于晶等

摘 要 以糖蛋白核糖核酸酶B（RNase B）為研究對象，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（MALDITOF/TOFMS）、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICRMS）的碰撞活化解離（CAD）和電子轉移解離（ECD）多種質(zhì)譜技術對RNase B的糖肽的完整信息進行解析。通過多種質(zhì)譜相互驗證，確定了RNase B的糖肽組分的氨基酸序列為SRNLTK、糖鏈結構為（HexNAc）2（Hex）5（HexNAc）2（Hex）9及糖基化位點為第34位氨基酸殘基。本方法為糖蛋白結構的全面解析提供了一種快速、有效、全面的研究思路。

關鍵詞 基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜； 傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜； 碰撞活化解離； 電子捕獲解離； 核糖核酸酶B

1 引 言

蛋白質(zhì)的糖基化是糖鏈在糖基轉移酶作用下結合到蛋白質(zhì)特定氨基酸殘基上[1]，是蛋白質(zhì)的一種重要的翻譯后修飾方式[2]。目前， 已知哺乳動物蛋白質(zhì)中至少有1/2是糖蛋白，廣泛分布于各種組織和細胞中[3]。糖蛋白糖鏈的結構多樣，功能復雜，并且由于生物合成的非模板性和結構的微不均一性，使糖鏈具有了更多的分支結構、連接方式和空間構象，因此，修飾后的糖蛋白會產(chǎn)生多種生物活性，對生物體的生長、發(fā)育甚至對生物體的生存起著至關重要的作用[4]。蛋白質(zhì)的糖基化類型主要為N連接和O連接的糖基化，N連接的糖基化發(fā)生在特定的氨基酸序列AsnXSer/Thr，其中X是除脯氨酸以外的任意氨基酸。O連接的糖基化發(fā)生在Ser/Thr氨基酸序列上。蛋白質(zhì)糖基化與許多疾病的發(fā)展密切相關，在某些疾病狀態(tài)下，聚糖的相對豐度和分支結構與正常相比發(fā)生了變化[5]，這些異常的變化可為疾病的早期診斷及治療提供幫助[6]。

常規(guī)的糖蛋白研究方法主要有基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOFMS）[7]、電噴霧質(zhì)譜（ESIMS）[8]、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICRMS）[9]等。MALDITOFMS和ESIMS這兩種方法都是對糖鏈和肽段分別研究，以得到糖基化位點和糖鏈結構信息，或者是在完整糖肽水平上對糖蛋白結構進行解析。但是在對完整糖肽進行解析時，得到的主要是糖鏈的結構信息，糖肽序列信息較少，導致位點鑒定困難，尤其是對于未知的樣品。完整糖蛋白的全面解析對于疾病的診斷與治療、糖蛋白藥物的篩選及蛋白質(zhì)組學研究具有重要意義。因此，開發(fā)完整糖肽水平的研究方法顯得尤為重要。FTICRMS的碰撞誘導解離（CAD）可以得到糖鏈的結構信息，電子捕獲解離（ECD）碎裂方式通過捕獲一個自由電子，使其與質(zhì)子化的多電荷肽段相互作用，從而誘發(fā)多肽主鏈在NCα鍵處發(fā)生斷裂，主要產(chǎn)生C、Z離子，在碎片離子上保留修飾基團為翻譯后修飾位點的鑒定提供了重要的信息[10，11]。MALDITOF/TOFMS樣品需求量少，且提供豐富的低分子段碎片離子信息。因此，采用多重質(zhì)譜的聯(lián)合分析為完整糖肽的全面研究提供可能。

本研究以糖蛋白核糖核酸酶B（RNase B）的完整糖肽為研究對象，采用液相色譜分離富集，聯(lián)合MALDITOF/TOFMS和FTICRMS的CAD和ECD解離模式等多種質(zhì)譜技術，在解析糖鏈結構的同時，獲得肽段序列和糖基化位點的信息，實現(xiàn)糖蛋白結構的全面、同步解析，為未知及復雜糖蛋白的完整糖肽的解析提供參考方法。

4 結 論

本研究采用液相色譜對樣品中的糖肽進行分離富集，MALDITOF/TOFMS和FTICRMS多重質(zhì)譜檢測，對糖蛋白糖鏈結構及糖基化位點進行同步解析。MALDITOF/TOFMS通過對少量樣品的完整糖肽及切除糖鏈的肽骨架分析，可獲得肽骨架序列、糖基化位點及糖鏈結構的信息，分析速度快。FTICRMS的CAD碎裂模式和ECD碎裂模式相結合，不需要切除糖鏈即可實現(xiàn)肽段序列、糖基化位點及糖鏈結構的同時分析，如與nanoLC聯(lián)用，可望進行糖肽的定量分析。多種質(zhì)譜技術聯(lián)合及相互驗證，鑒定RNase B的糖鏈結構為（HexNAc）2（Hex）5（HexNAc）2（Hex）9，糖基化位點為第34位氨基酸殘基，糖肽氨基酸序列為SRNLTK。本研究為復雜糖蛋白的結構解析提供了一種簡單、有效的方法，對于蛋白質(zhì)組學研究特別是蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究具有重要的意義，同時也為糖蛋白藥物的篩選及疾病的診斷與治療提供幫助。

References

1 WANG Sheng， ZOU Xia， ZHANG Yan. Progr Chem.， 2010， 22（12）： 2428-2435

王 勝， 鄒 霞， 張 延. 化學進展， 2010， 22（12）： 2428-2435

2 SHI YuMei， ZHENG Lei， LI Juan. Progr Mod。 Biomed.， 2011， 11（24）： 5190-5192

石玉梅， 鄭 磊， 李 娟. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展， 2011， 11（24）： 5190-5192

3 WANG LinJie， ZHENG DeXian， GAO Youhe. Basic Clin. Med.， 2007， 27（2）： 122-128

王林杰， 鄭德先， 高友鶴. 基礎醫(yī)學與臨床， 2007， 27（2）： 122-128

4 XU Sha， ZHANG Ping， HUANG LinJuan， WANG ZhongFu. Chem. J. Chinese Universities， 2010， （31）10： 1992-1998

徐 莎， 張 萍， 黃琳娟， 王仲孚. 高等學?；瘜W學報， 2010， （31）10： 1992-1998

5 CHEN Gang， BAI Quan， GENG XinDu. Chinese Journal of Chromatography， 2006， 24（5）： 425-431endprint

陳 剛， 白 泉， 耿信篤. 色譜， 2006， 24（5）： 425-431

6 Alley W R， Jr， Mechref Y， Novotny M V. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2009， 23（1）： 161-170

7 Harvey D J， Royle L， Radcliffe C M， Rudd P M， Dwek R A. Anal. Biochem.， 2008， 376（1）： 44-60

8 Nwosu C C， Seipert R R， Strum J S， Hua S S， An H J， Zivkovic A M， German B J， Lebrilla C B. J. Proteome Res.， 2011， 10（5）： 2612-2624

9 Hongo Y， Nakamura T， Sato A. J. Mass Spectrom. Soc. Jpn.， 2007， 55（2）： 77-82

10 SUN RuiXiang， DONG MengQiu， CHI Hao， YANG Bing， XIU LiYun， WANG LeHeng， FU Yan， HE SiMin. Progr. Biochem Biophys.， 2010， 37（1）： 94-102

孫瑞祥， 董夢秋， 遲 浩， 楊 兵， 秀麗蘊， 王樂珩， 付 巖， 賀思敏. 生物化學與生物物理進展， 2010， 37（1）： 94-102

11 LIU GuangXian， GUAN ShanHong， WANG Hui， FENG JianXiong. Food Sci.， 2013， 34（17）： 43-46

劉光憲， 管珊紅， 王 輝， 馮健雄. 食品科學， 2013， 34（17）： 43-46

12 ZENG Rong， SHAO XiaoXia， WANG KeYi， XIA QiChang. Acta Biochem. Bioph. Sinica， 1999， 31（6）： 695700

曾 嶸， 邵曉霞， 王克夷， 夏其昌. 生物化學與生物物理學報， 1999， 31（6）： 695-700

13 Zhao P， Viner R， Teo C F， Boons GJ， Horn D， Wells L. J. Proteome Res.， 2011， 10（9）： 4088-4104

14 ZHOU Wei， LIU XiaoHui， ZHOU XinWen， SHEN HuaLi， YANG PengYuan. Chinese Journal of Chromatography， 2007， 25（5）： 623-627

周 瑋， 劉曉慧， 周新文， 申華莉， 楊芃原. 色譜， 2007， 25（5）： 623-627

15 CHEN YaoHan， YAN GuoQuan， ZHOU XinWen， YANG PengYuan. Chinese Journal of Chromatography， 2010， 28（2）： 135-139

陳瑤函， 晏國全， 周新文， 楊芃原. 色譜， 2010， 28（2）： 135-139

16 An H J， Peavy T R， Hedrick J L， Lebrilla C B. Anal. Chem.， 2003， 75（20）： 5628-5637

17 Singh C， Zampronio C G， Greese A J， Cooper H J. J. Proteome Res.， 2012， 11（9）： 4517-4525

18 JIANG Jing， YING WanTao， QIAN XiaoHong. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（2）： 159-165

江 靜， 應萬濤， 錢小紅. 分析化學， 2014， 42（2）： 159-165endprint