毛之華等

摘 要 傅里葉變換紅外光譜顯微成像（FTIRI）可同時獲得樣品的紅外光譜和形貌信息，其與化學(xué)計量學(xué)方法結(jié)合，可實現(xiàn)生物組織中主成分含量及分布的定量研究。本研究采用FTIRI技術(shù)結(jié)合主成分分析（PCA）以及Fisher判別算法對正常和病變的關(guān)節(jié)軟骨進行鑒別分析。對關(guān)節(jié)軟骨切片進行實現(xiàn)FTIR掃描及光譜分析，再利用SPSS軟件對軟骨的光譜（矩陣）進行主成分分析，根據(jù)主成分得分矩陣構(gòu)造分類函數(shù)，結(jié)合Fisher判別算法對樣本進行分類識別。正常和病變的關(guān)節(jié)軟骨樣品識別準確率高達95.7%（初始案例）和94.3%（交互驗證案例）。本方法可準確有效地辨別關(guān)節(jié)軟骨是否發(fā)生病變，為監(jiān)測骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和修復(fù)提供參考。

關(guān)鍵詞 關(guān)節(jié)軟骨，傅里葉變換紅外光譜，主成分分析，F(xiàn)isher判別

1 引 言

關(guān)節(jié)軟骨覆蓋骨關(guān)節(jié)表面，能有效減少關(guān)節(jié)間的摩擦、承受機械壓力和緩沖震動，在生命運動中發(fā)揮著重要作用[1]。關(guān)節(jié)軟骨由軟骨基質(zhì)和軟骨細胞組成。軟骨基質(zhì)的主要成分為II型膠原蛋白（Collagen）、蛋白多糖（PG，主要是硫酸軟骨素CS6）、水和少量的無機離子等[2]。膠原蛋白構(gòu)成軟骨基質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)的基本架構(gòu)，并有效固定蛋白多糖[3]。蛋白多糖則能保證關(guān)節(jié)軟骨的彈性和耐壓性[4]。軟骨基質(zhì)外表面到潮線之間呈板層狀結(jié)構(gòu)，由連續(xù)的3層構(gòu)成：表層區(qū)（SZ）、過渡區(qū)（TZ）和深層區(qū)（DZ）[5]。在3個分區(qū)內(nèi)，基質(zhì)主成分的含量及空間分布各不相同[6]。

年齡增長、外傷、負重等因素都可能改變軟骨基質(zhì)主成分的含量及空間分布，從而導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)生[7，8]。OA早期主要表現(xiàn)為軟骨基質(zhì)主成分濃度以及軟骨細胞形態(tài)和活性的改變，無明顯的組織損傷出現(xiàn)[9]。這對OA的早期診斷造成極大困難。目前關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨的研究方法主要有：陽離子染色劑結(jié)合顯微分光光度測量法[10]、熒光探針結(jié)合競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法[11]、生化分析法、磁共振成像（MRI）技術(shù)[12]等。但以上方法對于OA期間主成分微量變化的監(jiān)測仍顯不足。

傅里葉紅外光譜顯微成像（FTIRI）可同時實現(xiàn)樣品的紅外光譜采集和紅外圖像掃描。其圖像的每個像素對應(yīng)一個紅外光譜，利用偽彩色表示該像素處的平均吸收率。FTIR圖像形象直觀地描述樣品組分的結(jié)構(gòu)及其特征基團的空間分布和含量變化[13～15]，將空間定位技術(shù)與定量分析能力有機結(jié)合，具有更高的空間分辨率、光譜分辨率及靈敏度。主成分分析（PCA）的宗旨是對復(fù)雜系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)進行降維，將原變量轉(zhuǎn)換成少數(shù)幾個新變量，能夠從光譜數(shù)據(jù)中提取主成分的半定量信息， 使研究的問題簡單化，數(shù)據(jù)特征更明顯，同時排除噪聲影響。它可將光譜矩陣分解為主成分載荷和得分矩陣，其中得分矩陣表示主成分的相對濃度，而載荷矩陣表示主成分的歸一化光譜[16]。Fisher判別是一種借助方差分析建立判別函數(shù)，對數(shù)據(jù)集進行快速分類的分析方法。其基本過程是根據(jù)已知類別的數(shù)據(jù)組構(gòu)造判別函數(shù)，判別系數(shù)的確定原則是類間的協(xié)方差最大且類內(nèi)的協(xié)方差最小。利用判別函數(shù)計算待鑒別樣品的判別得分，通過與閾值比較，判別它的類屬。Fisher判別的優(yōu)勢在于應(yīng)用范圍廣泛，對各類分布及方差沒有限制，能較好地適應(yīng)復(fù)雜對象的鑒別分析[16]。

紅外光譜技術(shù)結(jié)合PCA以及Fisher判別在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有應(yīng)用研究的報道[17，18]。目前， 該方法尚未應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨的相關(guān)研究中。本研究采用FTIRI結(jié)合PCA以及Fisher判別算法，對正常和病變的關(guān)節(jié)軟骨樣本進行鑒別分析。本方法為研究OA的發(fā)生和修復(fù)的實時監(jiān)測提供參考。

2 實驗部分

2.1 實驗儀器

實驗所用成像儀器是 PerkinElmer Spotlight300 FTIRI System （Wellesley， MA）。系統(tǒng)主要分為兩部分：紅外顯微成像系統(tǒng)和傅里葉變換紅外光譜儀。成像系統(tǒng)的探頭由一個液氮冷卻的16陣元MCT（汞鎘碲化合物）焦平面陣列檢測器和一個單點MCT檢測器組成，可獲得樣本的紅外吸收圖像以及可見光圖像。傅里葉變換紅外光譜儀主要是由光源、邁克遜干涉儀、樣品室、檢測器和計算機組成。

2.3 光譜數(shù)據(jù)分析

PCA過程中，首先根據(jù)光譜矩陣計算協(xié)方差矩陣；接著計算矩陣的特征值和特征向量；然后根據(jù)特征值計算方差貢獻率；最后計算主成分得分矩陣，以便進一步的Fisher判別。為了盡量減少研究對象數(shù)據(jù)信息的損失，又能減少變量和簡化問題，選取累計方差貢獻率達85%以上的前幾個因子作為主成分。Fisher判別是通過對已知類屬的樣本變量進行變換（保證類內(nèi)離散度盡可能小，類間離散度盡可能大）構(gòu)建典型判別函數(shù)。根據(jù)判別函數(shù)計算樣本聚類中心的歐氏距離，得到分類函數(shù)。將未知類屬的樣本數(shù)據(jù)代入分類函數(shù)，并根據(jù)結(jié)果將其歸于歐氏距離最小的一類。PCA及Fisher判別采用SPSS 20軟件完成。

3.2 主成分分析

PCA所得前4個主成分的累計貢獻率如表1所示，前兩個主成分的累計貢獻率達到88.138%，能夠表示光譜數(shù)據(jù)矩陣的大部分特征。主成分因子數(shù)的大小會影響Fisher判別模型的訓(xùn)練與預(yù)測結(jié)果，需要進一步優(yōu)化以選擇最佳因子數(shù)，建立Fisher判別模型。在不同因子數(shù)條件下，初始案例和交互驗證案例的識別率不同。當主成分因子數(shù)為2時，初始案例的識別率達95.7%；交叉驗證案例的識別率達94.3%。隨著因子數(shù)的增加，樣本的正確識別率平緩上升；當因子數(shù)為8時，正確識別率穩(wěn)定在100%。綜上，所提取的前兩個主成分能夠表示原光譜矩陣的大部分信息，極大地簡化所需分析的數(shù)據(jù)量， 并且使得Fisher判別模型有較高的識別率和判別效率。

根據(jù)案例編號可知，誤判案例多取自病變樣本的TZ（#42， 43， 46）。個別案例誤判的原因可能是：一方面，手術(shù)誘導(dǎo)后8周的病變樣本中組分含量變化在SZ較明顯，而在其它區(qū)域（如TZ）含量變化較小[23]；另一方面，誤判案例所在區(qū)域內(nèi)的軟骨基質(zhì)中有大小形態(tài)發(fā)生變化的軟骨細胞的分布，相對于軟骨基質(zhì)，軟骨細胞對紅外光有較強的散射效應(yīng)影響了模型對樣本的識別，這也可能導(dǎo)致該模型的錯誤識別。此外，在本實驗建模過程以及近期的一系列病變樣本的研究中發(fā)現(xiàn)，主成分因子為2的情況下，均會得到兩個二元一次函數(shù)，即分類函數(shù)。隨著訓(xùn)練組數(shù)據(jù)量的變化，分類函數(shù)（公式（1）和（2）當中的得分系數(shù)也隨之發(fā)生變化，但總識別率都比較高（接近95%），且初始案例和交叉驗證的判別結(jié)果也十分接近，因此可以判斷本研究建立的判別模型有穩(wěn)定的可靠性。

4 結(jié) 論

利用FTIRI技術(shù)對正常和病變關(guān)節(jié)軟骨樣本進行成像，提取紅外吸收光譜后，采用PCA對數(shù)據(jù)進行降維，再結(jié)合Fisher判別算法構(gòu)建關(guān)節(jié)軟骨的判別模型，以完成對樣本的鑒別。結(jié)果表明，在主成分因子數(shù)為2的條件下，訓(xùn)練組初始案例總識別率為95.7%，交互驗證案例總識別率為94.3%，預(yù)測組樣本全部正確識別。其中，正常樣本全部正確識別，只有個別病變樣本案例出現(xiàn)誤判。本方法能較為準確、可靠地對正常和病變的關(guān)節(jié)軟骨進行鑒別，并為早期OA的研究提供了一種潛在的簡便、快速、可靠的方法。

References

1 Mauck R L， Soltz M A， Wang C C， Wong D D， Chao P H， Valhmu W B， Hung C T， Ateshian G A. J. Biomech. Eng.， 2000， 122（3）： 252-260

2 Buckwalter J A， Mankin H J. Instr. Course. Lect.， 1997， 47： 477-486

3 Eyre D. Arthritis Res. Ther.， 2002， 4（1）： 30-35

4 Schmidt M B， Mow V C， Chun L E， Eyre D R. J. Orthop. Res.， 1990， 8（3）： 353-363

5 Ramakrishnan N， Xia Y， Bidthanapally A， Lu M. Appl. Spectrosc.， 2007， 61（12）： 1404-1409

6 Jeffery A K， Blunn G W， Archer C W， Bentley G. J. Bone. Joint. Surg. Br.， 1991， 73（5）： 795-801

7 Bank R A， Bayliss M T， Lafeber FP， Maroudas A， Tekoppele J M. Biochem. J.， 1998， 330（Pt1）： 345-351

8 Buckwalter J A， Martin J， Mankin H J. Instr. Course Lect.， 1999， 49： 481-489

9 Yin J， Xia Y， Lu M. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc， 2012， 88： 90-96

10 Kiviranta I， Jurvelin J， Tammi M， Saamanen A M， Helminen H J. Histochemistry， 1985， 82： 249-255

11 Schmid T M， Linsenmayer T F. J. Cell Biol.， 1985， 100： 598-605

12 Burstein D， Velyvis J， Scott K T， Stock K W， Kim Y J， Jaramillo D， Boutin R D， Gray M L. Magn. Reson. Med.， 2001， 45（1）： 36-41

13 XIAO ZhiYan， ZHANG XueXi， YIN JianHua. Chin. Sci. Bull.， 2014， 59（27）： 2645-2651

肖芝燕， 張學(xué)喜， 尹建華. 科學(xué)通報， 2014， 59（27）： 2645-2651

14 YIN JianHua， HUANG FengLing， QIAN ZhiYu， XIE JieRu. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2014， 34（2）： 340-343

尹建華， 黃鳳玲， 錢志余， 謝捷如. 光譜學(xué)與光譜分析， 2014， 34（2）： 340-343

15 Potter K， Kidder L H， Levin I W， Lewis E N， Spencer R G. Arthritis Rheum.， 2001， 44（4）： 846-855

16 CHU XiaoLi. Molecular Spectroscopy Analytical Technology Combined with Chemometrics and its Applications. Beijing： Chemical Industry Press， 2011： 55-103

褚小立. 化學(xué)計量學(xué)方法與分子光譜分析技術(shù). 北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2011： 55-103

17 Dong L， Sun X J， Chao Z， Zhang S Y， Zheng J B， Gurunga R， Du J K， Shi J S， Xu Y Z， Zhang Y F， Wu J. Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc.， 2014， 122： 288-294

18 Ela O， Udi Z， Irina G， Samuel A， Shaul M， Ilana N， Joseph K. Biomed. Eng.， 2013， 60（2）： 343-353

19 Bi X， Yang X， Bostrom M P， Bartusik D， Ramaswamy S， Fishbein K W， Spencer R G， Camacho N P. Anal. Bioanal. Chem.， 2007， 387（5）： 1601-1612

20 Goldring M B. Arthritis Rheum.， 2000， 43（9）： 1916-1926

21 Yamamoto K， Shishido T， Masaoka T， Imakiire A. J. Orthop. Surg， （Hong Kong）， 2005， 13（1）： 8-18

22 Yin J H， Xia Y， Ramakrishnan N. Vib. Spectrosc.， 2011， 57（2）： 338-341

23 Yin J， Xia Y. Spectrochim. Acta A， 2014， 133： 825-830