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        冠狀動(dòng)脈疾病患者CD36基因多態(tài)性與心血管相關(guān)因素的關(guān)系

        2015-06-09 08:08:24趙寧張慧杰王建昌
        疑難病雜志 2015年5期
        關(guān)鍵詞:研究

        趙寧,張慧杰,王建昌

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        論著·臨床

        冠狀動(dòng)脈疾病患者CD36基因多態(tài)性與心血管相關(guān)因素的關(guān)系

        趙寧,張慧杰,王建昌

        目的 研究CD36基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)危險(xiǎn)因素之間的關(guān)系。方法 選擇解放軍空軍總醫(yī)院<60歲90例CAD患者,抽取患者空腹靜脈血檢測(cè)血紅蛋白(Hb)、白細(xì)胞(WBC)、單核細(xì)胞(M)、嗜堿性粒細(xì)胞(B)、空腹血糖(FPG)、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及三酰甘油(TG)、載脂蛋白A1(ApoA1)、載脂蛋白B(ApoB)和脂蛋白(α)[(Lp(α)]。同時(shí)記錄患者的體質(zhì)量、收縮壓、舒張壓,并計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)和平均動(dòng)脈壓。利用變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)分析包含內(nèi)含子片段的外顯子4和5的擴(kuò)增產(chǎn)物,分析基因型和各變量之間的相關(guān)性。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)CD36 基因有兩種多態(tài)性變異:IVS3-6 T/C (rs3173798)和IVS4-10 G/A(rs3211892)。其中IVS3-6 T/C多態(tài)性的C等位基因與肥胖、糖尿病、血清Lp(α)濃度降低以及心肌梗死發(fā)病年齡提前有關(guān)。而IVS4-10 G/A多態(tài)性的A等位基因與心肌梗死發(fā)病較晚和白細(xì)胞數(shù)量增加有關(guān)。結(jié)論 CD36的IVS3-6 C等位基因與心血管疾病的危險(xiǎn)因素(如hs-CRP、BMI和2型糖尿病)有關(guān),與心肌梗死發(fā)病年齡提前有關(guān);而IVS4-10 A等位基因與心肌梗死發(fā)病年齡推遲有關(guān)。CD36 的多態(tài)性在CAD中的作用仍需進(jìn)一步研究。

        基因多肽性CD36;冠心?。恍募」K?/p>

        隨著生活水平的提高,冠心病的發(fā)病年齡已經(jīng)有低齡化的趨勢(shì)。近年來(lái)遺傳因素在冠心病發(fā)病機(jī)制中的地位越來(lái)越引起人們的重視。CD36是一種位于多種細(xì)胞(血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞、造血干細(xì)胞等)表面的B型清除受體。其介導(dǎo)的主要功能涉及到脂質(zhì)利用、胰島素抵抗、炎性反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化和血栓的形成,在動(dòng)脈粥樣硬化中起重要作用,在白種人中的研究發(fā)現(xiàn)CD36 基因多態(tài)性與心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)具有明顯的相關(guān)性,特別是游離于循環(huán)系統(tǒng)的單核細(xì)胞CD36 mRNA的表達(dá)可能是發(fā)生冠狀動(dòng)脈疾病高風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)標(biāo)志,但目前還沒(méi)有直接證據(jù)證明CD36基因突變能降低或增加高血脂、動(dòng)脈硬化及其并發(fā)癥(血管功能障礙、高血壓、缺血性心臟病)的風(fēng)險(xiǎn)[1~3],而且CD36基因是否在漢族人群中存在多態(tài)性目前還沒(méi)有報(bào)道,為了解決這些問(wèn)題,我們觀察了其基因多態(tài)性中CD36 基因編碼氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和脂酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域區(qū)域的序列變化與冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)已知的危險(xiǎn)因素之間的關(guān)系,為冠心病的早期診斷、危險(xiǎn)人群的篩選和基因治療提供依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料 收集2007年1月—2010年12月在我院就診的60歲以下CAD患者90例。納入標(biāo)準(zhǔn):臨床狀況穩(wěn)定,無(wú)急性冠狀動(dòng)脈癥狀,在近期(1年內(nèi))沒(méi)有進(jìn)行血管再通術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):有先天性血液動(dòng)力學(xué)紊亂或獲得性心臟瓣膜病,有癥狀心力衰竭 (NYHA>1級(jí)), 腎衰竭(肌酐>265 μmol/L),1型糖尿病, 甲狀腺功能不全, 惡性腫瘤。CAD診斷主要通過(guò)冠狀動(dòng)脈血管造影,符合下列特征之一即可確定診斷:(1)左冠狀動(dòng)脈狹窄程度≥40%;(2)心外膜下3個(gè)主要側(cè)支之一狹窄程度≥50%;(3)動(dòng)脈分支狹窄程度≥70%。該試驗(yàn)完全遵循赫爾辛基宣言并獲得我院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn),試驗(yàn)前所有患者均簽署知情同意書。

        1.2 觀察指標(biāo)和方法 抽取患者空腹靜脈血檢測(cè)血紅蛋白(Hb)、白細(xì)胞(WBC)、單核細(xì)胞(M)、嗜堿性粒細(xì)胞(B)、空腹血糖(FPG)、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及三酰甘油(TG)、載脂蛋白A1(ApoA1)、載脂蛋白B(ApoB)和脂蛋白(α)[(Lp(α)]。同時(shí)記錄患者的體質(zhì)量、收縮壓、舒張壓,并計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)和平均動(dòng)脈壓。

        1.3 基因檢測(cè) 空腹?fàn)顟B(tài)下取肘部靜脈血3 ml促凝離心后取上清液,-80℃保存。分離血細(xì)胞目標(biāo)基因組DNA[4],具體步驟參考AxyPrep血液全基因組DNA小量提取試劑盒說(shuō)明書;使用變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)研究包含內(nèi)含子片段的外顯子4和5的擴(kuò)增產(chǎn)物[5]。通過(guò)DHPLC 檢測(cè)PCR產(chǎn)物的變化,并使用Applied Biosystems公司的染料終止子循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試劑盒對(duì)其進(jìn)行雙向測(cè)序。使用373A DNA片段分析儀進(jìn)行半自動(dòng)序列分析(Applied Biosystems, Foster City, CA)。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,根據(jù)CD36 基因型將病例分組,計(jì)量資料使用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)和t檢驗(yàn),使用精確檢驗(yàn)評(píng)估Hardy-Weinberg平衡下的基因型分布的一致性。計(jì)算比值比 (OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI),分析基因型和定性變量之間是否有顯著的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 CD36基因多態(tài)性 DHPLC檢測(cè)到的變異主要包括內(nèi)含子中2個(gè)單核苷酸替換(多態(tài)性),即IVS3-6 T/C (rs3173798)和IVS4-10 G/A (rs3211892),外顯子中并未發(fā)現(xiàn)序列改變。2種序列變異在Hardy-Weinberg平衡下基因型分布一致(P=1)。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)選取的樣本基因型可以穩(wěn)定遺傳,可以代表整個(gè)群體。見(jiàn)表1。

        表1 患者CD36基因多態(tài)性

        2.2 不同CD36 基因型患者的臨床參數(shù)比較 IVS3-6 TC雜合子患者較TT純合子患者體質(zhì)量指數(shù)稍高,肥胖明顯(BMI≥30 kg/m2) (OR=2.93,95%CI 0.98~8.76,P=0.07)。糖尿病發(fā)病率高(OR=6.09,95%CI 1.66~22.32,P=0.01),既往心肌梗死患者中,TC基因型患者的心肌梗死發(fā)病年齡提前(OR=1.346,95%CI 0.528~3.429,P=0.057)。相反,IVS4-10 GA雜合子患者比野生型GG純合子心肌梗死首次發(fā)病年齡要晚(OR=3.453,95%CI1.532~7.786,P=0.003)。見(jiàn)表2。

        2.3 不同CD36基因型患者的血細(xì)胞數(shù)和生化數(shù)據(jù)比較 IVS3-6 TC 雜合子白細(xì)胞中嗜堿性粒細(xì)胞的比例比TT患者低(OR=5.21,95%CI 2.464~11.3,P=0.03)。IVS3-6 TC基因型hs-CRP較TT基因型高(OR=2.93,95%CI 1.8~9.6,P=0.02),Lp(a)低(OR=5.039,95%CI 2.173~11.883,P=0.01)。IVS4-10 GA基因型白細(xì)胞數(shù)更高(OR=2.17, 95%CI 1.05~4.57,P=0.03)。見(jiàn)表3。

        3 討 論

        隨著人們生活水平提高、人口老齡化加重及城市化發(fā)展進(jìn)程加快,冠心病及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病率在逐年提高,已經(jīng)成為影響健康的首要疾病。近年來(lái),對(duì)于冠心病發(fā)生相關(guān)基因水平的研究已越來(lái)越受到人們的重視[6],并發(fā)現(xiàn)了大量與心血管疾病發(fā)生相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotide polymorphism,SNP),這些方法為冠心病診斷提供方便可行的分子標(biāo)記,以早期預(yù)測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)人群并指導(dǎo)預(yù)防和治療[7~9]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)中國(guó)人CD36內(nèi)含子片段中有IVS3-6 T/C (rs3173798)和IVS4-10 G/A (rs3211892)2種多態(tài)性[10],2種變異均與心臟疾病的發(fā)生有關(guān)。IVS3-6 TC 和IVS4-10 GA基因型與心肌梗死發(fā)病年齡之間也存在相關(guān)趨勢(shì)(P=0.057)或顯著相關(guān)性(P=0.003),但相關(guān)性相反:TC雜合子首次發(fā)病的年齡更小,而GA雜合子首次發(fā)病年齡更大。此外IVS3-6 TC雜合子與3種心血管危險(xiǎn)因素有關(guān),分別為hs-CRP、肥胖發(fā)病率、糖尿病史[11],其中IVS3-6 TC 雜合子比野生型純合子患者更易患2型糖尿病,但各組間空腹血糖并無(wú)差異,分析原因可能是由于多數(shù)TC雜合子的糖尿病患者口服降糖藥或使用胰島素所致。而IVS4-10 GA雜合子患者中2型糖尿病的發(fā)病率與野生型沒(méi)有差別。在國(guó)外同類研究中Leprêtre等[11]指出白種人CD36的IVS4-10 G/A變異與脂類代謝水平之間有相關(guān)性,Love-Gregory等[12]研究了有高血壓的非裔美國(guó)人中發(fā)現(xiàn)的所有的CD36 序列變異(內(nèi)含子3中的rs3211850;內(nèi)含子9中的rs3173804;外顯子10中的無(wú)義突變r(jià)s3211938;3′ UTR中的rs7755, rs13246513和rs13230419)均與體格參數(shù)(BMI>30 kg/m2,腰圍>100 cm)相關(guān),白種人rs1527479 CD36 啟動(dòng)子多態(tài)性與胰島素抗性和2型糖尿病有關(guān)。這些研究和我們的結(jié)論基本是一致的。最新的研究還提出在非裔美國(guó)人中CD36 多態(tài)性可能會(huì)導(dǎo)致血漿HDL-C濃度增加[13],在有文獻(xiàn)報(bào)道成人雙生子登記隊(duì)列中CD36啟動(dòng)子多態(tài)性rs2151916與LDL-C水平有關(guān):次要等位基因純合子患者 LDL-C水平更低[14]。內(nèi)含子11中的1種多態(tài)性(rs1527483)和3′UTR 區(qū)(外顯子14和15)的2種多態(tài)性(rs3840546, rs1049673)與血漿游離脂肪酸代謝有關(guān)。但在我們的試驗(yàn)觀察到2種基因型間血脂濃度沒(méi)有顯著差異,這主要是因?yàn)槲覀冊(cè)囼?yàn)中幾乎所有病例均服用了他汀類藥物,影響試驗(yàn)結(jié)果[15]。但另一方面我們還發(fā)現(xiàn)IVS3-6 TC基因型與Lp(a)降低有關(guān), 這可能是動(dòng)脈粥樣硬化疾病(如冠心病和中風(fēng))的危險(xiǎn)因素。非洲人的外顯子10純和無(wú)義突變(rs3211938)與血紅蛋白水平提高有關(guān)。在我們的試驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)不同組間血紅蛋白水平存在差異,卻發(fā)現(xiàn)IVS4-10 GA 雜合子患者的白細(xì)胞數(shù)量更多。目前尚沒(méi)有這種相關(guān)性報(bào)道的出現(xiàn),其臨床意義還有待進(jìn)一步研究。

        表2 不同CD36 基因型患者的臨床資料比較

        表3 不同CD36基因型的生化指標(biāo)比較

        總之,CD36的IVS3-6C等位基因的多態(tài)性與心血管疾病的危險(xiǎn)因素(如hs-CRP、BMI和2型糖尿病)有關(guān)。IVS3-6 C等位基因與心肌梗死發(fā)病年齡提前有關(guān),而IVS4-10 A等位基因與心肌梗死發(fā)病年齡推遲有關(guān)?;虻倪@種突變對(duì)冠狀動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)以及臨床病程的功能性意義,還需要進(jìn)一步的評(píng)估。

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        3 Goyenechea E,Collins LJ,Parra D,et al.CD36 gene promoter polymorphisms are associated with low density Lipoprotein-Cholesterol in normal twins and after a Low-Calorie Diet in obese subjects[J].Twin Research and Human Genetics,2008,11(6):621-628.

        4 Lahiri DK,Schnabel B.DNA isolation by a rapid method from human blood samples:effects of MgCl2,EDTA,storage time,and temperature on DNA yield and quality[J].Biochem Genet,2003,31(4):321-328.

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        7 Love-Gregory L,Sherva R,Sun LW,et al.Variants in the CD36 gene associate with the metabolic syndrome and high-density lipoprotein cholesterol[J].Hum Mol Genet,2008,17(11):1695-1704.

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        12 Love-Gregory L,Sherva R,Sun LW,et al.Variants in the CD36 gene associate with the metabolic syndrome and high-density lipoprotein cholesterol[J].Hum Mol Genet,2008,17(11):1695-1704.

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        撰寫醫(yī)學(xué)論文主體部分的要求

        1 前言 概述研究的背景、目的、研究思路、理論依據(jù)、研究方法、預(yù)期結(jié)果和意義等。僅需提供與研究主題緊密相關(guān)的參考文獻(xiàn),切忌寫成文獻(xiàn)綜述。不要涉及本研究中的數(shù)據(jù)或結(jié)論。一般以200~300個(gè)漢字為宜,占全文字?jǐn)?shù)的5%左右。

        2 方法 描述研究對(duì)象(人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物,包括對(duì)照組)的選擇及其基本情況,以及研究所采用的方法(包括分組方法)。實(shí)驗(yàn)研究的論文常寫成“材料與方法”,臨床研究論文常寫成“資料與方法”。臨床試驗(yàn)研究還應(yīng)說(shuō)明試驗(yàn)程序是否經(jīng)所在單位或地區(qū)倫理學(xué)相關(guān)機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn),研究對(duì)象是否知情同意并簽署知情同意書。

        2.1 觀察對(duì)象: 觀察對(duì)象為患者,需注明病例和對(duì)照者來(lái)源、選擇標(biāo)準(zhǔn)、一般情況、觀察指標(biāo)和療效判斷標(biāo)準(zhǔn)等。研究對(duì)象為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,需注明動(dòng)物的名稱、種系、等級(jí)、數(shù)量、來(lái)源、性別、年齡、體重、飼養(yǎng)條件和健康狀況等。

        2.2 研究方法: 詳述新創(chuàng)的方法及改良方法的改進(jìn)之處,以備他人重復(fù)。采用他人方法,應(yīng)以引用文獻(xiàn)的方式給出方法的出處,無(wú)須詳細(xì)描述。

        2.3 藥品與試劑: 藥品及化學(xué)試劑使用通用名稱,并注明劑量、單位、純度、批號(hào)、生產(chǎn)單位、生產(chǎn)時(shí)間及給藥途徑。

        2.4 儀器、設(shè)備: 應(yīng)注明名稱、型號(hào)、規(guī)格、生產(chǎn)單位、精密度或誤差范圍。無(wú)須描述工作原理。

        2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 描述統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及其選擇依據(jù), 并說(shuō)明所使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。

        3 結(jié)果 “結(jié)果”是指實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)、觀察記錄,經(jīng)過(guò)綜合分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的結(jié)果,而不是原始數(shù)據(jù),更不是原始記錄。按邏輯順序在正文的文字、表格和圖中描述所獲得的結(jié)果。結(jié)果的敘述應(yīng)實(shí)事求是,簡(jiǎn)潔明了,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,層次清楚,邏輯嚴(yán)謹(jǐn),不應(yīng)與討論內(nèi)容相混淆。應(yīng)著重總結(jié)重要的研究結(jié)果。以數(shù)據(jù)反映結(jié)果時(shí),應(yīng)注意不能只描述導(dǎo)數(shù)(如百分?jǐn)?shù)),還應(yīng)同時(shí)給出據(jù)以計(jì)算導(dǎo)數(shù)的絕對(duì)數(shù)。一般應(yīng)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,并給出具體的統(tǒng)計(jì)值,例如:t= 2.85,P<0.01。

        4 討論 “討論”是對(duì)研究結(jié)果的科學(xué)解釋與評(píng)價(jià),是研究所形成的科學(xué)理論。著重討論研究結(jié)果的創(chuàng)新之處及從中導(dǎo)出的結(jié)論,包括理論意義、實(shí)際應(yīng)用價(jià)值、局限性,及其對(duì)進(jìn)一步研究的啟示。如果不能導(dǎo)出結(jié)論,也可通過(guò)討論,提出建議、設(shè)想、改進(jìn)意見(jiàn)或待解決的問(wèn)題等。應(yīng)將本研究結(jié)果與其他有關(guān)的研究相比較,并將本研究結(jié)論與目的聯(lián)系起來(lái)討論,并列出相關(guān)參考文獻(xiàn)。不必重述已在前言和結(jié)果部分詳述過(guò)的數(shù)據(jù)或資料。不應(yīng)列入圖或表。

        Polymorphism of CD36 gene and cardiovascular risk factors in patients with coronary artery disease

        ZHAONing,ZHANGHuijie,WANGJianchang.DepartmentofInternalMedicine,AirForceGeneralHospital,PLA,Beijing100142,China

        Correspondingauthor:WANGJianchang,E-mail:1084292231@qq.com

        Objective To investigate the relationship between CD36 gene polymorphism and coronary artery disease (CAD)’s risk factors.Methods 90 CAD patients aged <60 were collected, hemoglobin (Hb), white blood cell (WBC), mononuclear cells (M), basophils (B),fasting blood glucose (FPG), high sensitive C reactive protein (hs-CRP), total cholesterol (TC), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and triglyceride(TG),apolipoprotein A1(ApoA1), ApoB and lipoprotein (α) [Lp (α)]were detected. At the same time recording quality, systolic pressure, diastolic pressure volume of patients, and calculated the body mass index and mean arterial pressure. Using denaturing high performance liquid chromatography to analyze intron fragment containing exon 4 and exon 5’s amplicon, analyzed the correlation between the genotype and the variables.Results There are two kinds of polymorphism of CD36 gene: IVS3-6 T/C (rs3173798) and IVS4-10 G/A (rs3211892).The IVS3-6 T/C polymorphism of C alleles was correlated with obesity, diabetes, serum Lp (a) concentration decreases and the early age onset of myocardial infarction. While the number of IVS4-10 G/A polymorphism of A alleles was related to late myocardial infarction and increase of white blood cell.Conclusion CD36’s IVS3-6 C allele was correlated with the risk factors of cardiovascular disease (such as hs-CRP, BMI and type 2 diabetes mellitus), and correlated with early age onset of myocardial infarction; while the IVS4-10 A allele was correlated with late age onset of myocardial infarction. The role of CD36 polymorphism in CAD is still needs further research.

        Gene polymorphyism,CD36;Coronary heart disease; Myocardial infarction

        100142 北京,解放軍空軍總醫(yī)院心臟中心

        王建昌,E-mail:1084292231@qq.com

        10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.05.004

        2014-07-09)

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