張紅梅 文 萍 范婷婷 呂武清* 姚劍平 胡棠洪 俞建輝 李淑嵐

（1 江西省中醫(yī)藥研究院，江西 南昌 330046；2 江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004；3 江西省保健品協(xié)會，江西 南昌 330046；4 江西汪氏蜜蜂園有限公司，江西 南昌 330100）

蜂膠是蜜蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠黏性物質。由于不同地區(qū)植被種類以及植物的分泌物不同，導致其化學成分的復雜性。已知成分有黃酮類、萜烯類、綠原酸等有機酸、芳香性醛類、醇類、酚類、酶、氨基酸、維生素B族、礦物質和微量元素等[1-2]。蜂膠化學成分的復雜性，決定了蜂膠藥理活性的多樣性?，F(xiàn)代藥理作用研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠藥理活性非常廣泛，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、調節(jié)血糖、調節(jié)機體免疫功能、促進組織細胞再生等多種生物活性[3-4]。目前，蜂膠已經被加工成各種劑型，廣泛應用于食品，藥品和化妝品。但蜂膠來源復雜，以國產蜂膠為主，有部分巴西、烏拉圭進口蜂膠，由于需求量大，制假現(xiàn)象十分嚴重，通常以楊樹芽提取物仿冒蜂膠提取物。針對蜂膠質量控制存在的問題，本課題組從蜂膠提取物制備工藝[5]、總黃酮測定方法[6-7]及松屬素、白楊素、高良姜素HPLC測定等方面進行研究[8]，本文研究建立了國產蜂膠HPLC指紋圖譜，為蜂膠的質量控制提供了科學依據(jù)。

1 儀器、試藥與材料

1.1 儀器：Waters 1525型高效液相色譜儀（美國Waters公司，包括：2487紫外檢測器，2707自動進樣器，Empower-2色譜工作站）；CQ-250超聲波清洗器（上海船舶電子設備研究所）；SimplicityTM型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；MettllerTkledoAG135雙量程電子天平（十萬分之一）。

1.2 試樣：對照品：白楊素對照品（批號111701-200501），高良姜素對照品（批號111699-200501），喬松素對照品（批號100080-200707），蜂膠對照藥材（批號121324-200301），對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供。所用試劑甲醇為色譜純，其他均為分析純。樣品：蜂膠為課題組收集云南（樣品編號16、17）、四川（編號35、37、38）、江西（編號90、99、103，104，106）、湖南（編號111，117，119）、山東（編號128、129）、河南（編號27、43，45，47）、山西（編號50、52、57）、內蒙（編號130、134、136）、遼寧（編號138）、陜西（編號2、4）、甘肅（編號10、15）、新疆（編號31）、浙江（編號86、87、88、89）等地，經江西省中醫(yī)藥研究院副研究員余良忠鑒定為蜜蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠黏性物質。楊樹膠：58、59、62、63、64、65、66、153～159（購于河南）。

2 方法和結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備：取蜂膠樣品粉末（52號）約60 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，再用甲醇定容至刻度，搖勻。

2.1.2 對照品溶液的制備：分別取白楊素、喬松素、高良姜素對照品各適量，精密稱定，加甲醇使溶解并稀釋，搖勻，分別制成每毫升含喬松素8.523 μg，高良姜素34.576 μg，白楊素18.36 μg。

2.2 色譜條件：色譜柱為YMCC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A：甲醇-B：0.1%磷酸溶液進行梯度洗脫，梯度洗脫程序為：0～20 min由30%A升至45%A，20～50 min由45%A升至55%A，50～90 min維持55%A；柱溫：35 ℃；檢測波長：285 nm；進樣量：10 μL。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度考察：取蜂膠樣品，按2.1.1項制備方法制成供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測定，采用國家藥典委員會推薦用的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版計算得到相似度。結果表明：各色譜峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于1%，相似度大于0.98，儀器精密度較好。

2.3.2 穩(wěn)定性考察：取上述供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣測定，計算10個主要色譜峰面積并計算相似度。結果表明：各色譜峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均<2%，相似度>0.99，說明樣品在24 h內穩(wěn)定。

2.3.3 重復性考察：取同一批蜂膠樣品6份，按照2.1.1項制備方法制備供試品溶液，進樣測定，結果表明：各色譜峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均<1%，相似度在0.99以上，表明本測定方法重復性較好。

2.4 蜂膠對照指紋圖譜的建立：取10批蜂膠按2.1.1制備方法制成供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。分別在waters色譜工作站設定積分參數(shù)，進行積分，逐個以cdf數(shù)據(jù)文件的形式，導出譜圖的AIA文件，再分別導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版（國家藥典委員會）。對其中10個主要色譜峰進行色譜峰匹配，結果見圖1，采用自動匹配生成對照指紋圖譜見圖2。

2.5 蜂膠指紋圖譜相似度測定：取以下蜂膠樣品按2.1.1項制備方法制成供試品溶液，進樣測定，所得的AIA色譜圖文件與蜂膠對照指紋圖譜分別導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004年B版（國家藥典委員會），進行多點校正，并計算相似度，蜂膠相似度計算結果見表1。

圖1 10批蜂膠供試品色譜圖匹配結果(t/min)

圖2 蜂膠對照指紋圖譜（t/min）

圖3 13批楊樹膠的色譜圖匹配結果(t/min)

表1 蜂膠相似度計算結果

經計算機相似度計算，35批蜂膠供試品色譜圖與蜂膠對照指紋圖譜進行比較，相似度結果均>0.9，目前的數(shù)據(jù)說明蜂膠批與批之間有較好的均一性。

2.6 楊樹膠HPLC指紋圖譜研究：取不同批次的楊樹膠按2.1.1項制備方法制成供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖，導出圖譜如圖3所示。結果表明：楊樹膠均無1、2號共有峰，多數(shù)樣品無9號共有峰。

3 討 論

3.1 本實驗對色譜條件的確定進行了優(yōu)化選擇，通過對不同流動相、色譜柱、柱溫和檢測波長比較，優(yōu)化了色譜條件，確定了梯度洗脫比例，達到了有效分離，色譜信息量大，主要色譜峰分離度均＞1.5，通過耐用性試驗證明該方法穩(wěn)定性，重現(xiàn)性好，可用來評價蜂膠的質量。

3.2 蜂膠是蜜蜂從植物芽孢或樹干上采集的樹脂，混入其分泌物加工而成的一種物質。研究結果表明，我國蜂膠以采集楊樹樹脂為主，蜂膠指紋圖譜與楊樹膠基本相同，由于蜂膠混入了蜂蜜的分泌物，在分泌物中酶等作用下，蜂膠指紋圖譜與楊樹膠又有差別，特別是楊樹膠不具備蜂膠指紋圖譜中的1、2、9號色譜蜂。因此，指紋圖譜對鑒別蜂膠和楊樹膠具有重要意義。

3.3 不同地域植物差異較大，蜂膠采集其樹脂分泌物得到的蜂膠差異也大，指紋圖譜研究結果顯示，巴西蜂膠與我國蜂膠指紋圖譜完全不同，共有蜂及共有峰峰面積差異較大，證明了巴西蜂膠植物來源與國產蜂膠存在較大差異[9]，而烏拉圭蜂膠指紋圖譜與我國產蜂膠指紋圖譜基本相同，與區(qū)域植物資源相關[10]。

3.4 指紋圖譜顯示松屬素（6號峰）、白楊素（8號峰）、高良姜素（10號峰）為蜂膠和楊樹膠中主要化合物，楊樹膠幾乎無1、2號峰化合物或9號峰化合物，而巴西蜂膠主要成分在前端2、3號峰。因此，指紋圖譜對蜂膠的真?zhèn)巍碓磋b別具有重要意義，但對蜂膠摻假及不合格蜂膠的鑒別有待于進一步研究。

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