魏傳平

(泰山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，山東泰安271000)

分子印跡結(jié)合SPR技術(shù)檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥殘留

魏傳平

(泰山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，山東泰安271000)

表面等離子體共振技術(shù)(SPR)是利用金屬薄膜的光學(xué)耦合產(chǎn)生的一種物理“光學(xué)現(xiàn)象”.可通過(guò)監(jiān)測(cè)SPR的變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子間的相互作用，具有無(wú)需熒光標(biāo)記等特點(diǎn).分子印跡技術(shù)是制備對(duì)某一客體分子具有預(yù)定選擇性材料的過(guò)程，利用合成的聚合物內(nèi)的空穴對(duì)模板分子的“記憶效應(yīng)”來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)模板分子的選擇性識(shí)別.本文是以乙酰甲胺膦為模板分子制備的印跡聚合物膜(MIPS)，利用SPR傳感器進(jìn)行檢測(cè)分析蔬菜中的農(nóng)藥殘留，結(jié)果表明，此種分子印跡傳感器具有較好的印跡效果和選擇性能.

表面等離子體共振傳感器;分子印跡聚合物;農(nóng)藥檢測(cè)

農(nóng)藥的種類很多，其中有機(jī)氮、有機(jī)磷殺蟲劑在環(huán)境中的半衰期相對(duì)較短，對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性相對(duì)較小，又由于價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，它們占據(jù)了絕大多數(shù)市場(chǎng).農(nóng)藥在給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)好處的同時(shí)也造成大氣、水體、土壤的污染及在食品中的殘留［1－2］.考慮到農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和人類健康的威脅，發(fā)展高靈敏度、高選擇性的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法顯得更加重要.表面等離子體共振技術(shù)(SPR)［3］，是一種不需要分離純化，且不需要標(biāo)記的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)技術(shù).通過(guò)檢測(cè)分子間的相互作用，可以確定反應(yīng)物的種類和濃度.此技術(shù)所需試樣少且無(wú)需標(biāo)記，檢測(cè)的速度快、靈敏度高，被廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境等監(jiān)測(cè)領(lǐng)域.分子印跡聚合物(MIP)是一種結(jié)構(gòu)預(yù)先設(shè)計(jì)好的大分子人工材料，具有特殊的官能團(tuán)和分子結(jié)構(gòu)，對(duì)待測(cè)分子能選擇性的識(shí)別.MIP不但顯示出生物酶和抗體類似的分子選擇性，而且具有良好的化學(xué)惰性，在水和大多數(shù)有機(jī)溶劑中不溶.在本文中，我們采用原位引發(fā)自由基聚合的方法制備分子印跡聚合物.這一技術(shù)和方法對(duì)于快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留具有一定的實(shí)用價(jià)值.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FT－SPR 100型表面等離子體共振儀(美國(guó)Thermo公司).

甲基丙烯酸(MAA，分析純)、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM，分析純)、11－巰基十一烷酸(COOH－thiol，95%，分析純)均購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司;乙酰甲胺膦等有機(jī)磷農(nóng)藥(百靈威公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

我們利用原位引發(fā)聚合法來(lái)制備分子印跡傳感器［4］，其原理如下:在傳感裝置的表面涂上含有單體、模板分子、引發(fā)劑的混合溶液，將其放在紫外燈下使混合溶液引發(fā)聚合，從而在傳感裝置表面上形成分子印跡膜.這一方法是較為理想的制備方案.金載玻片，作為傳感器芯片浸在10mL的新制備的Piranha溶液中2分鐘，取出傳感器芯片并用大量的蒸餾水沖洗，用N2吹干待用.然后將其放置在4℃的11－巰基十一酸的乙醇溶液中，反應(yīng)24小時(shí).依次用乙醇和蒸餾水沖洗傳感器芯片，然后將其轉(zhuǎn)入2－乙基－5－苯基異惡唑－3－磺酸的水溶液中30分鐘.最后，將該芯片轉(zhuǎn)移到10mL光引發(fā)劑ABAH的水溶液中，并保持在20℃的條件下反應(yīng)3小時(shí).引發(fā)劑覆蓋的金載玻片在N2氣流下進(jìn)行干燥，并立即用于制備聚合物.將處理過(guò)的傳感芯片放到溶有模板分子乙酰甲胺膦、單體MAA和交聯(lián)劑TRIM的乙腈溶液中，通氮?dú)?0分鐘，密封瓶口.在365nm的紫外燈照射下4°C反應(yīng)2h.非印跡聚合物膜(NIP)的制備方法不加乙酰甲胺膦，其它步驟同上述.傳感芯片安裝到SPR儀器時(shí)，用洗液進(jìn)行沖洗，除去未反應(yīng)的混合物及模板分子.將新鮮黃瓜和油菜洗凈切成均勻的小塊，這兩種樣品的處理如下:將10g黃瓜或20g油菜樣品冷凍干燥處理24小時(shí)，然后加入標(biāo)準(zhǔn)量的乙酰甲胺膦，在研缽中加入聚乙烯聚吡咯烷酮研磨將混合物混合均勻，放置1小時(shí)后，將混合物置于離心管中，用丙酮萃取，離心20分鐘，重復(fù)提取兩次，合并提取液，蒸發(fā)至接近干燥，將殘余物重新溶解在100ml的緩沖液中，將溶液過(guò)濾備用.在實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)TSPR測(cè)定均采用SPR－100共振儀.不同濃度測(cè)試化合物溶解于緩沖液中，進(jìn)入到流動(dòng)池中，直到波數(shù)位移達(dá)到穩(wěn)定值，用FT－SPR實(shí)時(shí)記錄波數(shù)的變化.

2 結(jié)果與討論

2.1 印跡聚合物膜厚度的影響

印跡膜的厚度決定了SPR傳感器響應(yīng)的快慢.圖1是聚合上非印跡膜及印跡膜后的芯片和裸芯片在緩沖液中的光譜圖.由圖1可知，裸芯片與印跡聚合物膜結(jié)合后，波數(shù)紅移了929.02cm－1結(jié)合上非印跡聚合物膜后，波數(shù)紅移了228.96cm－1，這表明在SPR傳感器表面形成了非印跡和印跡薄膜.據(jù)Corn和Weibel的報(bào)道［5］，在最優(yōu)化角度處，膜厚度可通過(guò)波數(shù)的位移來(lái)計(jì)算.以此結(jié)論為依據(jù)估算的SPR芯片上結(jié)合的MIP和NIP涂層厚度分別約為22nm和5nm.非印跡膜比印跡膜要薄很多，這可能是因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中引發(fā)劑不同的反應(yīng)方式引起的.

圖1 室溫下，在pH=5.0，0.1 mol/L HAc－NaAc緩沖液中，非分子印跡膜、分子印跡膜修飾的傳感器及裸金片的FT－SPR光譜

2.2 pH值對(duì)SPR傳感器的影響

我們將pH值對(duì)分子印跡的SPR傳感器親和性的影響進(jìn)行了研究，通過(guò)改變?nèi)芤涸?.0－8.0之間的pH值，所得到的結(jié)果如圖2，從圖中可以看出，當(dāng)溶液的pH從3.0增加到5.0時(shí)，分子印跡膜吸附分析物有機(jī)膦的量逐漸增加，在pH等于5.0時(shí)對(duì)有機(jī)膦的吸附量達(dá)到最大.但是當(dāng)pH增到8.0時(shí)，分子印跡膜對(duì)被分析物有機(jī)膦的吸附量卻減少了.我們推測(cè)變化的原因之一是乙酰甲胺膦通過(guò)氫鍵結(jié)合到分子印跡膜的印跡位點(diǎn)上.基于功能單體MAA及其聚合物的pKa值我們推斷，分子印跡聚合物的等電點(diǎn)可能在pH值為5時(shí).在pH=5時(shí)分子印跡膜更靠近于SPR傳感器表面，分子印跡位點(diǎn)上功能團(tuán)的位置與模板分子在形狀、大小上更加匹配.所以，在試驗(yàn)中我們將溶液的pH均調(diào)在5.0處.

圖2pH值對(duì)分子印跡的SPR傳感器的影響

2.3 印跡聚合物對(duì)SPR傳感器靈敏度的影響

我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較了分子印跡膜與非分子印跡膜作為傳感膜的性能.對(duì)不同濃度乙酰甲胺膦的印跡效果通過(guò)SPR的波數(shù)位移得到比較，見(jiàn)圖3.與非印跡芯片相比印跡傳感器芯片表現(xiàn)出較大的波數(shù)位移.對(duì)于乙酰甲胺膦分子印跡傳感器芯片，當(dāng)乙酰甲胺膦的濃度為2×10－11mol/L時(shí)SPR波數(shù)變化達(dá)到最大值，盡管非印跡傳感器芯片也檢測(cè)到乙酰甲胺膦的濃度，由于其靈敏度較低，導(dǎo)致SPR波數(shù)的變化較小隨著乙酰甲胺膦濃度的變化.在圖3中，我們?nèi)匀话l(fā)現(xiàn)SPR傳感器對(duì)乙酰甲胺膦在一定的濃度范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系.然而，對(duì)于非印跡傳感器只有較差的線性度.這是由于印跡傳感器芯片對(duì)乙酰甲胺膦存在較好的特異性吸附.模板分子乙酰甲胺膦與結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)可以通過(guò)Langmuir等溫模型［6］求得，結(jié)合常數(shù)為7.6×1012L/mol，有這一數(shù)值更進(jìn)一步說(shuō)明分子印跡膜對(duì)乙酰甲胺膦具有更高的靈敏性和選擇性.

圖3 乙酰甲胺膦的濃度引起印跡及非印跡SPR傳感器波數(shù)的變化

2.4 分子印跡聚合物SPR傳感器的應(yīng)用

利用分子印跡聚合物SPR傳感器分析實(shí)際樣品中乙酰甲胺膦的含量，基于圖3，對(duì)樣品中的乙酰甲胺膦含量進(jìn)行了測(cè)定.表1表明，該方法表明黃瓜中乙酰甲胺膦的回收率為97.1%，而在油菜中的回收率是95.8%.再根據(jù)信噪比為3時(shí)，黃瓜和油菜的檢出限為2.96×10－13mol/L和4.26×10－14mol/L.結(jié)果表明，該方法與其他方法相比具有良好的重現(xiàn)性和高靈敏性.

表1 黃瓜和油菜樣品的分析結(jié)果(n=6)

3 小結(jié)

通過(guò)在傳感芯片表面鏈接光引發(fā)劑制得的分子印跡膜，結(jié)合分子印跡與SPR聯(lián)用技術(shù)，對(duì)實(shí)際果蔬樣品黃瓜和油菜中的乙酰甲胺膦進(jìn)行了檢測(cè).結(jié)果證明乙酰甲胺膦分子印跡SPR傳感器對(duì)于乙酰甲胺膦的檢測(cè)是一種簡(jiǎn)單高效的方法.

［1］C.M.Torres，Y.Pico，J.Manes.Determination of pesticide residues in fruit and vegetables［J］.J.Chromatogr A，1996(754):301－331.

［2］P.Lea，F(xiàn).Mladen.Detection of organophosphate and carbamate pesticides in vegetable samples by a photothermal biosensor［J］.Biosens Bioelectron，2003(18):1－9.

［3］B.Lieberg，C.Nylander，I.Lundstrom.Surface plasmon resonance for gas detection and biosensing［J］.Sensors and Actuators，1983(4): 299－304.

［4］L.K.Ista，S.Mendez，V.H.Pérez－Luna，G.P.López.Synthesis of poly(N－isopropylacrylamide)on initiator－modified self－assembled monolayers［J］.Lagmuir，2001(17):2552－2555.

［5］R.M.Corn，S.C.Weibel.Fourier transform surface plasmon resonance［M］.New York:Wiley－Interscience，2001.

［6］R.Mazel.Principles of adsorption and reaction on solid surfaces［M］.New York:Wiley－Interscience，1996.

Pesticide Residues Detection in Vegetables Using Molecular Imprinting Technique Combined with SPR

WEI Chuan－ping
(School of Chemistry and Chemical Engineering，Taishan University，Tai＇an，271000，China)

The technology of surface plasmon resonance(SPR)is a kind of physical optical phenomena generated by the optical coupling of metal thin film.By monitoring the changes of SPR，real－time monitoring the intermolecular interaction，has no need of fluorescent labeled.Molecular imprinting is a method that can prepare polymer material with predetermined selectivity towards a certain guest molecule.The selective recognition of molecularly imprinted polymers to the template molecules is obtained through the"memory effect"of the cavities formed during the polymerization process.This paper is based on the explanation of acephate template molecularly imprinted membrane(MIPS)，and then uses the SPR sensor for residue analysis of pesticides in vegetables detection.The satisfactory results were obtained.

surface plasmon resonance sensor;molecular imprinted polymer;pesticide detection

O631;TS207

A

1672－2590(2015)06－0090－04

2015－10－08

泰山學(xué)院青年教師科研基金項(xiàng)目(T12QK07)

魏傳平(1977－)，女，山東萊蕪人，泰山學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院助教.