4.677.5±5.783.4±8.293.5±8.85μmol/L44.6±4.8*55.3±6.2*66.0±7.2*78.4±7.4*50μmol/L42.6±3.6*51.8±4.6*60.4±6.1*81.8±6.2*100μmol/L37.8±3.9*50.2±3.8*56.4±5.0*81.9±5.3*

NS: Normal saline； PQ: Paraquat

*P<0.05vsNS group

2.2 PQ誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡的影響

加入不同濃度PQ組在6, 12, 18 及 24 h時(shí)點(diǎn)，中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的ROS均較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，但在同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度PQ組間差異無顯著性(表2)。

為進(jìn)一步確定PQ對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡的影響是否通過ROS而產(chǎn)生，給予50 μmol/L ROS拮抗劑DPI和/或10 μmol/L NF-κB拮抗劑PDTC預(yù)處理后，再予5 μmol/L PQ刺激6 h，ROS含量顯著下降,而中性粒細(xì)胞凋亡率則明顯上升(P<0.05，表3)。 PQ作用下，無論單純加入DPI或PDTC，或二者聯(lián)合，對(duì)ROS產(chǎn)生及中性粒細(xì)胞凋亡率影響無顯著性差異。

Group6h12h18h24hNS31.4±6.530.5±7.128.7±7.326.2±7.55μmol/L63.8±11.5*64.9±12.5*60.1±11.3*56.8±13.8*50μmol/L67.5±12.1*51.8±4.6*62.4±14.1*60.4±13.8*100μmol/L2.3±13.9*75.0±3.8*67.3±12.9*65.3±14.5*

NS： Normal saline； ROS： Reactive oxygen species； PQ： Paraquat

*P<0.05vsNS group

2.3 NF-κB、Caspase 3 參與ROS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞凋亡延遲

PQ刺激后，NF-κB(pP65)均較對(duì)照組明顯升高，而DPI及PDTC可以顯著抑制NF-κB(pP65)的表達(dá)；與此相對(duì)應(yīng)的是，Caspase 3在PQ刺激后其活性成份明顯減低，再予以ROS抑制劑DPI及NF-κB抑制劑PDTC后Caspase 3含量增加(表4，圖1)。

GroupROS Apoptosis(%) NS34.5±3.267.3±6.8PQ62.6±7.4*41.5±4.5*PQ+DPI44.1±2.6#52.3±5.7#PQ+PDTC47.6±1.8#54.6±5.8#PQ+DPI+PDTC45.0±1.9#58.7±6.1#

NS： Normal saline； PQ： Paraquat； DPI： Diphenyleneiodonium； PDTC： Pyrrolidinedithiocarbamate； ROS： Reactive oxygen species

*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsPQ group

GrouppP65Caspase3NS0.280±0.0900.230±0.046PQ0.615±0.200*0.033±0.015*PQ+PDTC0.060±0.025*#0.710±0.036*#PQ+DPI0.436±0.194*#0.670±0.035*#

NS: Normal saline; PQ: Paraquat; DPI:Diphenyleneiodonium; PDTC: Pyrrolidinedithiocarbamate； NF-κB： Nuclear factor kappa B

*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsPQ group

Fig. 1 NF-κB,Caspase 3 expression in each group NS： Normal saline； PQ： Paraquat; DPI： Diphenyleneiodonium； PDTC： Pyrrolidinedithiocarbamate； PQ/PDTC: PQ plus PDTC; PQ/DPI: PQ plus DPI

3 討論

業(yè)已證實(shí)，PQ毒性與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS密切相關(guān)，中性粒細(xì)胞通過“呼吸爆發(fā)”成為重要的ROS來源。與此同時(shí)，中性粒細(xì)胞還通過釋放TNF-α、IL-10等炎癥介質(zhì)導(dǎo)致SIRS的發(fā)生。因此，可能基于上述原因，中性粒細(xì)胞數(shù)目升高成為PQ中毒重要的早期死因之一[6]。而中性粒細(xì)胞凋亡延遲無疑使這一病理生理過程進(jìn)一步惡化。那么，作為信號(hào)分子的ROS對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡的影響在PQ中毒過程中或許有重要作用。

有研究認(rèn)為，ROS對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡存在濃度相關(guān)性，低濃度抑制凋亡，高濃度促進(jìn)凋亡[7]；也有研究表明，ROS可以明顯抑制中性粒細(xì)胞凋亡而與其濃度無關(guān)[8]。PQ條件下產(chǎn)生的ROS對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡影響尚無報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，PQ可以明顯抑制中性粒細(xì)胞凋亡，而這種抑制作用在實(shí)驗(yàn)范圍的PQ濃度內(nèi)未呈現(xiàn)濃度依賴性。實(shí)驗(yàn)中給予PQ后，ROS含量明顯上升，給予ROS抑制劑DPI之后ROS含量下降，中性粒細(xì)胞凋亡增加，則可以證實(shí)PQ是導(dǎo)致ROS產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑，而PQ誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS是中性粒細(xì)胞凋亡延遲的重要原因。同時(shí)，我們前期研究發(fā)現(xiàn)[9]，PQ作為強(qiáng)烈的炎癥刺激因子，可促進(jìn)TNF-α等炎癥介質(zhì)大量釋放，而TNF-α等炎癥介質(zhì)又是強(qiáng)烈的ROS誘導(dǎo)劑，可能正是由于這種導(dǎo)致ROS產(chǎn)生的正反饋機(jī)制的存在，實(shí)驗(yàn)中ROS的產(chǎn)生與PQ未呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，而呈現(xiàn)出“全”或“無”的特點(diǎn)。

NF-κB是一類能與多種細(xì)胞因子基因啟動(dòng)子部位的κB位點(diǎn)結(jié)合并增強(qiáng)這些基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。研究表明[9]，PQ可促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子的大量釋放。而這些炎癥介質(zhì)的釋放與NF-κB的活化和表達(dá)增強(qiáng)有明顯關(guān)系[10]。NF-κB與其抑制因子IκBα以異源二聚體形式結(jié)合存在于胞漿中，受外界刺激后IκBα發(fā)生降解，NF-κB轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，發(fā)揮其效應(yīng)[4]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PQ可促進(jìn)p65表達(dá)，DPI能抑制其表達(dá)，表明PQ條件下NF-κB的激活與ROS密切相關(guān)。此外，NF-κB化學(xué)抑制劑PDTC可以促進(jìn)PQ條件下的中性粒細(xì)胞凋亡則表明NF-κB參與了抑制中性粒細(xì)胞凋亡環(huán)節(jié)。

Caspase 3是死亡受體途徑或線粒體途徑致細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和交匯點(diǎn)，是凋亡信號(hào)的執(zhí)行者。Hinz[11]通過構(gòu)建腺病毒轉(zhuǎn)染H/RS細(xì)胞表達(dá)NF-κB抑制劑IκBα后，觀察到 Caspase 3大量釋放，同時(shí)伴有大量細(xì)胞凋亡，表明NF-κB可通過抑制Caspase 3而抑制細(xì)胞凋亡。本次實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，PQ可以顯著抑制Caspase 3含量，而給予NF-κB化學(xué)抑制劑PDTC后Caspase 3活性明顯增加，中性粒細(xì)胞凋亡率相應(yīng)增加。由此，我們推測，NF-κB參與抑制中性粒細(xì)胞凋亡的下游環(huán)節(jié)是由于其對(duì)Caspase 3的抑制。

總之，本實(shí)驗(yàn)首次探討了PQ誘導(dǎo)的ROS對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡的影響及可能的信號(hào)通路。ROS-炎癥介質(zhì)-NF-κB可能以級(jí)聯(lián)形式導(dǎo)致炎癥反應(yīng)不斷放大，并進(jìn)一步抑制Caspase 3的活性，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞凋亡延遲，進(jìn)而使炎癥反應(yīng)進(jìn)行性惡化，這也許從一定程度上解釋了臨床上PQ中毒高病死率的原因，為PQ中毒探索新的思路具有一定意義。

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Effect of reactive oxygen species induced by paraquat on neutrophil apoptosis

QIN Kai-xiu, LI Chun-wen, FANG Yan, YU Lei, WANG Xiao-long△

(Department of Emergency, the 2ndAffiliated Hospital of Chongqimg Medical University, Chongqing 400010, China)

Objective: To investigate the effect of paraquat(PQ) on reactive oxygen species(ROS) and neutrophil apoptosis and its possible signal transduction pathways. Methods: Cultured neutrophils were treated with different concentrations of PQ for 6～24 h. The apoptosis rate of neutrophils and ROS content were determined by flow cytometry. The exoressions of nuclear factor kappa B (NF-κB) and Caspase 3 were detected by Western blot. These parameters were checked again after NF-κB and Caspase 3 antagonist were applied. Results: PQ could boost ROS generation and depress neutrophil apoptosis significantly. At the same time PQ could enhance the expression of NF-κB and inhibit the expression of Caspase 3. These effects could be reversed by ROS inhibitor diphenyleneiodonium(DPI) and NF-κB inhibitor pyrrolidinedithiocarbamate(PDTC). Conclusion: PQ is a potent inducer of ROS and can inhibit neutrophil apoptosis by activating NF-κB and surpressing Caspase 3 activity.

paraquat; reactive oxygen species; neutrophils; apoptosis

重慶市衛(wèi)生局基金(2013-2-036)

2014-09-15 【修回日期】2014-11-04

R557

A

1000-6834(2015)02-111-004

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.004

△【通訊作者】Tel: 023-63693775; E-mail: xiaolongwang126@126.com