徐偉風，樸元國，李延森，李春梅

南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，南京 210095

3-甲基-4-硝基酚對公雞睪丸早期發(fā)育的影響

徐偉風，樸元國，李延森，李春梅*

南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，南京 210095

研究環(huán)境內(nèi)分泌干擾物3-甲基-4-硝基酚(3-methyl-4-nitrophenol，PNMC)對公雞睪丸早期發(fā)育的影響。48只1 d齡白羽公雞隨機分成3個組，分別為對照組、10和100 mg·L-1PNMC處理組，連續(xù)飲水42 d。檢測公雞的生長性能、睪丸重量和指數(shù)、睪丸的結構變化、血清激素水平和睪丸中CYP17A1及其相關基因的表達情況。結果顯示：與對照組相比，10 mg·L-1PNMC處理組顯著降低公雞的生長性能；睪丸重量和睪丸指數(shù)均無顯著性變化；睪丸細精管生精細胞均有不同程度的空泡兼或脫落；血清孕酮和雌二醇水平均無顯著性差異，睪酮水平隨飲水中PNMC濃度的升高呈遞減的趨勢；公雞睪丸中CYP17A1、HSD3B2和CYP19A1有升高的趨勢，HSD17B4在10 mg·L-1PNMC組呈降低的趨勢，在100 mg·L-1PNMC組呈升高的趨勢。結果表明：飲水中添加10 mg·L-1PNMC顯著影響了公雞的生長性能；飲水中添加100 mg·L-1PNMC引起公雞睪丸細精管生精細胞變性、壞死，造成結構病理損傷，從而對生殖系統(tǒng)造成損傷。

3-甲基-4-硝基酚；睪丸；公雞；生殖損傷

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是一類通過干擾生物體內(nèi)調(diào)節(jié)發(fā)育過程的天然激素的合成、分泌、運輸、結合、反應和代謝等過程，從而對生物體生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等功能產(chǎn)生影響的外源性化學物質(zhì)[1]。3-甲基-4-硝基酚(3-methyl-4-nirophenol，PNMC)，系苯酚衍生物，是一種重要的化工原料，廣泛應用于生產(chǎn)殺蟲劑、除草劑、染料、醫(yī)藥等行業(yè)，常常在生產(chǎn)和使用過程中被釋放到環(huán)境中，它們難以降解，在環(huán)境中可長期殘留，對土壤、水體和大氣造成嚴重的污染，已被美國環(huán)境保護局和我國列為“優(yōu)先控制污染物”之一。最近研究發(fā)現(xiàn)柴油車尾氣中也含有PNMC，約1 kg尾氣顆粒中PNMC含量可以高達28 mg[2]，而且PNMC是有機磷殺蟲劑——殺螟松的水解產(chǎn)物[3]。環(huán)境中各種來源的PNMC可以通過呼吸道、消化道以及皮膚等途徑進入機體內(nèi)部，嚴重威脅著人類及動物的健康。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)PNMC具有雌激素和抗雄激素的作用[4-5]，能夠引起精囊、前列腺以及陰莖頭重量顯著降低，擾亂雄性大鼠腎上腺皮質(zhì)類固醇激素的分泌[6]。

目前，關于PNMC作用機制的相關研究在大鼠[7-8]、小鼠[9]、鵪鶉[10]等動物上已有報道，但是，PNMC對家禽生殖的影響仍處于空白。因此，本試驗以白羽公雞為研究對象，在飲水中添加不同濃度的PNMC，研究PNMC對白羽公雞的生長性能、睪丸指數(shù)、睪丸組織結構變化、血清激素水平和睪丸中CYP17A1及相關基因表達的影響，為今后研究PNMC對家禽的影響提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗動物

1 d齡健康白羽公雞48只(南京青龍山實驗動物研究所提供)。

1.2 主要試劑

3-甲基-4-硝基酚(3-methyl-4-nitrophenol，PNMC，純度99.9%，成都科隆化學品有限公司)，電解多維(四川天紅牧業(yè)有限公司)，多聚甲醛(上海凌峰化學試劑有限公司)，動物切片石蠟(熔點60～62 ℃，上海國藥集團化學試劑有限公司)，HE(蘇木精-伊紅)染液(南京建成生物科技有限公司)，反轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，PCR定量試劑盒(上海皓嘉科技發(fā)展有限公司)，雌二醇試劑盒(北京北方生物技術研究所)，孕酮和睪酮試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.3 主要試驗儀器

石蠟切片機Leica RM2235和烘片機Leica HI1220(上海徠卡儀器有限公司)，光學顯微鏡Nikon YS100和倒置顯微鏡(日本Nikon株式會社)，酶標儀(美國Thermo公司)，5417R型臺式冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司)，低溫冷凍離心機J2-MI型(德國Beckman公司)，Real-time PCR儀(美國Bio-rad公司)。

1.4 動物分組與處理

試驗為單因素試驗設計。將48只1 d齡健康白羽公雞隨機分為3個處理組，每個處理組設4個重復，每個重復4只雞，試驗期為42 d。試驗基礎日糧采用玉米-豆粕型日糧，分1～21 d和21～42 d兩階段進行飼養(yǎng)，日糧組成和營養(yǎng)水平見表1。對照組飲水中不添加PNMC，試驗組分別向飲水中添加10 mg·L-1和100 mg·L-1的PNMC。試驗階段采用籠養(yǎng)，24 h光照，并且確保雞群能夠自由飲水和采食，對照組與試驗組采用相同的免疫程序進行免疫以及相同的飼養(yǎng)管理方式進行飼養(yǎng)。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 生長性能

從初生重開始記錄，于每周對所有雞只進行稱重(稱重前12 h斷料)，按重復記錄飼料采食量和剩余采食量，根據(jù)體重和采食量，計算各階段平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)。

1.5.2 睪丸重量與睪丸指數(shù)

試驗結束后，采用頸部割喉法處死雞只，剝離、取出睪丸并準確地除去表面的脂肪和結締組織，稱重前用濾紙吸干血水后稱重并詳細記錄每只雞的睪丸重量，計算睪丸指數(shù)。

表1 基礎飼糧組成以及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet (dry mass basis)

注：1) 每kg飼糧提供的微量元素為Fe 80 mg，Cu 8.0 mg，Zn 65 mg，Mn 110 mg，I 1.1 mg，Se 0.3 mg；

2) 每kg飼糧提供的維生素為VA 24 mg，VD3 6 mg，VE 20 mg，VK 1.3 mg，VB12.2 mg，VB28 mg，VB340 mg，VB64 mg，VB120.013 mg，VH 0.04 mg；葉酸1 mg，桿菌肽鋅30 mg，膽堿400 mg，泛酸鈣10 mg；

3) 營養(yǎng)水平為計算值。

Note: 1) One kg of the diet provides trace elements: Fe 80 mg,Cu 8.0 mg,Zn 65 mg,Mn 110 mg,I 1.1 mg,Se 0.3 mg;

2) One kg of the diet provides Vitamins: VA 24 mg,VD36 mg,VE 20 mg,VK 1.3 mg,VB12.2 mg,VB28 mg,VB340 mg,VB64 mg,VB120.013 mg,VH 0.04 mg; Folic acid 1 mg,bacitracin zinc 30 mg,choline 400 mg,calcium pantothenate 10 mg;

3) Nutrient levels are calculated values.

1.5.3 睪丸組織結構觀察

試驗結束后，試驗公雞采血后屠宰，分離睪丸，取部分樣品放入福爾馬林溶液中固定，用石蠟包埋處理，切片為5 μm，進行HE染色，觀察睪丸組織結構變化。

1.5.4 血清激素水平

試驗結束后，采用頸部割喉法處死雞只，收集血液，3 500 r·min-1離心15 min，吸取上清液，-20 ℃保存。采用試劑盒測定血清睪酮(testosterone)、孕酮(progesterone)和雌二醇(estradiol)的含量。

1.5.5 睪丸組織總RNA的提取和定量測定

按照Trizol說明書提取睪丸組織的總RNA，提取的RNA保存于-70 ℃超低溫冰箱中，或立即用于反轉錄。反轉錄時，按照Takara Prime Script ? RT reagent Kit反轉錄試劑盒說明書，取上述純化的總RNA 2.0 μg 加入2×RT Buffer 10 μL、20×RT Enzyme Mix 1 μL、Nuclease-free H2O補足至20 μL，置于PCR儀內(nèi)37 ℃15 min，95 ℃反轉錄滅活15 s，反應結束后所得cDNA用于定量PCR。按照TakaraSYBR? Premix Ex TaqTM定量試劑盒說明書，依次往定量PCR管加入下列試劑(20 μL體系)：H2O 3.4 μL、引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL、模板1 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL、SYBR Premix Ex Taq 5 μL，混勻離心后在Real-time PCR儀上反應檢測，反應程序如下：95 ℃變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，重復45個循環(huán)；反應結束繪制熔解曲線。利用2-△△Ct法對基因表達進行相對定量，下表為試驗中所用引物序列，見表2。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。用單因素ANOVA法分析差異性，若差異顯著則用LSD法進行多重比較(當P <0.05時即被認為差異顯著)，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤(Mean±SEM)表示。

2 結果(Results)

2.1 PNMC對公雞生長性能的影響

PNMC對公雞生長性能的影響見表3。與對照組相比，10 mg·L-1組的全期平均日增重顯著降低(P<0.05)，全期平均日采食量和全期料重比卻有極顯著的上升(P<0.01)；與對照組相比，100 mg·L-1組在1～21 d時平均日采食量和料重比極顯著的增加(P<0.01)，其他各個時期的平均日增重、平均日采食量和料重比都無顯著性差異(P>0.05)。

表2 Real-time PCR所用引物Table 2 Primers for real-time PCR analyses

表3 3-甲基-4-硝基酚(PNMC)對公雞生長性能的影響Table 3 Effects of 3-methyl-4-nitrophenol (PNMC) on growth performance of roosters

注：同行數(shù)據(jù)肩標小寫字母不同表示差異顯著(P <0.05)，大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。

Note: In the same row,values with different small letter superscripts mean the difference is significantly at 0.05,and values with different capital letter superscripts mean the difference is significantly at 0.01.

2.2 PNMC對公雞體重和睪丸重量的影響

對照組和PNMC處理組公雞生長正常。與對照組相比，10 mg·L-1組體重極顯著降低(P<0.01)，100 mg·L-1組體重下降，但差異不顯著(P>0.05)。睪丸重量和睪丸指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，見表4。

2.3 PNMC對公雞睪丸組織結構的影響

圖1為各組公雞睪丸組織的HE染色圖。從圖中可以看到，對照組公雞睪丸組織間質(zhì)細胞、支持細胞、生精細胞均清晰可見，排列整齊、均勻分布、緊湊有序，形態(tài)正常(圖1A)。與對照組相比，PNMC組(圖1B、圖1C)呈現(xiàn)不同程度的病理形態(tài)學變化：10 mg·L-1組部分睪丸組織體積縮小，排列不夠緊湊并出現(xiàn)輕微的空泡化(圖1B)；100 mg·L-1組細精管細胞排列疏松存在嚴重的脫落趨勢(圖1C)。

表4 PNMC對公雞體重、睪丸重及睪丸指數(shù)影響Table 4 Effects of PNMC on the body weight,testicle weight and testicle index of roosters

注： 同列數(shù)據(jù)肩標大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。

Note: In the same column,values with different capital letter superscripts mean the difference is significantly at 0.01.

圖1 PNMC處理對公雞睪丸組織結構的影響(A)對照組; (B)10 mg·L-1 PNMC組; (C)100 mg·L-1 PNMC組

2.4 PNMC對公雞血清激素水平的影響

與對照組相比，PNMC處理組中血清孕酮和雌二醇水平均無顯著性差異(P>0.05)，睪酮水平隨飲水中PNMC濃度的升高呈遞減的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，見表5。

表5 PNMC對公雞血清激素水平的影響Table 5 Effects of PNMC on serum hormone levels of roosters

2.5 PNMC對公雞睪丸組織類固醇激素合成相關酶的基因表達的影響

圖2為各組公雞睪丸組織中CYP17A1、HSD3B2、CYP19A1和HSD17B4 mRNA相對表達量的變化。與對照組相比，10 mg·L-1組的CYP17A1(圖4A)、HSD3B2(圖4B)和CYP19A1(圖4C)有升高的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，HSD17B4(圖4D)呈降低的趨勢(P>0.05)；CYP17A1(圖4A)、HSD3B2(圖4B)、CYP19A1(圖4C)和HSD17B4(圖4D)在100 mg·L-1組均有升高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。

3 討論(Discussion)

3.1 PNMC對公雞生長性能及睪丸重量的影響

飲水中分別添加濃度為10 mg·L-1和100 mg·L-1PNMC，不會引起急性中毒癥狀。濃度為10 mg·L-1時顯著影響公雞的生長性能，而濃度為100 mg·L-1時無顯著影響，這一結果與岳卓等[7]、Li等[11]的研究不同。分析其原因，可能PNMC對公雞生長性能的影響不存在濃度依賴性，當濃度為10 mg·L-1PNMC進入動物消化道后，可能改變消化道內(nèi)環(huán)境，降低了動物對養(yǎng)分的消化吸收能力，從而引起生長性能的降低；而濃度為100 mg·L-1時無顯著影響，可能與給藥方式、試驗動物、處理時間等有關，但具體作用機制尚不清楚。在睪丸重量和睪丸指數(shù)方面，如果睪丸指數(shù)變小，表明睪丸可能出現(xiàn)萎縮和退行性變化；如果睪丸指數(shù)變大，表明睪丸可能出現(xiàn)水腫、充血和增生等病變[12]。濃度為10 mg·L-1和100 mg·L-1PNMC沒有引起公雞睪丸重量和睪丸指數(shù)發(fā)生顯著性變化，說明PNMC在本試驗劑量下對公雞生殖器官的生長沒有顯著影響。

圖2 PNMC處理對公雞睪丸組織類固醇激素合成相關酶的基因表達的影響

3.2 PNMC對公雞睪丸組織結構變化的影響

飲水中添加不同濃度的PNMC對公雞睪丸有不同程度的損傷。這與前人報道一致，如岳卓等[7]的研究表明對照組大鼠睪丸曲細精管內(nèi)支持細胞和各級生精細胞排列緊密、有序，精細胞整齊密集；PNMC處理(皮下注射)可導致大鼠睪丸組織均有不同程度的損傷，主要表現(xiàn)為曲細精管內(nèi)大量生精細胞壞死，細胞核固縮凝聚，并出現(xiàn)形成空泡樣結構。布同良等[13]研究表明100 mg·kg-1的PNMC腹腔注射可引起小鼠睪丸的局部嚴重損傷，表現(xiàn)為曲細精管的損傷，生精上皮中生殖細胞量顯著減少。上述研究表明PNMC可能是阻礙生精細胞在減數(shù)分裂前后的分化與增殖，使其發(fā)育成精子細胞和精子的數(shù)量減少。

3.3 PNMC對血清激素水平和睪丸組織類固醇激素合成相關酶的基因表達的影響

作為汽車尾氣顆粒物中成分之一的PNMC可抑制成年小鼠[14]、大鼠[15]以及未成年大鼠精子的生成[16]。飲水中添加10 mg·L-1和100 mg·L-1PNMC時，睪酮的含量雖無顯著性減少，但呈降低的趨勢。這與他人的研究結果一致，如岳卓等[9]報道，PNMC處理(經(jīng)口灌胃)會導致曲細精管內(nèi)睪酮含量降低，最終導致精子生成障礙。同時Li等[17]研究表明PNMC肌肉注射可以使成年雄性鵪鶉的睪酮分泌下降，并影響睪丸功能，但機制尚不清楚。近來研究表明，生理劑量的孕激素可以促進雄激素依賴的雄性性行為表現(xiàn)，這在Young等[18]的實驗中已得到證實。與10 mg·L-1PNMC組相比，飲水中添加100 mg·L-1PNMC時，雌二醇的含量呈降低的趨勢，肉雞血清中孕酮的含量有升高的趨勢。這一結果與Li等[19]報道類似，100 mg·kg-1PNMC組肌肉注射顯著降低了雌二醇的含量，顯著增加了孕酮的含量。說明飲水中添加PNMC能夠在一定程度上影響血清激素水平的變化，導致內(nèi)分泌功能紊亂，從而對生殖系統(tǒng)造成損傷。

性腺發(fā)育受到下丘腦-垂體-性腺信號通路的調(diào)節(jié)和控制，激素在信息傳遞中起重要作用，也成為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物作用的主要靶點[20]。細胞色素P450系列酶參與了類固醇激素的合成過程[21]。CYP11A1和HSD3B2在膽固醇轉化成孕酮的生化過程中不可或缺，CYP17和HSD17B在孕酮轉化成睪酮的過程中扮演著重要的角色，而CYP19在睪酮進一步轉化成雌二醇的過程中發(fā)揮重要的作用[22-23]。其中，由CYP17基因編碼的細胞色素P450 17α-羥化酶(17α-hydroxylase)、17，20-裂解酶(17，20-lyase)能參與睪丸中膽固醇轉化為睪酮的過程，調(diào)控睪丸性激素合成的總量[24]。P450芳香化酶(P450arom)是調(diào)節(jié)脊椎動物體內(nèi)雌激素形成的關鍵酶，廣泛分布于脊椎動物的腦和性腺等器官組織中[25]。魚類CYP19A基因編碼性腺中的P450arom，主要分布于卵巢[26]，在睪丸間質(zhì)細胞中有少量表達，調(diào)控原始精原細胞的增殖[27]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)CYP19A1基因的表達量在PNMC處理組公雞睪丸組織中有增加趨勢，這一結果與Hatef等[28]的報道類似。因此，我們推測PNMC對公雞睪丸功能的影響可能是通過提高CYP19A1基因表達加速了睪酮向雌激素的轉化，使血清中睪酮含量減少，增強雌激素效應。CYP17A1、HSD3B2和HSD17B4基因表達無明顯的變化，可能是由于這些基因位于上游，但具體作用機制還有待于進一步研究。

綜上所述，在公雞早期發(fā)育過程中，飲水中添加10 mg·L-1PNMC時可顯著影響肉雞的生長性能，并且這種影響不具有濃度依賴性；飲水中添加100 mg·L-1PNMC時公雞血清睪酮的生成減少，睪丸細精管生精細胞變性、壞死，造成結構變化，引起睪丸功能損傷。而PNMC通過影響公雞睪丸組織類固醇激素合成相關酶的表達而干擾激素分泌的作用機制還有待進一步的研究。

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Effects of 3-methyl-4-nitrophenol on the Early Development of Rooster Testes

Xu Weifeng,PiaoYuanguo,Li Yansen,Li Chunmei*

College of Animal Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China

25 December 2014 accepted 4 February 2015

To investigate the effects of 3-methyl-4-nitrophenol (PNMC),a major component of diesel exhaust particles,on the early development of the rooster testes,forty-eight white roosters(1-d-old) were randomly divided into three groups and supplemented with PNMC in drinking water in different doses (0,10,100 mg·L-1)for 42 days.Growth performance,testes weight and index,the morphological changes of testes,serum hormone levels and the expression levels of the testicular CYP17A1 and related genes were assessed.The results showed that the growth performance was significantly reduced in the 10 mg·L-1PNMC-treated group compared with the control group.The values of testes weight and index showed no significant change among 3 groups.The increased vacuolation were observed in the spermatogenic cells of the seminiferous tubules in the 10 mg·L-1PNMC-treated group.There was no significant difference in serum progesterone,estradiol and testosterone levels.The expression levels of the testicular CYP17A1,HSD3B2 and CYP19A1 in the 10 mg·L-1PNMC-treated group was higher than those of the control group.The expression level of the testicular HSD17B4 was lower in the 10 mg·L-1PNMC-treated group and higher in the 100 mg·L-1PNMC group when comparing with that of the control group.In conclusion,the supplementation of 10 mg·L-1PNMC in drinking water affected the growth performance whereas supplementation of 100 mg·L-1PNMC caused the cell degeneration and necrosis in the seminiferous tubules and triggered the structural changes.Therefore our results indicate that early exposure to PNMC resulting in the damages in the reproductive system of rooster.

3-methyl-4-nitrophenol; testes; rooster; reproductive damage

江蘇省自然基金面上項目(BK20131315)；“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAD39B02)

徐偉風(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為環(huán)境毒理學，E-mail：2013105059@njau.edu.cn；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: chunmeili@njau.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141225001

2014-12-25 錄用日期：2015-02-04

1673-5897(2015)4-146-08

X171.5

A

李春梅(1974-)，女，博士，教授，博士生導師。主要研究方向動物環(huán)境生理與營養(yǎng)毒理學。

徐偉風,樸元國,李延森,等.3-甲基-4-硝基酚對公雞睪丸早期發(fā)育的影響[J].生態(tài)毒理學報，2015,10(4): 146-153

Xu W F,Piao Y G,Li Y S,et al.Effects of 3-methyl-4-nitrophenol on the early development of rooster testes [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 146-153 (in Chinese)