劉欣欣 王中彥

（沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016）

細柱五加（Acanthopanax gracilistylus W. W. Smith）為五加科（Araliaceae）五加屬植物，在我國，主要分布于湖南、湖北等地，多以根皮入藥，是常用于祛風(fēng)濕和強壯筋骨的傳統(tǒng)中藥。主要用于治療風(fēng)濕痹病，筋骨萎軟、小兒行遲，體虛乏力等癥[1]。

多糖是指由10個或10個以上單糖聚合而成的一類生物大分子。研究發(fā)現(xiàn)多糖不僅具有抗癌、抗炎、抗病毒、抗衰老等多方面藥理活性[2]，而且對物理的、化學(xué)的及生物來源的多種活性氧簇（ROS）具有良好的清除作用，能抑制UV所導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化、減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的生成，抑制體外H2O2誘導(dǎo)的紅細胞溶血[3-9]，增加超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px ）活性等[10]，使多糖具有較好的抗氧化活性，而抗氧化作用是一些多糖抗衰老、抑腫瘤、降血脂、降血糖的作用機制之一[11]，近年來國內(nèi)外已將抗氧化檢測用于抗衰老等保健食品的評價[12-13]。加之多糖本身低毒、來源廣泛，已成為近年來的研究熱點。

采用正交試驗來確定細柱五加多糖超聲提取的最佳工藝，以期為細柱五加多糖藥物及功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 材料：細柱五加（Eleutherococcus nodiflorus（Dunn）S. Y.Hu ）購于江蘇省盱眙中藥飲片廠。

1.2 試劑：D-無水葡萄糖（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用）。濃硫酸、鋁片、苯酚、95%乙醇等所用試劑均為分析純。

UV-1700型分光光度計（日本島津公司）；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BüCHI公司）；KQ-500DE 醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 （昆山超聲儀器有限公司）；FSD-100型電動粉碎機（杭州托普儀器有限公司）；DSY-1-4孔電熱恒溫水浴鍋（北京愛琦霞商貿(mào)有限公司）；SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市英予華儀器廠），Labconco FreeZone冷凍干燥儀（美國LABCONCO 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備：取在105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖202.7 mg，精密稱定，加純水溶解并定容至100 mL，作為母液備用。再取適量母液稀釋至質(zhì)量濃度為0.203 mg/mL的葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液。4 ℃冰箱保存，備用。

2.2 苯酚溶液的配制：稱取苯酚200 g，加入鋁片0.2 g和碳酸氫鈉0.1 g，進行蒸餾，收集182 ℃餾分，精密稱取25.0 g餾分，用純水溶解，并于棕色瓶中定容至500 mL，即得5%苯酚溶液，于4 ℃溫度下避光保存?zhèn)溆?。見圖1。

圖1 多糖的提取工藝流程

2.3 多糖的提取工藝流程：①預(yù)處理：將材料洗凈、烘干，粉碎，過三號篩，加入乙醚浸泡12 h，揮干乙醚，殘渣加95%的乙醇回流2 h，殘渣揮干溶劑，保存?zhèn)溆?。②sevag法脫蛋白：沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醇洗滌至無色，再加水復(fù)溶，按1∶1的比例用水復(fù)溶，置錐形瓶中，加入其體積1/4的sevag試劑[三氯甲烷∶正丁醇=4∶1（v∶v）的混合溶液]劇烈震搖15 min，4000 r/min離心10 min，取上清液再加入相當(dāng)于其體積 1/4 的sevag試劑，重復(fù)以上操作直到無白色絮狀物產(chǎn)生為止。濃縮，真空冷凍干燥，即得。

2.4 粗多糖含量測定。式（1）中：C為測得的樣品溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為供試液體積/mL；m為供試品的質(zhì)量/mg；式（2）中：m為醇沉后得到的多糖質(zhì)量/g；M為稱取的細柱五加的質(zhì)量/g。

2.5 測定波長的選擇：精密吸取0.5 mL葡萄糖對照品溶液和2.0 mL供試品溶液于具塞試管中，各加入5%苯酸1.0 mL，混勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，室溫放置5 min，再于100 ℃水中保溫15 min，取出，室溫放冷，在200～600 nm處進行掃描，對照品和供試品在490 nm處有最大吸收波長（波長掃描光譜圖，見圖2）。

2.6 線性關(guān)系考察：取6個具塞試管，分別加入對照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μL，精密吸取，加純水至2 mL，以純水為空白，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，室溫放置5 min，再于100 ℃水中保溫15 min，取出，室溫放冷，在490 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的葡萄糖溶度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A= 0.0092C+0.1084，r=0.9990，在30.41～81.08 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。見表1和圖3。

圖2 200～600 nm波長吸光度譜圖

表1 葡萄糖線性關(guān)系考察

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 單因素試驗：考察不同提取方式、溶劑用量、提取時間、提取次數(shù)、提取溫度對細柱五加多糖提取率的影響。

2.7.1 提取方式考察：準(zhǔn)確稱取細柱五加藥材粉末（過三號篩）10.0 g，置于提取容器中，加入純水100 mL，密塞，稱定重量，分別60 ℃環(huán)境下熱浸、超聲60 min，再稱定重量，用純水不足減失的重量，搖勻，過濾。按“多糖的提取工藝流程”操作制得粗多糖。結(jié)果表明：超聲能夠加速藥材中多糖溶解于溶劑中，使得提取粗多糖得率較高，因此選用超聲提取方法。見圖4。

圖4 提取方式對多糖提取率的影響

2.7.2 溶劑用量對多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱取10.0 g細柱五加藥材（過三號篩），超聲提取，提取時間為60 min，提取溫度為60 ℃，提取次數(shù)為1次。分別加入純水50、100、150、200、250 mL。按“多糖的提取工藝流程”操作制得粗多糖。隨著溶劑用量的增加，多糖提取率也隨著提高，達到150 mL后趨于緩慢。因此確定溶劑用量為150 mL。見圖5。

2.7.3 提取時間對多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱取10.0 g藥材，加入純水150 mL，提取溫度為60 ℃，每次提取時間分別為30、60、90、120、150 min。按“多糖的提取工藝流程”操作制得粗多糖，隨提取時間的增加，多糖提取率也增加，這是超聲波提取過程時原料中多糖成分不斷溶出并向提取液中擴散的過程。隨著提取時間的增加，提取溶劑中多糖的含量逐漸增大，而同時原料組織中，多糖含量逐漸降低，則多糖物的濃度梯度不斷減少，至趨近于平衡，所以在90 min后多糖提取率增加較緩慢。綜合考慮，提取時間選擇90 min。見圖6。

圖5 提取溶媒用量對多糖提取率的影響

圖6 提取時間對多糖提取率的影響

2.7.4 不同提取次數(shù)對多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱取10.0 g藥材，加入純水150 mL，提取溫度為60 ℃，提取時間為90 min，提取次數(shù)分別為1次、2次、3次、4次、5次。按“多糖的提取工藝流程”操作制得粗多糖，細柱五加多糖提取率隨著提取次數(shù)的增加而增加，由多次造成藥材細胞內(nèi)外多糖的濃度差，使細胞內(nèi)的多糖不斷向外擴散，如此多次往返，直至細胞內(nèi)多糖幾乎完全溶出，達到動態(tài)平衡，從圖可以看出當(dāng)提取次數(shù)達到3 次時，再增加提取次數(shù)，多糖提取率增大的幅度不大，而且消耗時間也會延長，工作量加大，從經(jīng)濟等多方面綜合考慮，選擇最佳提取次數(shù)為3次。見圖7。

圖7 不同提取次數(shù)對多糖提取率的影響

2.7.5 提取溫度對多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱取10.0 g藥材，加入純水150 mL，提取時間為90 min，提取次數(shù)為3次，提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃。按“多糖的提取工藝流程”操作制得粗多糖，在60 ℃之前，隨著溫度的升高，多糖溶出率增加，提取率隨溫度的升高而增加；在60 ℃后，多糖提取率隨溫度的增加而降低，可能是因為溫度高，在超聲的空化作用和高溫的雙重作用下使得多糖降解，從而使提取率降低。所以，提取溫度選擇60 ℃較為適宜。見圖8。

2.8 正交試驗：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選用 L9（34） 正交表，選取溶劑用量、提取時間、提取次數(shù)、提取溫度為考察因素（表2），并選擇適當(dāng)?shù)囊蛩厮椒秶?，對多糖提取工藝進行正交試驗。正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3、4。

由表3直觀分析表明，用超聲法提取多糖選擇水為溶劑，以多糖提取率為評價指標(biāo)，最優(yōu)提取工藝為準(zhǔn)確稱取10.0 g藥材超聲提取，純水200 mL、提取溫度60 ℃、提取時間90 min、提取次數(shù)4次。各因素對提取率的影響程度依次是提取次數(shù)＞溶劑用量＞提取時間＞提取溫度。

表3 正交試驗設(shè)計及極差分析結(jié)果

圖8 提取時間對多糖提取率的影響

表2 L9（34） 正交試驗因素水平表

表4 正交試驗方差分析

2.9 驗證實驗：對比單一因素和正交實驗考察結(jié)果，分別按優(yōu)化后的工藝條件，重復(fù)3批驗證實驗，實驗結(jié)果表明，正交實驗給出的最優(yōu)提取工藝對細柱五加多糖的平均提取率為6.54%，結(jié)果表明優(yōu)化得到提取工藝穩(wěn)定且多糖提取量最大。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)實驗結(jié)果，確定細柱五加多糖的最佳提取、純化方法為：將材料洗凈、烘干，粉碎，過三號篩，加入乙醚浸泡12 h，揮干乙醚，殘渣加95%的乙醇回流2 h，殘渣揮干溶劑，保存?zhèn)溆?。稱取10.0 g處理過藥材，加入200 mL純水，超聲提取，提取溫度60 ℃、提取時間90 min、提取次數(shù)4 次。合并濾液，濃縮至料液比1∶1，加入乙醇使其醇含量為80%，靜置24 h。離心棄上清液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌至無色，再加水復(fù)溶，按1∶1的比例用水復(fù)溶，置錐形瓶中，加入其體積1/4的sevag試劑[三氯甲烷∶正丁醇=4∶1（v∶v）的混合溶液]劇烈震搖15 min，4000 r/min離心10 min，取上清液再加入相當(dāng)于其體積 1/4的sevag試劑，重復(fù)以上操作直到無白色絮狀物產(chǎn)生為止。濃縮，真空冷凍干燥，即得。

有學(xué)者對細柱五加多糖做了細胞毒性與體外免疫活性實驗，實驗結(jié)果提示細柱五加莖多糖能刺激巨噬細胞釋放NO，具有一定的體外免疫活性[14]。且在對其同屬紅毛五加多糖的研究中發(fā)現(xiàn)其對免疫系統(tǒng)的影響，能抑制S180腫瘤生長，表明其具有抗腫瘤作用[15]。所以對細柱五加多糖進行深入研究，必將促進現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對人體自衛(wèi)機制的研究。

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