李蕓芳，劉秋菊，李 淼，屈泰龍，黎滿香

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410128)

在當(dāng)前的養(yǎng)豬業(yè)中，豬神經(jīng)癥狀疾病在臨床上面是常見的疾病[1-3]，并且給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。引起豬神經(jīng)癥狀疾病的因素有細(xì)菌性、病毒性以及有機(jī)化學(xué)物質(zhì)等[4-5]。該病在臨床上呈現(xiàn)發(fā)病急、傳染性強(qiáng)和死亡率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展[6]。該病在臨床上通常以一種單獨(dú)出現(xiàn)，有時(shí)是兩種或兩種以上混合感染，以至于加劇疾病的發(fā)生。豬神經(jīng)癥狀疾病在臨床上表現(xiàn)極其相似，只有特殊的病原微生物引起的疾病往往具有示病癥狀，對(duì)臨床診斷具有很大的意義，但是在仔豬疾病中極其普遍并復(fù)雜，特別是在成豬身上這類疾病更易發(fā)生，既可由于特殊病原微生物引起的也可以由于飼養(yǎng)管理不當(dāng)導(dǎo)致的。

本研究采用實(shí)驗(yàn)室的診斷方法對(duì)表現(xiàn)神經(jīng)癥狀的豬內(nèi)臟進(jìn)行病原檢測(cè)，為臨床診斷及疾病診治提供一個(gè)參考。從湖南株洲某豬場(chǎng)臨床上表現(xiàn)神經(jīng)癥狀的發(fā)病豬內(nèi)臟采用平板分區(qū)域劃線法進(jìn)行細(xì)菌分離、PCR鑒定、病毒分離以及組織學(xué)檢查等方法鑒定病原，給疾病的診斷與防治提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)與儀器

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）購(gòu)自Sigma公司；鮮血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州某公司；標(biāo)準(zhǔn)兔血清購(gòu)自杭州某公司；DNAMarker 2000plus購(gòu)自北京某公司；PCR MIX3.0為北京某公司產(chǎn)品；PCR引物由上海某公司合成；1640培養(yǎng)基、0.25%Trypsin-EDTA；新生犢牛血清；配制雙抗用青霉素鈉（80萬(wàn)單位）；配制雙抗用硫酸鏈霉素（100萬(wàn)單位）；PK-15細(xì)胞和ST細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)菌分離

無(wú)菌采集4頭臨床疑似豬鏈球菌感染病死或發(fā)病豬的腦、肺臟和脾臟組織，無(wú)菌條件下用接種環(huán)蘸取組織深部病料，劃線接種于巧克力瓊脂板，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，挑取單菌落放置滴有生理鹽水的載玻片上，涂勻，風(fēng)干，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.3 豬鏈球菌的PCR鑒定及分型檢測(cè)

1.3.1 擴(kuò)增引物：擴(kuò)增所用引物見表1，由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.3.2 PCR模板、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

1.3.2.1 PCR模板

(1)細(xì)菌PCR模板：取100μL菌液過夜培養(yǎng)后離心后棄去上清，用等體積的滅菌PBS洗兩次，最后用等體積的滅菌PBS重懸，于沸水中煮沸10min，離心取上清作為細(xì)菌核酸檢測(cè)的模板，-20℃保存。

(2)病毒PCR模板：取病豬腦組織及肺臟組織0.3～0.5g，加入 0.5mL 的去離子水，研磨 5min，離心取上清，加入等體積的裂解液并震蕩混勻，加入10μL的蛋白酶K，57℃水浴2h后；加入等體積的平衡酚，顛倒混勻后靜置5min，12 000r/min離心5min，轉(zhuǎn)水相于新EP管中；加等體積的氯仿，混勻，12 000r/min離心5min，轉(zhuǎn)水相于新EP管中，加入2.5倍體積70%的酒精，12 000r/min離心5min，棄去上清，重復(fù)洗滌；37℃烘干；50μL去離子水溶解DNA，作為DNA核酸檢測(cè)的模板，-20℃保存。

1.3.2.2 反應(yīng)體系、反應(yīng)條件

（1）反應(yīng)體系（30μL）：15μL mix，14μL 去離子水，F(xiàn)p 0.5μL，Rp 0.5μL，模板 1μL。

（2）反應(yīng)條件：預(yù)變性：94℃ 5min；變性：94℃30s；退火溫度及延伸時(shí)間按照表1進(jìn)行；循環(huán)圈數(shù)33；15℃保存。用0.8%瓊脂糖對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4 病毒分離

稱取病豬腦組織及肺臟組織0.3～0.5g，加入1mL的滅菌 PBS，勻漿 4min，5 000r/min離心10min，吸取上清液，稀釋前在1640培養(yǎng)基中加入1萬(wàn)單位的青霉素鈉和1萬(wàn)單位的硫酸鏈霉素，將稀釋好的樣品于4℃放置24 h，使青霉素和鏈霉素充分發(fā)揮作用。用無(wú)血清的1640培養(yǎng)基按1:10的比例接種于已經(jīng)長(zhǎng)滿60%～80%的PK-15和ST細(xì)胞，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中感作2h，棄去上清液，用含2%NBCS的1640培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，96h后，反復(fù)凍融3次，重新接種新的細(xì)胞板，按以上的方式反復(fù)接種新的細(xì)胞，盲傳至第5代，收集第5代病毒液，對(duì)其進(jìn)行豬腺病毒檢測(cè)。

1.5 組織病理學(xué)觀察

剖檢觀察肺臟有出血點(diǎn)，腦組織未見有明顯的肉眼可見病變。采集病豬的腦組織和肺臟組織用10%福爾馬林固定，按常規(guī)石蠟切片制作方法制作切片[7]，HE染色，觀察組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及鏡檢結(jié)果

菌落觀察結(jié)果為：灰白色、光滑、圓形突起小菌落，有溶血現(xiàn)象；鏡檢結(jié)果為：圓形或卵圓形，排列成鏈狀，疑似為豬鏈球菌。

2.2 豬鏈球菌的PCR鑒定

所得分離株均擴(kuò)增出657bp的片段，與預(yù)期大小一樣，為豬鏈球菌（圖1）

圖1 豬鏈球菌GDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖（M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4:樣本；N：陰性對(duì)照）

2.3 分型引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增

Ⅰ豬肺臟中檢測(cè)結(jié)果：豬肺臟組織內(nèi)檢測(cè)到252bp、346bp的片段，分別為豬鏈球菌7型、9型；Ⅱ豬肺臟組織內(nèi)檢測(cè)到鏈428bp、252bp、346bp片段，分別為豬鏈球菌5型、7型、9型；Ⅲ豬肺臟組織內(nèi)檢測(cè)到428bp、346bp片段，分別為豬鏈球菌5型、9型；Ⅳ豬肺臟組織內(nèi)檢測(cè)到428bp、346bp片段，分別為豬鏈球菌5型、9型；在Ⅱ和Ⅲ豬的腦組織內(nèi)所得分離株擴(kuò)增出346bp的片段，均為豬鏈球菌 9 型；（見圖 2）。

圖2 豬組織鏈球菌分型擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖（編號(hào)：1、2為Ⅰ豬肺臟豬鏈球菌分型；3、4、5為Ⅱ豬肺臟豬鏈球菌分型；6、7為Ⅲ豬肺臟豬鏈球菌分型；8、9為Ⅳ豬肺臟豬鏈球菌分型；10、11號(hào)為Ⅱ、Ⅲ豬腦組織豬鏈球菌分型）

圖3 豬肺臟及腦組織內(nèi)腺病毒檢測(cè)結(jié)果（樣品 1～4：豬肺臟 P：標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性；N：陰性對(duì)照）

2.4 對(duì)病料中 PRV、PCV2、Padv檢測(cè)

對(duì)病豬腦組織及肺臟組織內(nèi)PRV，PCV2檢測(cè)結(jié)為陰性，Padv檢測(cè)在為陽(yáng)性，并分型結(jié)果為Padv3（見圖 3）。

2.5 病毒分離率結(jié)果

豬腺病毒分離為陰性。

2.6 組織病理學(xué)觀察

肺臟組織切片顯示有出現(xiàn)出血點(diǎn)、組織增生及纖維脫落，腦組織血管周圍出現(xiàn)炎性細(xì)胞及出血點(diǎn)（圖 4）。

圖4 A肺組織間隙有出血，組織增生（100×，HE）；B腦組織出血，炎性細(xì)胞（100×，HE）

3 討論

本試驗(yàn)針對(duì)出現(xiàn)豬神經(jīng)癥狀的病原進(jìn)行檢測(cè)，在肺臟和腦組織中分離到豬鏈球菌，進(jìn)一步分型共出11株豬鏈球菌，其中3株為豬鏈球菌5型，2株為豬鏈球菌7型，6株為豬鏈球菌9型。

在對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行顯微病理變化觀察過程中，我們發(fā)現(xiàn)在腦組織的病理切片內(nèi)，血管周圍有血管套現(xiàn)象的存在，這表明病豬曾經(jīng)有過病毒感染。因此我們懷疑該豬群產(chǎn)生神經(jīng)癥狀的的原因并非單單由鏈球菌引起，應(yīng)該是鏈球菌與某種病毒性疾病混合感染導(dǎo)致。我們對(duì)可引起神經(jīng)癥狀的病毒（PCV2，Padv）進(jìn)行核酸檢測(cè)，僅在豬（2/4）的肺臟內(nèi)檢測(cè)到了腺病毒核酸，而PCV2和PRV檢測(cè)均為陰性。進(jìn)一步對(duì)Padv檢測(cè)為陽(yáng)性的豬進(jìn)行病毒分離，細(xì)胞培養(yǎng)盲傳5代之后，在細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)未檢測(cè)到Padv的核酸?？紤]這可能與組織本身的病毒載量太低有關(guān)，因此在培養(yǎng)過程中病毒增殖較難，另外腺病毒在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，其增殖期較長(zhǎng)，可能我們的收毒時(shí)間需要進(jìn)一步的研究。

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