崔同欣 劉 將 紀亞楠

丹參藥材指紋圖譜建立方法研究

崔同欣 劉 將 紀亞楠

（上海華源安徽錦輝制藥有限公司，安徽阜陽236018）

在目前已知的丹參及其制劑成分檢測方法的基礎(chǔ)上，主要對丹參水溶性成分的指紋圖譜建立方法進行了初步探究，通過試驗建立了丹參藥材水溶性成分指紋圖譜檢測的試驗條件和方法。

丹參藥材；指紋圖譜；方法；建立

0 引言

丹參，為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。秋季9—10月份采挖，除去泥沙，干燥。

丹參藥材中有效成分主要分為兩類：一類為水溶性的酚酸類成分（丹參素、原兒茶醛和丹酚酸A、B、C等），另一類為脂溶性的二萜類成分（丹參酮I、丹參酮II和隱丹參酮等）。定性鑒別上述兩類成分或定量測定其某種或多種有效成分含量，已成為評價丹參及其制劑質(zhì)量的重要方法[1]。據(jù)統(tǒng)計，丹參制劑達100多種，而丹參制劑中主要有效成分為水溶性的酚酸類成分，考慮到原藥材的質(zhì)量控制與制劑質(zhì)量之間的相關(guān)性，我們主要對丹參藥材水溶性酚酸類成分進行了指紋圖譜的研究，該類成分對紫外線具有較強的吸收值，可采用HPLC-UV法建立制劑指紋圖譜。

1 丹參指紋圖譜研究情況

1.1 脂溶性成分的指紋圖譜

丹參脂溶性成分的指紋圖譜，一般將藥材經(jīng)處理提取后，以甲醇-水溶劑系統(tǒng)進行梯度洗脫。由于丹參藥材、對照品以及使用儀器等條件的不同，洗脫系統(tǒng)存在差異。徐德然[2]等以丹參酮ⅡA、隱丹參酮為對照進行指紋圖譜研究。

目前獲取指紋圖譜的主要方法有色譜法、光譜法、X射線衍射法和分子生物技術(shù)等。其中，色譜技術(shù)是近年來分析化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展快、應(yīng)用廣的方法之一。常用的色譜技術(shù)包括薄層色譜、液相色譜、氣相色譜和毛細管電泳等[3]。其中，高效液相色譜是液相品，5%甲醇與0.1%乙酸-甲醇梯度洗脫，在254 nm波長處檢測，用于不同產(chǎn)地丹參脂溶性成分指紋圖譜的比較研究。

1.2 水溶性成分的指紋圖譜

近10年來，采用HPLC法分析技術(shù)對水溶性酚酸類化合物進行指紋圖譜研究有顯著的優(yōu)勢。研究中一般采用C18柱，甲醇或乙腈同時加入酸抑制劑進行線性梯度洗脫，分離效果較佳。周欣[4]等以丹參素鈉、原兒茶醛為對照品，乙腈-0.4%冰醋酸水溶液進行梯度洗脫，檢測波長254 nm，建立了貴州銅仁地區(qū)丹參藥材的HPLC水溶性共有指紋圖譜；宋敏[5]采用甲醇-1.0%冰醋酸溶液梯度程序洗脫，以丹參對照藥材制備指紋對照品進行了色譜系統(tǒng)適用性試驗，并考察了梯度洗脫程序、流動相酸度以及色譜柱填充劑對指紋圖譜重現(xiàn)性的影響。

1.3 有效成分的指紋圖譜研究

隨著丹參指紋圖譜研究的深入，丹參有效成分（脂溶性和水溶性）指紋圖譜的研究也日益成熟。鑒于藥材的有效成分理化性質(zhì)差異較大，實際操作中，多采用水提、不同濃度甲醇提取等方法，以含酸抑制劑的乙腈或甲醇為流動相，建立丹參有效部位指紋圖譜定性研究的分析方法。

劉艷華[6]等采用水提法，以原兒茶醛為外標，1%冰醋酸和1%冰醋酸甲醇溶液梯度洗脫，檢測波長270 nm，建立了河南靈寶地區(qū)丹參藥材的指紋圖譜；鄭曉珂[7]等以甲醇-0.5%冰醋酸梯度洗脫，流速0.8 mL/min，檢測波長281 nm，柱溫35 ℃，建立了丹參藥材的指紋圖譜；黎瓊紅[8]等采用甲醇為溶劑進行索提后，以丹參酮ⅡA、原兒茶醛、丹參素鈉為對照品，0.02%磷酸乙腈-0.02%磷酸梯度洗脫，40 ℃柱溫，檢測波長280 nm，建立了丹參藥材的高效液相指紋圖譜；劉洋[9]等采用水回流提取后甲醇超聲的方法，以丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮ⅡA為對照品，用0.1%三氟乙酸水溶液-乙腈為流動相梯度洗脫，檢測波長270 nm，柱溫30 ℃，在同一圖譜中同時建立起水溶性成分和脂溶性成分的指紋圖譜。

1.4 其他方法

近些年來，隨著毛細管電泳（HPCE）、高速逆流色譜（HSCCC）及HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，這些技術(shù)已經(jīng)被用于丹參指紋圖譜的研究。

季一兵[10]等用毛細管電泳技術(shù)，采用50 μm× 50 cm未涂漬毛細管柱，20 mmol/L硼砂溶液作緩沖液，運行電壓為15 kV，檢測波長210 nm，建立了丹參中藥材的HPCE指紋圖譜；顧銘[11]等采用HSCCC法，以正己烷-乙醇-水體系采用分步洗脫，建立了丹參藥材中脂溶性成分的HSCCC指紋圖譜；陳勇[12]等應(yīng)用電噴霧-質(zhì)譜（ESI-MS）技術(shù)研究了原兒茶醛和丹參素的ESI-MS規(guī)律，并對丹參藥材中已知的18種水溶性成分中的5種進行了質(zhì)譜檢測和電噴霧行為探討，初步制定了丹參藥材的水溶性成分的特征圖譜。此外，汪紅[13]等以丹酚酸B為指標，以0.5%甲酸-乙腈為流動相，檢測波長287 nm，得到其LC-MS（n）特征圖譜，同時對圖譜中7種主要化合物進行了精確歸屬，初步探討丹酚酸成分的ESI-MS（n）規(guī)律。

徐曼[14]等還應(yīng)用對照品對照和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對丹參注射液中的主要成分進行了定性分析，測定了18個不同廠家生產(chǎn)的丹參注射液的HPLC-UV指紋圖譜以及代表性廠家注射液的HPLC-DAD-MS圖譜，指認了其中的15個酚酸類成分，研究結(jié)果顯示，18個不同廠家生產(chǎn)的丹參注射液在所含化學(xué)成分的數(shù)目和含量上差異顯著。該方法可用于測定不同來源的丹參注射液的色譜指紋圖譜，并為丹參注射液的全面質(zhì)量評價和生產(chǎn)工藝監(jiān)控提供了可行的方法。

2 丹參水溶性成分指紋圖譜建立方法試驗

2.1 供試品溶液的制備

原藥材質(zhì)量標準研究主要是為了更好地控制制劑的質(zhì)量，因而在藥材指紋圖譜的研究中，應(yīng)充分考慮藥材指紋圖譜控制與制劑質(zhì)量之間的相關(guān)性，故在供試品溶液的制備時，我們參考了制劑的制備工藝，即以一定濃度的堿水進行提取。

2.1.1 丹參藥材的粉碎

丹參藥材需粉碎成細粉后進行提取，粉碎前如藥材含水量較高，則應(yīng)將藥材低溫干燥，根據(jù)《中國藥典》2010版丹參含量測定項下規(guī)定，藥材粉碎成過三號篩的藥材細粉即可，但我們在粉碎時發(fā)現(xiàn)有少量藥材纖維難以粉碎過三號篩，該部分應(yīng)盡量粉碎后加入藥材細粉混勻，再稱取樣品，以保證取樣的均勻。

2.1.2 提取方式及溶劑的選擇

考慮到丹參注射劑制劑的制備工藝采用水提醇沉和堿水解的工藝，本藥材提取方法擬采用堿水提取。首先對提取方式及提取溶劑進行了優(yōu)選：稱取藥材粉末1.0 g，共6份，按表1進行提取，提取時間為1 h，各提取液濾過，取續(xù)濾液5 mL，加入等體積甲醇，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，HPLC分析。

2.1.3 提取時間的選擇

考察了不同的提取時間對圖譜的影響：稱取藥材粉末1.0 g，共3份，精密加入25 mL 0.08%Na2CO3溶液回流提取，提取時間按表3進行，提取結(jié)束，取續(xù)濾液5 mL，加甲醇5 mL，混勻，濾過，取續(xù)濾液，

表1 提取方法優(yōu)選

結(jié)果顯示，以0.1%Na2CO3水溶液回流提取，效果較好，與中間體及制劑的色譜圖相對吻合，提示該提取溶劑較為適合。

為了更進一步地優(yōu)選適宜的提取溶劑，以0.1% Na2CO3為參考，考察了多個不同濃度的Na2CO3水溶液：稱取藥材粉末1.0 g，共8份，按表2進行回流提取，提取時間為1 h，各提取液濾過，取續(xù)濾液5 mL，加入等體積甲醇，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，HPLC分析。

表2 提取方法優(yōu)選

結(jié)果顯示，以0.08%Na2CO3水溶液回流提取，樣品色譜峰與半成品及制劑的指紋圖譜吻合度相對較好，因此，最終選擇提取方式為0.08%Na2CO3水溶液回流提取。HPLC分析。

表3 提取時間選擇

藥材回流提取1 h及2 h，色譜峰差異較小，指紋圖譜的吻合度較好，考慮到節(jié)約時間，選擇提取回流時間為1 h。

藥材供試品溶液的制備確定為：稱取丹參藥材粉末（過三號篩）1.0 g，置具塞圓底燒瓶中，加0.08% Na2CO325 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，加0.08%Na2CO3補足失重，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL置10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 檢測方法選擇

考慮到藥材提取液中主要含水溶性的酚酸類成分，并參考了丹參注射劑等制劑有效成分的檢測條件，選用HPLC-UV法進行分析，具體的測試條件、方法考察如下：

2.2.1 儀器和試劑

HPLC儀器：Agilent 1100 G1311A QuartPump，VWD紫外－可見檢測器，全自動進樣器，AgilentLC色譜工作站。

溶劑：甲醇為色譜純（漢邦科技有限公司），乙腈為色譜純（Tedia company），三氟乙酸、冰醋酸均為色譜純，水為亞沸蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2.2.2 流動相選擇

（1）甲醇：酸水系統(tǒng)；（2）乙腈：酸水溶液系統(tǒng)。

試驗優(yōu)選了兩種系統(tǒng)的流動相條件（甲醇為流動相A，乙腈為流動相B，酸水溶液為流動相C），試驗結(jié)果如表4～表8所示。

表4 梯度（1）

表5 梯度（2）

表6 梯度（3）

表7 梯度（4）

表8 梯度（5）

試驗結(jié)果表明，在乙腈-酸水溶液系統(tǒng)下該制劑中整體色譜峰能呈現(xiàn)良好的分離，0.1%三氟乙酸水與0.5%冰醋酸水效果相當(dāng)，考慮到大部分丹參制劑含量測定中使用的酸水為0.5%冰醋酸水，因此指紋圖譜流動相條件最終確定為梯度（5）的方法。

2.2.3 測定波長選擇

對丹參樣品進行了全波長（190～400 nm）HPLC測試，結(jié)果顯示，在281 nm測定波長下整體色譜峰較好，有效成分能夠充分體現(xiàn)，因此選擇測定波長為281 nm。

2.3 色譜柱選擇

（1）C18柱：Hedera C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），江蘇漢邦科技有限公司；（2）C18柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），大連依利特公司；（3）C18柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），菲羅門公司。

在上述條件下，3支以上規(guī)格C18色譜柱樣品的HPLC色譜圖均能達到分離要求，考慮簡便、經(jīng)濟的因素，我們選擇江蘇漢邦科技公司的Hedera C18色譜柱。

2.4 延時測試

丹參藥材供試液指紋圖譜延時測試，延長測試時間1倍至2 h，藥材色譜圖中未見明顯的成分滯后峰，如圖1所示。

2.5 精密度試驗

同一批丹參藥材供試液，連續(xù)進樣6次進行精密度測定，測定結(jié)果如表9、表10所示。結(jié)果表明，供試液中各共有峰的相對保留時間及主要峰的峰面積比值基本一致（RSD%≤5%），符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗

同一批丹參藥材同法制備供試液6份，依法測定，結(jié)果分別如表11、表12所示。結(jié)果表明，供試液中各共有峰的相對保留時間及主要峰的峰面積比值基本一致（RSD%≤5%），符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

圖1 丹參藥材供試液指紋圖譜延時測試

表9 丹參藥材樣品液的精密度考察結(jié)果（共有峰的相對保留時間）

表10 丹參藥材樣品液的精密度考察結(jié)果（主要峰的峰面積比值）

表11 丹參藥材樣品液的穩(wěn)定性考察結(jié)果（共有峰的相對保留時間）

表12 丹參藥材樣品液穩(wěn)定性考察結(jié)果（主要峰的峰面積比值）

2.7 重復(fù)性試驗

同一批丹參藥材同法制備供試品液6份，依法測定，結(jié)果分別如表13、表14所示。結(jié)果表明，供試品液中各共有峰的相對保留時間及主要峰的峰面積比值基本一致（RSD%≤5%），符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件對多批制劑指紋圖譜進行處理：從中選擇1張圖譜為對照圖譜，對色譜峰進行自動匹配后生成“對照圖譜”，將該圖譜作為本丹參藥材的標準指紋圖譜，如圖2所示。

2.8.2 丹參藥材指紋圖譜測定

表13 丹參藥材樣品液的重復(fù)性考察結(jié)果（共有峰的相對保留時間）

表14 丹參藥材樣品液重復(fù)性考察結(jié)果（主要峰的峰面積比值）

2.8 丹參藥材指紋圖譜測定

2.8.1 標準指紋圖譜制備

取19批丹參藥材，依法制備，分別精密吸取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定19批丹參藥材60 min指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)石家溝的丹參藥材圖譜有較大差異，所以將其舍去，考察剩余18批丹參藥材的相似度。

對以上各批丹參藥材以標準指紋圖譜為對照進行相似度評價，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004B版》軟件進行處理：以標準指紋圖譜為對照圖譜，自動匹配后，進行相似度評價，結(jié)果如表15所示。

結(jié)果顯示，以標準指紋圖譜為對照，18批藥材與之相似度均大于0.960，符合指紋圖譜要求。

圖2 丹參藥材標準指紋圖譜

表15 18批丹參藥材相似度評價結(jié)果

3 結(jié)語

綜上所述，丹參藥材及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制研究已較為深入，但仍有不足，特別是對于質(zhì)量控制要求較高的注射用制劑，其質(zhì)量標準應(yīng)在現(xiàn)有基礎(chǔ)上進一步提高，主要包括對制劑中化學(xué)成分進行深入研究，建立合理的含量測定指標，完善指紋圖譜等，從而為藥品的質(zhì)量控制、新產(chǎn)品的生產(chǎn)和開發(fā)、市場監(jiān)督檢驗、臨床合理用藥等方面提供有效的科學(xué)檢測方法和依據(jù)。本文主要對丹參水溶性成分的指紋圖譜建立方法進行了初步探究，隨著檢測手段的不斷進步，必將有更先進的檢測技術(shù)和方法建立起來，以保障中藥及其制劑的質(zhì)量和使用安全。

[1] 曹冬，黃喜茹，王建華.丹參的化學(xué)成分及其制劑的指紋圖譜與質(zhì)量標準研究進展[J].中國藥房，2005，16（17）：1339-1341.

[2] 徐德然，王康才，丁靜，等.不同產(chǎn)地丹參脂溶性成分指紋圖譜的比較[J].中國野生植物資源，2006（12）：40-43.

[3] 謝培山.中藥色譜指紋圖譜[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：18.

[4] 周欣，王道平，梁光義，等.丹參藥材水溶性成分的高效液相色譜指紋圖譜研究[J].色譜，2005，23（3）：292-295.

[5] 宋敏，杭太俊，張正行.丹參水溶性成分標準對照品對照法研究[J].中草藥，2005，36（3）：360-364.

[6] 劉艷華.丹參HPLC指紋圖譜的研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2002，33（2）：127-130.

[7] 鄭曉珂，董三麗，馮衛(wèi)生，等.河南產(chǎn)丹參高效液相色譜指紋圖譜的研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2006，23（1）：57-60.

[8] 黎瓊紅，張國剛，徐世義，等.丹參藥材脂溶性成分的HPLC指紋圖譜[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2006，23（1）：25.

[9] 劉洋，石任兵，劉斌，等.丹參藥材化學(xué)成分HPLC指紋圖譜研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，29（3）：188-192.

[10] 季一兵，鄭朝華，陳玉英.丹參的毛細管電泳指紋圖譜研究[J].中成藥，2003，25（12）：953-955.

[11] 顧銘，張貴峰，蘇志國，等.高速逆流色譜技術(shù)在丹參指紋圖譜中的應(yīng)用[J].中國藥品標準，2005（6）：7-12.

[12] 陳勇，張玲，王世敏，等.丹參水溶性成分的電噴霧質(zhì)譜行為及其特征圖譜的初步研究[J].分析化學(xué)研究簡報，2004，32（11）：1485-1488.

[13] 汪紅，王強.丹參中丹酚酸成分的ESI-MS（n）行為及LC-MS（n）特征圖譜研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25（7）：1387-1389.

[14] 徐曼，劉愛華，張金蘭，等.不同廠家生產(chǎn)的丹參注射液色譜指紋圖譜的比對研究[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，9（2）：65-72.

2015-05-04

崔同欣（1963—），男，安徽太和人，工程師，從事藥品生產(chǎn)管理、藥品研發(fā)及GMP驗證工作。

劉將（1979—），男，安徽潁上人，藥師，從事藥品生產(chǎn)管理、藥品研發(fā)及GMP驗證工作。

紀亞楠（1984—），女，安徽阜陽人，助理工程師，從事藥品生產(chǎn)管理、藥品研發(fā)及GMP驗證工作。