王志旺， 李榮科， 藺興遙,2， 任 遠,2， 劉雪楓， 程小麗， 王瑞瓊

(1. 甘肅中醫(yī)學(xué)院, 蘭州 730000; 2. 甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室, 蘭州 730000)

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當(dāng)歸精油對大鼠實驗性哮喘的干預(yù)作用*

王志旺1,2△， 李榮科1， 藺興遙1,2， 任 遠1,2， 劉雪楓1， 程小麗1， 王瑞瓊1

(1. 甘肅中醫(yī)學(xué)院, 蘭州 730000; 2. 甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室, 蘭州 730000)

目的：研究當(dāng)歸精油對實驗性哮喘大鼠模型的平喘作用及對肺臟IL-10與Foxp3表達的影響。方法：取雌性大鼠隨機分6組(n=9)，通過注射卵白蛋白(OVA)和氫氧化鋁致敏與OVA霧化吸入激發(fā)復(fù)制哮喘模型，經(jīng)當(dāng)歸精油干預(yù)，觀測哮喘大鼠肺功能、哮喘行為學(xué)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-10(ELISA法)以及肺組織Foxp3(免疫組化法)的表達。結(jié)果：40～160 mg/kg當(dāng)歸精油可明顯改善哮喘大鼠的肺功能，減輕吸入混合激發(fā)液后的哮喘等行為學(xué)癥狀，提高BALF中IL-10的水平及肺組織Foxp3蛋白的表達強度。結(jié)論：當(dāng)歸精油具有一定的平喘作用，而改善Treg細胞免疫功能異常低下是其作用機制之一。

當(dāng)歸；精油；哮喘；IL-10；Foxp3；大鼠

當(dāng)歸(Angelica Sinensis(oliv.) Diels)是常用中藥之一，素有“十方九歸”之稱。自《神農(nóng)本草經(jīng)》謂當(dāng)歸“主咳逆上氣”以來，當(dāng)歸治療哮喘的機制與臨床應(yīng)用在歷代中醫(yī)藥著作中有詳細的記載，如《本草經(jīng)疏》謂當(dāng)歸“甘以緩之，辛以散之潤之，溫以通之暢之?；钛a血之要藥，故主咳逆上氣也?！彼幚韺嶒烇@示當(dāng)歸精油對豚鼠離體氣管平滑肌有明顯的解痙作用[1]，本次研究以肺功能、哮喘行為學(xué)以及肺組織Foxp3表達等為指標，探討當(dāng)歸精油對哮喘大鼠的平喘作用及其對相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

當(dāng)歸精油，甘肅省岷縣康達藥業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；Grade V卵白蛋白(OVA)，sigma公司生產(chǎn)；地塞米松片(dexamethasone)，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字H33020822，產(chǎn)品批號：111068；IL-10測試盒(ELISA)，深圳達科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號E3000-1309-2；Foxp3免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：39545；吐溫-80，上海大眾制藥廠，生產(chǎn)批號：70093。實驗時，將當(dāng)歸精油及地塞米松配制成乳狀液，另配制0.8%吐溫-80作為空白對照液，冷藏30 d內(nèi)使用。

1.2 儀器

超聲霧化器(420AI)，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機(TGL-16G)，上海安亭科學(xué)儀器廠；分光光度計(722型)，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；Sartorius電子分析天平(BS1103型)，北京賽多利斯儀器有限公司；恒溫水浴鍋(HH-S型)，金壇市正基儀器有限公司；醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(BI-2000型)，成都泰盟科技有限公司；光學(xué)顯微鏡(CH-212型)，日本Olympus。

1.3 動物

雌性SD大鼠，體質(zhì)量115～145 g，SPF級，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(甘)2004-0006；甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.4 篩選動物

將大鼠放于密閉玻璃箱內(nèi)(40 cm×30 cm×20 cm)，吸入超聲霧化的0.5%組胺，觀察大鼠吸入組胺后的呼吸變化情況，選擇吸入組胺后20 s內(nèi)出現(xiàn)呼吸急促、前肢縮抬、點頭或腹式呼吸等有哮喘癥狀的大鼠作為模型用鼠。

1.5 分組、造模及給藥

取上述篩選合格的雌性大鼠[2-4]54只，按體重分層隨機分為6組(n=9)，自由進食去OVA的特制飼料。致敏時，各組大鼠在第1天和第8天用新鮮配制的OVA 50 mg(5%)和含100 mg(10%)氫氧化鋁凝膠的生理鹽水混懸液共1 ml，于大鼠兩后足跖和兩側(cè)腹股溝四計點做皮下注射，每點0.2 ml，同時ip 0.2 ml；正常對照組以生理鹽水代替致敏。第15天開始激發(fā)，將大鼠放入玻璃容器內(nèi)，以霧化量0.8 ml/min吸入1%OVA，每天1次，一次20 min，連續(xù)28 d，正常對照組用生理鹽水代替激發(fā)。每次激發(fā)前1 h，各組大鼠ig相應(yīng)的藥物10 ml/kg，即當(dāng)歸精油高劑量組(High)、中劑量組(Middle)與低劑量組(Low)分別ig當(dāng)歸精油160 mg/kg、80 mg/kg與40 mg/kg，地塞米松組(Dexamethasone) ig地塞米松0.5 mg/kg，正常對照組(Control)與模型對照組(Model) ig空白對照液。每天1次，連續(xù)28 d。實驗過程中地塞米松組有一只大鼠因灌胃不慎而死亡，其余53只完成實驗。

1.6 觀測指標

1.6.1 哮喘大鼠吸入混合激發(fā)液后的行為學(xué)觀察 實驗進行到第27天與第41天，大鼠例行吸入OVA激發(fā)6 h后，觀察吸入2%乙酰膽堿與0.2%組胺混合激發(fā)液后15 min內(nèi)大鼠的打噴嚏次數(shù)、抓鼻次數(shù)與哮喘發(fā)作及其程度，參照相關(guān)文獻[5,6]，對哮喘發(fā)作程度進行評分，即有輕度喘息(躁動或靜伏)者計為3分，明顯喘息(呼吸困難，腹式呼吸、呼吸急促呈點頭狀但幅度較小、迅速抬頭做喘息狀)者計為6分，嚴重喘息(呼吸極度困難，呼吸急促呈點頭狀幅度大頻率高或反應(yīng)遲鈍)者計為9分。

1.6.2 大鼠肺功能檢測 實驗進行到第2天與第42天，進行動物肺功能檢測，將大鼠放入肺功能儀的密閉體積描記箱中，待動物安靜后，記錄哮喘大鼠呼吸功能相關(guān)指標。

1.6.3 BALF中IL-10的測定 大鼠最后一次激發(fā)24 h后，用2%戊巴比妥鈉麻醉，處死大鼠，分離氣管，參考相關(guān)文獻[8]，結(jié)扎左支氣管，提取支氣管肺泡灌洗液(BALF)，3 000 r/min離心10 min，取上清液按ELISA試劑盒說明測定大鼠BALF中IL-10的水平。1.6.4 肺組織Foxp3的表達 處死大鼠后，打開胸腔，于固定位置取未灌洗的左肺組織，10%甲醛固定，石蠟切片，免疫組化染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察Foxp3的表達并進行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸精油對哮喘大鼠吸入混合激發(fā)液后行為學(xué)的影響

隨著實驗的進行，大鼠激發(fā)后出現(xiàn)明顯的打噴嚏、抓鼻甚至哮喘發(fā)作等哮喘行為學(xué)癥狀；實驗中、后期在吸入OVA激發(fā)6 h后，觀察大鼠吸入乙酰膽堿與組胺混合激發(fā)液后的哮喘行為學(xué)癥狀。實驗結(jié)果顯示，哮喘模型大鼠吸入混合激發(fā)液后打噴嚏次數(shù)與抓鼻次數(shù)明顯增加，多數(shù)出現(xiàn)程度不同的哮喘癥狀，與正常對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義；經(jīng)40～160 mg/kg當(dāng)歸精油干預(yù)后，大鼠哮喘行為學(xué)指標有不同程度的緩解(P<0.5, 0.01，表1、表2)。

2.2 當(dāng)歸精油對哮喘大鼠肺功能的影響

實驗進行至第28天與第42天(即激發(fā)第14天與第28天)測定大鼠肺功能。實驗數(shù)據(jù)顯示，與正常對照組相比，模型對照組大鼠呼氣峰流量顯著降低(P<0.01，表3)；經(jīng)當(dāng)歸精油干預(yù)后，哮喘大鼠的呼氣峰流量明顯增加(P<0.05)；但呼氣時間無明顯變化。

2.3 當(dāng)歸精油對哮喘大鼠BALF中IL-10的影響

與正常對照組比較，哮喘模型大鼠BALF中IL-10的含量顯著降低(P<0.01，表4)；經(jīng)當(dāng)歸精油防治后，IL-10的含量上升，與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05, 0.01)。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Tab. 2 Effect of VOA on asthmatic behaviors of rat administering excited liquid in 41 day (times, ±s)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Tab. 3 Effect of VOA on respiratory function of asthmatic rats ±s)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

2.4 當(dāng)歸精油對哮喘大鼠肺組織中Foxp3表達的影響

在高倍視野下，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3經(jīng)免疫組化染色后陽性反應(yīng)者為棕藍色顆粒沉著，大鼠肺組織轉(zhuǎn)錄因子Foxp3主要表達于氣道周圍及肺組織中淋巴細胞等細胞胞漿與細胞核內(nèi)(圖1A)。哮喘模型組大鼠肺組織Foxp3的表達強度明顯減弱(圖1B)；而當(dāng)歸精油各劑量組Foxp3的表達強度有所增加(圖1D、圖1E、圖1F)。同時，采用顯微醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對Foxp3蛋白表達強度進行半定量分析，結(jié)果顯示，模型對照組大鼠肺組織Foxp3表達的平均光密度值顯著減小，與正常對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表4)；經(jīng)當(dāng)歸精油干預(yù)后，F(xiàn)oxp3的表達強度明顯增強，與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

哮喘(支氣管哮喘)是多種原因參與的氣道慢性炎癥性疾病，雖然近年來采取多種治療措施(包括綜合抗炎治療方案)，但其發(fā)病率及死亡率并無明顯降低[7]，因此研發(fā)新的治療方法(包括新藥)非常必要。

Fig. 1 Effect of VOA on Foxp3 expression in lung tissue of asthmatic rats (×40) A: Control group; B: Model group; C: Dexamethasone group; D: High dose of VOA group; E: Middle dose of VOA group; F: Low dose of VOA group

在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載中藥當(dāng)歸有“主咳逆上氣”的功效，近年來臨床研究顯示，當(dāng)歸精油具有防治哮喘的作用，當(dāng)歸精油丸、當(dāng)歸喘痛寧等制劑在治療哮喘方面取得了比較好的療效[8,9]。本課題組在前期離體實驗的基礎(chǔ)上，采用卵蛋白復(fù)制大鼠哮喘模型，觀測當(dāng)歸精油防治哮喘的作用及其可能機制。

Tab.

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vslow dose of VOA group

過敏性哮喘臨床上除了哮喘的癥狀外，還有過敏的癥狀，本次實驗在激發(fā)的中、后期，觀測大鼠吸入組胺與乙酰膽堿混合激發(fā)液后的哮喘行為學(xué)變化，結(jié)果顯示當(dāng)歸精油對哮喘大鼠打噴嚏、抓鼻及哮喘發(fā)作癥狀等有明顯的緩解作用。肺功能的衰減是哮喘致病的關(guān)鍵因素，本實驗在激發(fā)的中、后期對哮喘大鼠的肺功能進行監(jiān)測，結(jié)果提示當(dāng)歸精油對哮喘大鼠呼氣峰流量的減小有明顯的抑制作用。哮喘大鼠吸氣容易而呼氣難，致使呼氣時間有延長的趨勢；但另一方面，哮喘大鼠由于機體缺氧，交感神經(jīng)興奮，呼吸頻率加快，呼吸一次的時間縮短，使呼氣時間有縮短的趨勢，故在整個實驗過程中呼氣時間沒有明顯變化。

哮喘是多種炎性細胞參與的氣道慢性炎癥性疾病，Treg細胞(regulatory T cells, 調(diào)節(jié)性T細胞)約占外周CD4+T細胞的5～10%，是一類調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)的T細胞亞群。近年來研究顯示，Treg細胞功能低下導(dǎo)致效應(yīng)T細胞過度增殖是哮喘的發(fā)病機制之一[10,11]。Treg細胞的特征性標志是叉狀頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/winged helix transcription factor,Foxp3)，F(xiàn)oxp3特異性表達于Treg細胞并對其發(fā)育和功能起重要的作用，F(xiàn)oxp3缺乏可導(dǎo)致CD4+CD25+Treg細胞功能的缺失，故Foxp3被認為是CD4+CD25+Treg細胞功能的主開關(guān)[12]。作為誘導(dǎo)型Treg細胞(iTreg)之一的Tr1細胞能分泌IL-10，而IL-10能夠抑制效應(yīng)T細胞(包括Th2、Th17等)的過度活化，對哮喘過程中偏亢的免疫反應(yīng)起重要的負調(diào)節(jié)作用[13]。本次實驗結(jié)果提示，當(dāng)歸精油對哮喘動物模型BALF中IL-10的低水平、肺組織中Foxp3的低表達有一定的改善作用。

總之，當(dāng)歸精油具有一定的平喘抑喘作用，而提高IL-10與Foxp3的表達、改善Treg細胞免疫功能異常低下可能是其作用機制之一。

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Effect of Volatile Oil of Radix Angelicae Sinensis on experimental asthma in rats

WANG Zhi-wang1,2△, LI Rong-ke1, LIN Xing-yao1,2, REN Yuan1,2, LIU Xue-feng1,CHENG Xiao-li1, WANG Rui-qiong1

(1． Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 2． Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for Traditional Chinese Medicine of Gansu Province, Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Objective: To study the effects of Volatile Oil of Radix Angelicae Sinensis (VOA)on experimental asthma in rat model based on abnormal immune functions of Treg cells. Methods: After grouping, the asthmatic rats were developed through injecting OVA and AI(OH)3for sensitization and then administering OVA aerosol for challenge, and the respiratory functions, asthmatic behaviors, IL-10 levels in broncho-alveolar lavage fluid(BALF) (ELISA) and Foxp3 expression (immunohistochemistry) in lung of asthmatic rats were observed. Results: VOA at the doses of 40～160 mg/kg could improve the respiratory functions and the asthmatic behaviors, and upgrade IL-10 levels in BALF and Foxp3 expression in lung of asthmatic rats. Conclusion: VOA has some effects of anti-asthma and one of the mechanisms is to improving the lower immune functions of Treg cells.

Radix Angelicae Sinensis; Volatile Oil; asthma; IL-10; Foxp3; rat

國家自然科學(xué)基金項目(81460668)；甘肅省自然科學(xué)基金項目(1310RJZA086)；甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室開放基金項目(ZDSYS-KJ-2013-008)

2015-01-15 【修回日期】2015-02-07

R562.25；R285.5

A

1000-6834(2015)02-107-004

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.003

△【通訊作者】Tel: 0931-8765395; E-mail: wzw0933@126.com