鄭貴浪 吳家興

近年來，環(huán)境污染問題備受關(guān)注，尤其是大氣污染。其中顆粒物是城市大氣污染的重要物質(zhì)，其管徑大小不一，危害有別。其中，空氣動力學(xué)直徑<2.5 μm的顆粒物被稱為細(xì)顆粒物（PM2.5），與人體健康關(guān)系最為密切。流行病學(xué)調(diào)查研究提示，PM2.5對人體的損害很大，尤其是呼吸系統(tǒng)。近年來，其與心血管疾病關(guān)系的研究較多。越來越多的學(xué)者認(rèn)為，PM2.5不但可增加冠心病、高血壓、糖尿病患者的心血管疾病的發(fā)病率和死亡率，亦可增高健康人群心血管疾病的發(fā)病率和死亡率，甚至誘發(fā)心律失常、心肌缺血乃至心跳聚停等嚴(yán)重情況發(fā)生[1-4]。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，PM2.5可以導(dǎo)致H9C2心肌細(xì)胞線粒體損傷，從而引起活性氧（Reactive oxygen species， ROS）產(chǎn)生增多，ATP合成不足，線粒體膜電位損害，PM2.5導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷與線粒體氧化應(yīng)激過強(qiáng)有關(guān)[5]。

線粒體是體內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要部位，而解偶聯(lián)蛋白（Uncoupling proteins，UCPs）是線粒體內(nèi)膜上能夠通過轉(zhuǎn)運(yùn)H+降低線粒體膜電位蛋白家族，與細(xì)胞內(nèi)的ROS有著密切的關(guān)系[6-7]。線粒體膜電位的輕微改變可以影響ROS的含量。因此，UCPs與ROS的產(chǎn)生關(guān)系密切。在5種UCPs的同類物中，UCP2分布最廣泛。在糖尿病及神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)研究中發(fā)現(xiàn)，UCP2可以減少ROS的產(chǎn)生從而起到保護(hù)作用，其機(jī)制與其通過解偶聯(lián)作用進(jìn)而降低線粒體的膜電位有關(guān)[8-9]。筆者的前期研究也發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾沉默UCP2后，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯增高，提示UCP2的保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激過度增強(qiáng)是心肌細(xì)胞線粒體功能損傷的重要因素。ROS產(chǎn)生過多，保護(hù)因素減弱，如還原型谷胱甘肽（GSH）減少，超氧化物歧化酶（SOD）減少，丙二醛（MDA）增多，在心肌細(xì)胞損傷中作用甚大。然而UCP2對PM2.5導(dǎo)致的氧化應(yīng)激中作用如何，及其對GSH、SOD和MDA影響如何，目前研究較少。本研究就在前期研究的基礎(chǔ)上，將進(jìn)一步揭示UCP2在PM2.5致氧化應(yīng)激損傷心肌過程中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 RNA干擾片段 由上海吉凱基因公司合成2條RNA干擾片段和1條陰性對照RNA干擾片段，進(jìn)行RNA干擾片段的篩選。轉(zhuǎn)染成功后，進(jìn)行RTPCR和Western Blot檢測UCP2基因在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平表達(dá)情況。最后篩選出有效的干擾片段，即：siRNA2序列上游，5′-CCU CAU GAC AGA CGA CCU C dTdT-3′；下游，5′-GAG GUC GUC UGU CAU GAG G dTdT-3′。具體篩選步驟見前期研究（中國醫(yī)藥科學(xué)，2015年第3期）。

1.2 PM2.5配制及心肌細(xì)胞處理 H9C2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保存委員會細(xì)胞庫，用10%小牛血清培養(yǎng)液，在37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；1~3 d更換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞生長至70%左右密度時(shí)，將細(xì)胞隨機(jī)分成三組，分別為NC組，PM2.5組及PM2.5+siRNA組，每組3個(gè)樣本。三組細(xì)胞分別給予常規(guī)的培養(yǎng)基，50 μg/mL的PM2.5培養(yǎng)基，含PM2.5（50 μg/mL）與siRNA（80 nmol/L）的培養(yǎng)基刺激。48 h后檢測相關(guān)指標(biāo)。用PM2.5采樣儀采集PM2.5，超聲震蕩，洗脫顆粒物，冷凍真空干燥成干粉，-20 ℃保存?zhèn)溆?。具體實(shí)驗(yàn)步驟見前期研究[5]。

1.3 ROS的檢測 按照活性氧檢測試劑盒進(jìn)行操作，購自碧云天，貨號S0033。簡要步驟為：各組細(xì)胞經(jīng)過處理后，按照試劑說明用1∶1000無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，然后用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次。用熒光分光光度計(jì)檢測，激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長535 nm[10]。

1.4 GSH、總SOD及MDA的檢測 GSH比色法測定原理：二硫代二咲-硝基苯甲酸與巰基化合物反應(yīng)時(shí)能產(chǎn)生一種黃色化合物，故可進(jìn)行比色定量測定。采用谷胱甘肽測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，貨號為A006。SOD可清除超氧陰離子，從而抑制甲贊的形成，反應(yīng)液藍(lán)色越深，說明SOD酶的活性愈低，反之則酶活性愈高?？係OD的檢測采用總SOD活性檢測試劑盒（NBT法），購自碧云天，產(chǎn)品編號為S0107。過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，故可用分光光度計(jì)對其進(jìn)行量化。MDA的檢測采用丙二醛測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，貨號為A003-1。GSH、總SOD及MDA的檢測均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（s）表示，方差齊時(shí)，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩組間比較采用LSD法分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞ROS和MDA的比較PM2.5+siRNA組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯高于PM2.5組，PM2.5組的ROS明顯高于NC組，三組兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而MDA在PM2.5+siRNA組最高，PM2.5組其次，NC組最低，三組見兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 各組心肌細(xì)胞ROS和MDA含量比較（s）

表1 各組心肌細(xì)胞ROS和MDA含量比較（s）

NC 組 28.8±4.9 39.02±1.55 PM2.5 組 69.2±6.3 68.33±1.96 PM2.5+siRNA組 90.2±6.2 88.44±1.27 F值 86 707 P值 <0.05 <0.05

2.2 各組心肌細(xì)胞GSH含量及總SOD活性的比較PM2.5+siRNA組、PM2.5組和NC組三組之間的GSH含量和總SOD活性比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩指標(biāo)均在PM2.5+siRNA組最低，在NC組最高，PM2.5組位于中間，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表 2。

表2 各組心肌細(xì)胞GSH含量和總SOD活性比較（s）

表2 各組心肌細(xì)胞GSH含量和總SOD活性比較（s）

組別 GSH含量（mg/gprot）總SOD活性（U/mgprot）NC組 767.37±11.03 78.67±3.01 PM2.5組 533.05±10.83 50.37±1.98 PM2.5+siRNA組 421.17±16.90 30.09±2.02 F值 535 313 P值 <0.05 <0.05

3 討論

PM2.5作為大氣污染的重要物質(zhì)，可作為載體吸附有毒重金屬、酸性氧化物、有機(jī)污染物、細(xì)菌和病毒等多種組分，嚴(yán)重危害人體健康。PM2.5可以損害人類的呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)，很多研究均發(fā)現(xiàn)其是心血管疾病的促進(jìn)因素之一[11-12]。深入研究PM2.5導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制，為臨床治療PM2.5所致的遠(yuǎn)期心肌損傷提供基礎(chǔ)研究支持，具有重要意義。

解偶聯(lián)蛋白（UCPs）是線粒體上的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于線粒體陰離子通道家族。UCPs基因有高度的保守性，有6個(gè)家族成員，在人僅表達(dá)UCP1-5。UCP2蛋白廣泛表達(dá)于心肌、肝臟、胰腺以及腦組織等，現(xiàn)在多數(shù)認(rèn)為其是保護(hù)性因素，特別是對胰島細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用研究較多。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞明顯損壞，導(dǎo)致肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）升高，損害線粒體的超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體腫脹，嵴斷裂，從而導(dǎo)致線粒體膜電位的改變[5]。通過RNA干擾技術(shù)沉默UCP2基因的表達(dá)后，心肌細(xì)胞的線粒體產(chǎn)生更多的ROS，并導(dǎo)致ATP含量的顯著下降，進(jìn)一步加重了心肌細(xì)胞的損害。這提示，UCP2在PM2.5致線粒體的損傷中起著保護(hù)性的作用。

活性氧（ROS）是指具有氧化還原潛能的氧衍生物，包括游離的基團(tuán)如：超氧陰離子、羥自由基、次氯酸鹽、過氧亞硝酸鹽和穩(wěn)定的基團(tuán)如過氧化氫。各種細(xì)胞均能產(chǎn)生ROS，其來源包括NAD（P）H氧化酶、線粒體、黃嗓吟氧化酶和環(huán)氧合酶等。生理狀態(tài)下，線粒體產(chǎn)生少量的ROS，對細(xì)胞有利；在某些病理?xiàng)l件下，線粒體產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致細(xì)胞器、DNA以及膜結(jié)構(gòu)等損壞，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死[13]。GSH和SOD是清除機(jī)體過多ROS的重要防御系統(tǒng)。超氧化物通常在SOD的作用下，轉(zhuǎn)化為過氧化氫。GSH與過氧化氫結(jié)合，后者則轉(zhuǎn)化成水，減弱ROS的損害作用。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量的改變可以間接反映ROS對脂質(zhì)的損害作用，受到學(xué)者的廣泛應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)，ROS產(chǎn)生過多，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化加劇，表現(xiàn)為MDA的含量明顯升高；此外ROS的過度增多，消耗了過多的GSH，導(dǎo)致GSH含量明顯下降；同時(shí)也消耗了大量的SOD，減弱了SOD的活性，導(dǎo)致心肌細(xì)胞抗氧化作用體系減弱。這與其他學(xué)者的發(fā)現(xiàn)是相一致的[14-15]。

通過RNA干擾技術(shù)，沉默心肌細(xì)胞UCP2的表達(dá)，筆者發(fā)現(xiàn)，PM2.5導(dǎo)致的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷進(jìn)一步加劇，表現(xiàn)為：ROS含量進(jìn)一步堆積，MDA含量進(jìn)一步升高，從而過度消耗了機(jī)體的抗氧化酶，導(dǎo)致GSH含量明顯降低以及SOD活性明顯下降。而筆者在前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PM2.5可以導(dǎo)致線粒體損傷，而沉默UCP2可以加重線粒體損傷[5]。人為地抑制UCP2的保護(hù)作用，將導(dǎo)致細(xì)胞損傷的進(jìn)一步加劇。這也間接地證明：UCP2在PM2.5導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷中起著保護(hù)性的作用。這可能是UCP2通過調(diào)控線粒體膜電位，進(jìn)而影響氧化應(yīng)激的機(jī)制所介導(dǎo)的。目前，PM2.5對線粒體的影響，國內(nèi)外也有少量研究[16-18]。然而本實(shí)驗(yàn)也存在明顯的不足：（1）僅采用基因沉默的方法，沒有采用基因過表達(dá)方法探討UCP2對氧化應(yīng)激的作用；（2）在指標(biāo)檢測方面，沒有觀察線粒體的形態(tài)，檢測線粒體的膜電位及線粒體生物修復(fù)功能。

綜上所述，PM2.5可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)進(jìn)而損害H9C2心肌細(xì)胞；RNA干擾UCP2基因的表達(dá)后，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷進(jìn)一步加重。這提示，UCP2在PM2.5導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷過程中可能起著保護(hù)性作用。

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