陳涵斌， 馬 駿， 李慧敏， 牛三強， 陳顯武， 陳國榮， 陳三妹， 王蓉蓉△

(1. 溫州醫(yī)科大學， 浙江 溫州 325035； 2. 山西省大同市第三人民醫(yī)院病理科， 大同 037008；3. 紹興文理學院醫(yī)學院， 浙江 紹興 312000； 4. 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科， 浙江 溫州 325015)

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鄰苯二甲酸酯染毒哺乳期母鼠對雄性仔鼠睪丸Leydig細胞形態(tài)及功能的影響*

陳涵斌1， 馬 駿1， 李慧敏1， 牛三強2， 陳顯武1， 陳國榮4， 陳三妹3△， 王蓉蓉4△

(1. 溫州醫(yī)科大學， 浙江 溫州 325035； 2. 山西省大同市第三人民醫(yī)院病理科， 大同 037008；3. 紹興文理學院醫(yī)學院， 浙江 紹興 312000； 4. 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科， 浙江 溫州 325015)

目的：觀察鄰苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)對哺乳期雄性仔鼠睪丸子Leydig細胞(PLC)形態(tài)和功能的影響及作用機制。方法：SD孕鼠20只，隨機均分為4組(n=5)：正常對照組，低劑量組，中劑量組，高劑量組。仔鼠出生第1天起分別以0、10、100、750 mg/(kg·d) DEHP灌胃染毒母鼠，直到仔鼠出生后21 d。用化學發(fā)光法檢測雄性仔鼠血清睪酮(T)水平；測量體重、睪丸重量、肛生殖器距離(AGD)；光鏡及電鏡下觀察睪丸Leydig細胞形態(tài)結構；免疫組化方法檢測睪丸類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白(StAR)表達；Real-time PCR法檢測睪丸胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)mRNA的表達。結果：與正常組比較，低劑量組T無明顯變化，中、高劑量組血清T水平明顯降低(P<0.01)。低劑量組睪丸重量增加(P<0.05)，高劑量組睪丸重量、仔鼠體重明顯下降(P<0.01)；中、高劑量組AGD明顯縮短(P<0.01)。低劑量組睪丸Leydig細胞明顯增生，呈簇狀分布；中、高劑量組睪丸Leydig細胞灶區(qū)輕度增生，高劑量組部分生精小管生精細胞層次減少、生精細胞凋亡并脫落。電鏡觀察各給藥組Leydig細胞胞漿脂質顆粒減少，線粒體、內質網(wǎng)減少。低劑量組IGF-ⅠmRNA表達增高(P<0.05)；中、高劑量組睪丸StAR蛋白表達降低(P<0.05)。結論：哺乳期染毒DEHP可干擾仔鼠PLC的睪酮合成，StAR蛋白的降低和Leydig細胞的損傷可能是其機制?！娟P鍵詞】 鄰苯二甲酸二乙基己基酯；Leydig細胞；睪酮；胰島素樣生長因子-Ⅰ；類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白；仔鼠

近年來，人類生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率的升高、青春期發(fā)育的紊亂和兒童生殖系統(tǒng)的畸變引起人們的關注，這些現(xiàn)象與環(huán)境污染有關系。鄰苯二甲酸酯(diethylhexylphthalate, DEHP)作為一種增塑劑廣泛用于軟性聚氯乙稀的產(chǎn)品中。DEHP可影響雄性動物的生殖和發(fā)育，包括精子生成障礙、睪酮合成下降、精子動力改變以及胚胎畸形等[1]。

Leydig細胞是雄性生殖內分泌細胞，它產(chǎn)生睪丸激素-睪丸酮(T)，是唯一重要的男性激素來源[2]，DEHP可能通過多種機制對Leydig細胞的功能產(chǎn)生影響。

本實驗通過DEHP染毒哺乳期母鼠，觀察雄性仔鼠睪丸子Leydig細胞的形態(tài)學改變，檢測雄性仔鼠血清睪酮的水平、睪丸IGF-Ⅰ基因mRNA表達和StAR蛋白的表達，探討DEHP對子Leydig細胞形態(tài)與功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理

自然受孕SPF級SD母鼠20只(溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，隨機均分為4組(n=5)：正常對照組、DEHP低劑量組、中劑量組、高劑量組。后3組從仔鼠出生第1天起給予母鼠不同劑量的DEHP (SIGMA-ALDRICH公司)和玉米油混合物0.5 ml/d灌胃，直到仔鼠出生后21 d。DEHP實際用量為：低劑量組10 mg/(kg·d)、中劑量組100 mg/(kg·d)、高劑量組750 mg/(kg·d)；正常對照組給予0.5 ml/d 玉米油(市售精致玉米油)。最終進入實驗的仔鼠除低劑量組15只外，其余均為17只。

1.2 血清睪酮檢測

取上述各組雄性仔鼠，股動脈取血2 ml，4 000 r/min離心15 min，吸取上清液，避免溶血，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用酶免疫發(fā)光分析競爭法(Unicel Dxi800睪酮測定試劑盒，美國Beckman Coulter公司)測血清睪酮的含量。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 仔鼠整體檢查

麻醉后稱量雄鼠體重，量取肛生殖器距離(anogenital distance，AGD)，股動脈取血，處死動物。解剖后取出睪丸。左側睪丸濾紙吸去血液，電子天平稱重，做好記錄。右側睪丸取出后立即轉入液氮中，隨后凍存于-80℃冰箱，供以后測量基因使用。

1.4 睪丸形態(tài)學觀察

1.4.1 HE染色標本制備及觀察 沿左側睪丸最大橫斷面切開，置于4℃預冷的Bouin液中固定18～24 h，取材，經(jīng)常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)制片，HE染色，中性樹膠封固。光鏡下觀察睪丸的組織結構。

1.4.2 電鏡標本制備及觀察 每組隨機選擇2例新鮮睪丸標本，冰上切成小塊，約1 mm×1 mm×1 mm大小，迅速置于2.5%戊二醛4℃固定1 h，鋨酸后固定，常規(guī)PBS漂洗，丙酮梯度脫水，Epon812包埋，半薄切片定位后，RMC-XL超薄切片機切片，鉛鈾雙重染色，H-7500型透射電鏡下觀察超微結構改變。

1.5 IGF-Ⅰ 基因Real Time PCR

取-80℃冰凍保存的睪丸組織100 mg加1 mol/L Trizol抽提總RNA。取M-MuLV (Fermentas公司)逆轉錄合成cDNA(20 μl)。IGF-Ⅰ、Rps16(內參照)基因擴增引物由美國洛克菲勒大學人口委員會葛仁山教授設計，Invitrogen公司上海辦事處合成。Real time PCR反應液(50 μl)配置：采用寶生物工程(大連)有限公司PCR試劑，其中SYBRpremixExTaqTM(2×)25 μl、IGF-Ⅰ 基因、Rps16內參照上下游引物各1 μl、ROXRefereneeDye(50×) 1 μl、DNA模版4 μl、dH2O(滅菌蒸餾水) 18 μl。PCR引物序列見表1。每個樣本都做3管擴增，結果取平均值。反應條件：95℃10 s、95℃5 s、60℃30 s，共40個循環(huán)。儀器自動給出每個標本的Ct值。數(shù)據(jù)處理用基因的相對定量法。最終結果以處理組基因的平均相對含量，即2-(平均△△Ct)表示(表1)。

Tab. 1 The primer of rat IGF-Ⅰ, Rps16

1.6 StAR蛋白免疫組織化學染色 (Envision二步法)

睪丸組織石蠟切片，按Envision二步法說明書進行染色。StAR為兔多抗，(稀釋至1∶300)，購自Santa Cruz Biotechnology,Inc.公司。兔二抗購于北京中杉金橋生物試劑有限公司。以0.01 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)代替一抗進行陰性對照。結果判定：StAR蛋白均定位于Leydig細胞的胞漿，胞漿內見棕黃色顆粒為陽性表達。每張切片隨機選擇4個高倍鏡下睪丸間質視野(×200)，應用image-pro plus6.0圖像分析軟件測定陽性部位的平均吸光度(mean optical density, MOD)，用以代表陽性部位的蛋白表達水平，計算10個MOD值的平均值作為該片的MOD值。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 血清睪酮水平

中、高劑量組血清睪酮水平分別為(4.14±1.82)、(3.83±1.80)nmol/L均明顯低于正常組(6.65±1.96)和低劑量組(6.56±2.06，P<0.01)。中、高劑量組之間無顯著差異(P>0.05)；低劑量組血清T與正常組比較無明顯變化。

2.2 雄鼠整體檢查

與正常組相比，低劑量組睪丸重量增加(P<0.05)；中劑量組睪丸重量無明顯變化；高劑量組睪丸重量明顯下降，并分別與其它3組比較有顯著性差異(P<0.01)。與正常組相比，低劑量組、中劑量組體重有升高的趨勢(P=0.07,P=0.22)；高劑量組體重明顯降低, 并分別與其它3組比較有顯著性差異(P<0.01)。與正常組相比，低劑量組肛門生殖器距離(AGD)有增加趨勢(P=0.39)；高劑量組、中劑量組AGD下降(P<0.05，P<0.01)，并與低劑量組比較有顯著性差異(P<0.05，P<0.01，表2)。

GroupnTestis weight(g) Anogenital distance(mm) Body weight(g) NC170.199±0.00119.50±0.5838.89±3.82LD150.249±0.060*20.13±0.72△42.25±6.42MD170.224±0.02017.94±3.02*#41.06±3.54HD170.183±0.030**##△△16.05±2.92**##28.0±7.38**##△△

DEHP: Diethylhexylphthalate; NC: Normal control; LD: Low dose; MD: Middle dose; HD: High dose

*P<0.05,**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsLD group;△P<0.05,△△P<0.01vsMD group

2.3 雄鼠睪丸形態(tài)學觀察

2.3.1 大鼠睪丸HE染色光鏡觀察 正常大鼠睪丸曲細精管呈圓形或橢圓形，曲細精管主要由各級生精細胞構成，生精細胞排列規(guī)則，曲細精管之間聚集少量Leydig細胞(圖1A，圖1見彩圖頁Ⅱ)。低劑量組睪丸Leydig細胞明顯增生、聚集成簇，曲細精管擴大，管腔內生精細胞層次增多，次級精母細胞數(shù)目增多(圖1B)。中、高劑量組Leydig細胞灶區(qū)輕度增生，曲細精管擴大、大小不一、形狀不規(guī)則。高劑量組曲細精管內生精上皮層次減少、細胞稀疏、排列紊亂，生精上皮脫落至管腔內，部分生精上皮出現(xiàn)核固縮(圖1C，1D)。

2.3.2 睪丸Leydig細胞電鏡觀察 正常組大鼠睪丸Leydig細胞(圖2A，圖2見彩圖頁Ⅱ)呈多角形或橢圓形，散在分布，位于小血管和成纖維細胞旁，胞質稀疏，核大而圓，胞核明顯，呈圓形，染色質位于核膜周邊，胞質脂滴較多。與正常組比較，各用藥組Leydig細胞(圖2B,2C,2D)變?yōu)榧氶L梭形，細胞核呈梭形，脂質顆粒少，線粒體、內質網(wǎng)減少。

2.4 睪丸IGF-Ⅰ基因mRNA 表達

與正常組比較，低劑量組睪丸IGF-ⅠmRNA表達升高(P<0.05)；中、高劑量組呈升高趨勢(表3)。

Tab. 3 Expression of IGF-Ⅰ mRNA in testis of pup after lactating exposure to ±s)

DEHP: Diethylhexylphthalate; NC: Normal control; LD: Low dose; MD: Middle dose; HD: High dose

*P<0.05vsNC group

2.5 睪丸Leydig細胞StAR蛋白表達

與正常組StAR表達(0.41±0.06)相比，低劑量組StAR表達(0.44±0.09)呈升高趨勢；中、高劑量組(0.36±0.04、0.37±0.04)明顯降低(P<0.05)，中、高劑量組兩組之間無明顯差異(圖3見彩圖頁Ⅱ)。

3 討論

DEHP應用于塑料薄膜，特別是聚氯乙烯(PVC)的生產(chǎn)加工過程中，并且隨著經(jīng)濟和社會的快速發(fā)展，其使用量逐年增加。有報道顯示，接觸鄰苯二甲酸酯類化合物與男性生殖器官的不良發(fā)育有關[3]。動物實驗表明，孕鼠染毒DEHP可引起雄性仔鼠尿道下裂，并且尿道下裂的概率、尿道下裂的程度與DEHP的染毒的濃度呈正相關[4]。Wistar母鼠妊娠期與哺乳期通過灌胃染毒DEHP會對雄性仔鼠產(chǎn)生長久的劑量依賴性的影響，包括睪丸重量降低、睪丸體積縮小、精子密度下降、生精細胞高度降低、曲細精管直徑減小等[5]。本課題組既往報道，妊娠期子宮內暴露不同劑量的DEHP可致睪酮分泌紊亂并且不同的劑量效應不同[6-8]。

Leydig細胞是男性生殖系統(tǒng)中特有的合成和分泌雄激素的細胞，是男性體內睪酮的主要來源。睪丸內有兩代Leydig細胞，依次在胚胎期和青春期發(fā)育起來。第一代睪丸Leydig細胞稱為胎兒型Leydig細胞(fetal Leydig cell, FLC)，由胚胎干細胞分化而來。第二代睪丸Leydig細胞稱為成年型Leydig細胞(adult Leydig cell, ALC)，出生后11天由睪丸Leydig干細胞(stem Leydig cell，SLC)分化成子Leydig細胞(progenitor Leydig cell，PLC)，其數(shù)目在仔鼠生后21天達到高峰。哺乳期(仔鼠出生后21 d內)屬于Leydig成年干細胞分化階段，是生殖管道發(fā)育和性腺分化的活躍期，人類和嚙齒類對激素反應比其它時間更為敏感[9]，而且，從哺乳期開始嬰兒將不同程度地使用含有增塑劑的奶瓶、嬰兒玩具、洗澡盆、輸液等，意味著相對妊娠期，他們將有更多機會接觸DEHP，因此，哺乳期DEHP染毒對男性生殖的影響的研究，具有更大的社會意義。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，哺乳期母鼠染毒高劑量的DEHP不僅可引起雄性仔鼠血清T下降，AGD縮短，還可致體重、睪丸重量下降；中劑量DEHP可引起血清T下降和AGD縮短，但睪丸重量和仔鼠體量無明顯變化，與Akingbemi BT[10]等研究結果一致；而低劑量組血清T無明顯變化，仔鼠睪丸重量增加，仔鼠體重和AGD有升高趨勢。這說明低劑量和中、高劑量染毒哺乳期母鼠對雄性大鼠生殖和發(fā)育的影響不同，低劑量DEHP可能促進雄性仔鼠的早熟，而中、高劑量DEHP引起T水平下降，與性功能下降和不育癥有關。也提示我們，血清T、AGD相對體重和睪丸重量是評價DEHP的毒性作用更加敏感的指標。本實驗中，染毒中、高劑量DEHP引起仔鼠AGD縮短，血清T下降，兩者的變化一致。AGD縮短說明DEHP可能有抗雄激素作用或可以影響Leydig細胞的類固醇合成[10]。

本實驗觀察到低劑量組Leydig細胞明顯增生，Leydig細胞呈細長梭形，細胞核也呈梭形，脂質顆粒減少，線粒體、內質網(wǎng)減少；曲細精管內生精細胞層次增多。我們認為本實驗觀察到的低劑量組Leydig細胞的增生和生精細胞的增生可能是致仔鼠睪丸重量增加的主要原因， 但由于DEHP致Leydig細胞結構受損，所以T并沒有相應的增加。中、高劑量組Leydig細胞灶區(qū)輕度增生，高劑量組還可見到生精細胞凋亡、壞死和喪失現(xiàn)象，這可能是高劑量組最終導致睪丸萎縮的主要原因之一，而睪丸Leydig細胞的形態(tài)學改變引起相應的功能下降，可能是導致血清T減少的直接原因。O’shaug-hressy等[11]在雄激素受體缺失小鼠中觀察到FLC功能正常，但ALC分化成熟受到阻礙，該研究結果表明雄激素為ALC前體分化所必需，睪酮合成降低又會反過來阻礙ALC的分化成熟從而使睪酮水平進一步下降，形成一個惡性循環(huán)。

胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)是一類具有廣泛生物學功能的細胞因子，可促進細胞增殖、分化，抑制凋亡[12]。Leydig細胞表達IGF-Ⅰ 及其受體，Wang等[13]研究證明IGF-Ⅰ 是Leydig細胞前體細胞的促有絲分裂因子，IGF-Ⅰ 可促進Leydig細胞的增殖和分化。本研究發(fā)現(xiàn)低劑量組Leydig細胞明顯增生， IGF-Ⅰ mRNA表達明顯升高，中、高劑量組Leydig細胞輕度增生，IGF-Ⅰ mRNA表達呈升高趨勢，IGF-Ⅰ mRNA的表達與Leydig細胞增生呈一致性，說明DEHP可以上調Leydig細胞IGF-Ⅰ 基因mRNA的表達，從而刺激Leydig細胞的增殖和分化。

已知雄性激素在睪丸Leydig細胞內的生物合成都起始于膽固醇到孕烯醇酮的轉化，這一反應是由位于線粒體內膜的細胞色素P450支鏈裂解酶(P450scc)催化的，長期以來，人們認為對P450scc的調控為限速步驟。然而其后的許多實驗表明真正的限速步驟是除了P450scc外，還有膽固醇轉運到線粒體內膜。StAR在膽固醇從線粒體外膜轉運至內膜的跨膜轉運中起著重要調節(jié)作用。睪丸間質細胞合成T過程中的關鍵酶表達降低的直接后果必然引起單個細胞合成T的能力明顯降低，從而影響T的合成和分泌。以往研究證明，StAR mRNA表達水平的下降與很多睪丸毒物引起血清睪酮合成下降相關[14]。 本實驗中哺乳期母鼠染毒DEHP，低劑量組仔鼠Leydig細胞StAR蛋白表達有升高趨勢；但中、高劑量組表達明顯下降(P<0.05)，提示中、高劑量的DEHP可能通過降低Leydig細胞StAR的蛋白表達，干擾膽固醇的轉運，從而使睪酮的合成下降。

綜上所述，哺乳期母鼠染毒不同劑量的DEHP對雄性仔鼠的效應不同，低劑量的DEHP可能促進雄性仔鼠早熟；中、高劑量的DEHP可引起雄性仔鼠血清睪酮水平降低，其機制可能與DEHP抑制 子Leydig細胞StAR蛋白的表達以及損傷子Leydig細胞的結構有關。

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The effects of DEHP on morphology and function of progenitor Leydig cell in rat

CHEN Han-bin1, MA Jun1, LI Hui-min1, NIU San-qiang2, CHEN Xian-wu1, CHEN Guo-rong4,CHEN San-mei3, WANG Rong-rong4

(1. Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035; 2. Department of Pathology, the Third Hospital of Datong, Shanxi Province， Datong 037008； 3. Medical College, Shaoxing University, Shaoxing 312000； 4. Department of Pathology, the First Affiliated Hospital, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325015，China)

Objective: To investigate the effects and mechanisms of diethylhexylphthalate(DEHP) on morphology and function of progenitor Leydig cells (PLC) in rats. Methods: Twenty pregnant SD rats were randomly divided into 4 groups (n=5): normal control group, DEHP low dose group , middle dose group, and high dose group, which were treated from postnatal day (PND) 1 to PND 21 of the pubs with DEHP at the doses of 0, 10, 100, 750 mg/(kg·d) in 0.5 ml of corn oil by gavage respectively. At the end of the treatment, the male pups were killed and blood samples were collected for determination of serum testosterone concentration by chemiluminescence method. The body weight, testis weight and anogenital distance (AGD) were measured. The morphology of PLC was observed by light and transmission electron microscopy. The protein expression of steroidogenic acute regulatory protein(StAR) in PLC was determined by immunohistochemistry. The mRNA expression of insulin-like growth factor-Ⅰ( IGF-Ⅰ)in the testis was assayed by real-time PCR. Results: Compared with normal control group, the serum testosterone and AGD of male pubs from the middle and high dose groups were declined significantly (P<0.01), the testis weight and body weight from high dose group were decreased significantly (P<0.01), while the testis weight increased in the low dose group (P<0.05). Under light microscope, PLC showed hyperplasia and cluster aggregation in the low dose group and focal hyperplasia in the middle and high dose group. The spermatogenic cells in seminiferous tubules showed decrease, apoptosis and unfix in the high dose group. Under transmission electron microscope, the PLC showed decreased lipid droplets, smooth endoplasmic reticulum and mitochondriae in the treated group. The mRNA expression of IGF-Ⅰincreased in the low dose group, and the protein expression of StAR decreased in the middle and high dose group. Conclusion: Lactating exposure to DEHP may interfere with the synthesis of testosterone of PLC in male pubs, the decrease of StAR and the damage of PLC may be involved in it.

diethylhexylphthalate; Leydig cell; testosterone; insulin-like growth factor-Ⅰ； steroidogenic acute regulatory protein； pubs

國家自然科學基金資助項目(30671736)；浙江省自然科學基金資助項目(LY12H26002)；浙江省公益性技術應用研究計劃項目(2011C23123)

2014-11-04 【修回日期】2015-02-25

R363

A

1000-6834(2015)02-97-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.001

△【通訊作者】Tel: 0577-55579792, 0575-88345685； E-mail: hulangwang307@163.com, csm498@163.com