孟令茹 袁曉榮 曹 坤 楊雪潔 金 娜

（內(nèi)蒙古包頭市腫瘤醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

肺癌是最常見(jiàn)的肺原發(fā)性惡性腫瘤，WHO統(tǒng)計(jì)每年新發(fā)肺癌病例120萬(wàn)例，死亡110萬(wàn)例[1]。其中，非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的80%左右，大部分患者就診時(shí)已是晚期，總體5年生存率僅約15%。隨著標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案療效出現(xiàn)了瓶頸，表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸及酶抑制劑（EGFR-TKIs）的臨床應(yīng)用使晚期非小細(xì)胞肺癌EGFR突變患者得以延長(zhǎng)生存期、提高生活質(zhì)量。而表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸及酶抑制劑的應(yīng)用有賴于EGFR基因突變檢測(cè)，以提高用藥有效率。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一種受體型酪氨酸激酶，在許多腫瘤中過(guò)表達(dá)和(或)發(fā)生突變，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制腫瘤生長(zhǎng)，并與新生血管生成、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，這些特點(diǎn)使其成為一個(gè)有潛力的腫瘤靶向治療分子[2]。本文旨在研究?jī)?nèi)蒙古包頭市蒙古族非小細(xì)胞肺腺癌患者與漢族非小細(xì)胞肺腺癌患者EGFR突變率是否存在差異，為內(nèi)蒙古包頭市蒙古族晚期非小細(xì)胞肺腺癌患者個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料：收集包頭市各醫(yī)院蒙古族肺腺癌患者石蠟包埋組織標(biāo)本53例，其中男性33例，女性22例；年齡41～75歲，中位年齡59歲。漢族肺腺癌患者石蠟包埋組織標(biāo)本55例，其中男性39例，女性16例；年齡38～76歲，中位年齡58歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與DNA提?。菏灠駱?biāo)本中腫瘤組織占標(biāo)本總體積的70%，采用病理石蠟切片樣品，切取10張石蠟包埋標(biāo)本切片，每張面積＞10 mm×10 mm、厚度5～10 μm，（所用含有腫瘤組織的蠟塊切片保存時(shí)間不超過(guò)兩年）。常規(guī)石蠟切片，烤干后二甲苯脫蠟，無(wú)水乙醇浸泡再流水沖洗，干燥后顯微切割去除壞死組織，轉(zhuǎn)組織于Eppendorf管中，加消化緩沖液及蛋白酶K溶液，然后60 ℃水浴8～16 h，離心后取上清，加酚/氯仿(1∶1)混勻，離心取上清，加無(wú)水乙醇，-20 ℃放置后再離心棄上清，70%乙醇洗滌沉淀，室溫晾干后用ddH2O重新溶解沉淀，取1 μL測(cè)定濃度和純度，其余-80 ℃保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和測(cè)序：實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增 采用ARMS （amplification refractory mutation system，ARMS）方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)EGFR基因外顯子18、19、20和21突變。用廈門艾德生物醫(yī)藥科技公司EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。采用StrataGene MX3000P實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，每次檢測(cè)樣品包括1個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控品、1個(gè)NTC對(duì)照。如果Ct值為0或Ct值>30，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果判為野生型。所述熒光PCR的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性25 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，15個(gè)循環(huán)；93 ℃變性25 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，31個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

檢測(cè)108例肺腺癌的樣本，包括53例內(nèi)蒙古包頭市蒙古族和55例漢族肺腺癌的樣本。有46例EGFR基因突變，總突變率為42.59%。其中蒙古族突變22例，突變率為41.51%；漢族突變24例，突變率為43.64%。見(jiàn)表1。

表1 蒙古族與漢族EGFR基因突變統(tǒng)計(jì)結(jié)果

其中外顯子18檢測(cè)到EGFR基因突變1例，為漢族；外顯子19 檢測(cè)到EGFR基因突變34例，其中蒙古族16例、漢族18例；外顯子20 檢測(cè)到EGFR基因突變2例，其中蒙古族1例、漢族1例；外顯子21檢測(cè)到EGFR基因突變9例，其中蒙古族5例、漢族4例。外顯子19和外顯子21同時(shí)EGFR基因突變4例，其中蒙古族2例、漢族2例。見(jiàn)表1。

在外顯子19所檢測(cè)到34例EGFR基因突變中共有8種不同的突變形式，最常見(jiàn)核苷酸缺失起始位2235為14例，其中蒙古族為6例，漢族為8例；缺失起始位2238為5例，其中蒙古族為2例，漢族為3例。而核苷酸缺失終止位2249為9例，其中蒙古族為5例，漢族為4例。在外顯子21所檢測(cè)到9例EGFR基因突變中，其位點(diǎn)為2573位的T由G取代，導(dǎo)致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸變?yōu)榫彼幔–TG→CGG，L858R）的為8例，蒙古族為3例，漢族為5例，二者的突變率無(wú)明顯差異。

3 討 論

表皮生長(zhǎng)因子（EGF）及其位于細(xì)胞膜上的受體EGFR是一種跨膜蛋白質(zhì)，是酪氨酸激酶erbB/HER家族的一個(gè)成員，主要由細(xì)胞外的結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)及酪氨酸激酶組成的細(xì)胞內(nèi)區(qū)等3個(gè)區(qū)域組成。EGFR的異?？蓪?dǎo)致其下游信號(hào)途徑的異常激活，最終促使細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖、抵抗細(xì)胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。因此，EGFR成為腫瘤治療的重要靶分子。EGFR-TKI可阻斷EGFR誘導(dǎo)的體外腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，用于非小細(xì)胞肺癌的治療。非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI的敏感性與肺癌組織EGFR基因的突變呈密切相關(guān)。對(duì)藥物敏感的突變位點(diǎn)主要集中在外顯子18～21，約90%的突變集中在第19和第21外顯子，通過(guò)結(jié)構(gòu)分析表明，該區(qū)域的突變改變了EGFR結(jié)構(gòu)，影響多種蛋白激酶的自身調(diào)節(jié)[4-5]。

大規(guī)模臨床試驗(yàn)已表明酪氨酸激酶抑制劑gefitinib]和erlotinib[6-8]在晚期非小細(xì)胞肺癌中的療效和生存上的優(yōu)勢(shì)。文獻(xiàn)報(bào)道[9]，不同人種之間EGFR突變率不盡相同，東亞人群EGFR突變率30%左右，高加索人10%左右。Li等[10]通過(guò)對(duì)202例肺腺癌患者發(fā)現(xiàn)，我國(guó)漢族人的肺腺癌EGFR突變率為75.3%。單莉等[11]通過(guò)對(duì)68例維吾爾族和70例漢族肺腺癌樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)維吾爾族肺腺癌EGFR突變率明顯低于我國(guó)漢族EGFR基因突變。而本研究顯示，內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族肺腺癌EGFR突變與漢族肺腺癌EGFR突變表達(dá)無(wú)明顯差異，二者同樣適用EGFR-TKI治療。

肺癌組織EGFR基因的突變中約90%的突變集中在第19和第21外顯子。本研究45例EGFR基因突變中檢測(cè)到33例外顯子19基因突變，共有8種不同的突變形式，最常見(jiàn)核苷酸缺失起始位2235為14例，其中蒙古族為6例，漢族為8例，缺失起始位2238為6例，其中蒙古族為3例，漢族為3例，而核苷酸缺失終止位2249為11例，其中蒙古族為5例，漢族為6例，二者均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在外顯子21所檢測(cè)到9例EGFR基因突變中，其位點(diǎn)為2573位的T由G取代，導(dǎo)致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸變?yōu)榫彼幔–TG→CGG，L858R）的為8例，蒙古族為3例，漢族為5例，二者的突變率無(wú)明顯差異。

綜上所述，本研究表明內(nèi)蒙古包頭市蒙古族肺腺癌患者EGFR基因突變率與漢族EGFR基因突變率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI的敏感性與肺癌組織EGFR基因的突變呈密切相關(guān)，基于EGFR的突變情況來(lái)選擇EGFR-TKIs的藥物進(jìn)行化療已成為臨床醫(yī)師的共識(shí)，本研究首次提供內(nèi)蒙古包頭市蒙古族肺腺癌EGFR突變率信息，可以為臨床醫(yī)師提供有益參考，使廣大肺腺癌患者受益。

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