林恒州 張猛 陳保東 黃賢鍵 張秋生 紀(jì)濤 何毅 李維平

·基礎(chǔ)研究·

大鼠中度液壓顱腦損傷后氧化應(yīng)激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究

林恒州1,2張猛2陳保東2黃賢鍵2張秋生2紀(jì)濤2何毅2李維平2

目的探討中度顱腦液壓損傷(TBI)大鼠模型生化指標(biāo)脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)及抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)含量相關(guān)指標(biāo)的變化，并探討其與繼發(fā)性腦損傷間的關(guān)系。方 法將雄 性 Sprague-Daw ley 大 鼠 48 只 按 隨 機(jī) 數(shù) 字 表 法 分 成 中 度 顱 腦 損 傷(mTBI)組 和 假 手 術(shù)(Sham-TBI)組 ，每 組 24 只 。 以 液 壓 中 度 TBI指 標(biāo) 致 傷 mTBI組 ，并 于 傷 后 6 h、24 h 處 死 大 鼠 ，通 過(guò)ELISA免疫酶技術(shù)測(cè)定抗氧化劑GSH和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA在2組的不同表達(dá)，評(píng)價(jià)大鼠顱腦創(chuàng)傷后的氧化應(yīng)激損傷。應(yīng)用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)兩組的 GSH和MDA濃度比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)。結(jié)果m TBI組腦組織見(jiàn)挫傷灶及蛛網(wǎng)膜下腔出血，HE染色后可見(jiàn)神經(jīng)元損傷核固縮，細(xì) 胞 壞 死 呈 空 泡 狀 ，而 Sham-TBI組 未 見(jiàn) 神 經(jīng) 元 損 傷 表 現(xiàn) 。TBI后 m TBI組 中 的 MDA 濃 度 較Sham-TBI組顯 著升高[6 h 時(shí)分別為(8.34±2.03)μg/g 和(3.92±1.20)μg/g，t=6.493，P=0.000]，隨 傷 后時(shí) 間 的延長(zhǎng) ，MDA 的 濃度顯 著 升 高[24 h 時(shí)分 別 為(12.74±2.44)μg/g 和(3.96±1.18)μg/g，t=11.222，P=0.000]；而 TBI后 mTBI組 GSH 濃 度 顯 著 低 于 Sham-TBI組 [6 h 時(shí) 分 別 為 (2.65 ± 0.63)μg/g 和(4.90 ± 0.56)μg/g，t=9.247，P=0.000]，隨 傷 后 時(shí) 間 的 延 長(zhǎng) ，GSH 的 濃 度 顯 著 降 低 [24 h 時(shí) 分 別 為(2.20±0.62)μg/g 和(4.88±0.55)μg/g；t=11.202，P=0.000]。結(jié)論液壓 TBI模型致傷能量能夠測(cè)量，中度閉合性顱腦外傷可導(dǎo)致腦組織病理學(xué)改變和氧化應(yīng)激損傷，且氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)與腦損傷時(shí)間呈正相關(guān)，外傷后早期阻斷氧化應(yīng)激過(guò)程可能起到腦保護(hù)作用。

顱 腦 損 傷 ； 創(chuàng) 傷 學(xué)； Sprague-Daw ley 大鼠； 氧化 性 應(yīng) 激 ； 丙 二醛； 谷胱甘肽

顱 腦 損 傷(traumatic brain injuries，TBI)后 ，繼 發(fā)性損傷對(duì)組織的破壞性往往較原發(fā)性損傷更為廣泛和嚴(yán)重，由自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化引起的氧化應(yīng)激損傷是繼發(fā)性損傷中已經(jīng)被廣泛認(rèn)同的病理生理機(jī)制之一。TBI后機(jī)體短時(shí)間內(nèi)即可迅速產(chǎn)生大量的自由基，主要表現(xiàn)為對(duì)各種生物大分子的攻擊，造成了機(jī)體嚴(yán)重的損害。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠液壓中度閉合性TBI模型，具有良好穩(wěn)定性及重復(fù)性，為后繼研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)觀察TBI后機(jī)體病理學(xué)及氧自由基改變。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄 性 Sprague-Daw ley 大 鼠 共 48 只 ，體 重 均 為250～280 g；由中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組：中度損傷組(m TBI，24 只)，假損傷組(Sham-TBI組，24 只)。所有大鼠的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)方案都遵從于國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例，并且獲得了深圳巿第二人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心審批。實(shí)驗(yàn)大鼠于動(dòng)物室分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度 22～25℃、濕度(55±5)%、明暗交替光照 環(huán) 境(12 h/12 h)，投 清 潔 級(jí) 標(biāo) 準(zhǔn) 顆 粒 飼 料 ，自 由 飲用清潔用水。本實(shí)驗(yàn)所涉及動(dòng)物的處理均經(jīng)過(guò)深圳市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、儀器

液壓腦損傷打擊儀由美國(guó)維珍尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程部制造。液壓裝置由圓形液柱(長(zhǎng)60 cm，直 徑 為 41.5 cm)、電打 擊 架 、示 波 器 和 壓 力 傳感器組成。圓形液柱是一個(gè)水平放置，內(nèi)裝滿37℃生理鹽水密封的聚乙烯有機(jī)玻璃圓筒，圓筒內(nèi)的一端是用橡皮全覆蓋的有機(jī)玻璃活塞，另一端接打擊管和壓力傳感器，并連接一個(gè)內(nèi)徑為2.6mm的圓形向外開口，此開口連接大鼠的硬腦膜。液壓是通過(guò)一個(gè)金屬擺錘打擊活塞后產(chǎn)生的壓力，引起少量生理鹽水短暫向一端移動(dòng)，通過(guò)打擊管內(nèi)的液體傳導(dǎo)到顱腔，作用于顱內(nèi)組織，造成腦損傷，壓力傳感器記錄此脈沖式壓力并通過(guò)示波器顯示測(cè)量壓力的峰值，用大氣壓(atm)來(lái)表示。通過(guò)調(diào)整擺錘的高度來(lái)調(diào)節(jié)壓力大小。本實(shí)驗(yàn)致傷壓力(1.5±0.2)atm。外置壓力傳感器示波器；68001動(dòng)物腦立體定向儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)(RWD407/510F 型號(hào)，深圳瑞沃德生命科技有限公司)；G3F 多參數(shù)監(jiān)護(hù)儀(深圳杰納瑞生命科技有限公司)；液壓傷打擊連接頭(由 50m l注射器頭端切割出，保留塑料部分，內(nèi)徑約 2.6mm)；手術(shù)顯微鏡(LH-1 型號(hào)，徐州利華電子科技發(fā)展有限公司)；固定螺釘(植入于顱骨上，用于固定打擊管，直徑為0.8mm，長(zhǎng)度為 5mm)；腦溫儀(MDP-80 型號(hào)，美國(guó)加利福尼亞州斯坦福大學(xué)Omega工程研究院)。

三、試劑

100 g/L 水合氯醛(深 圳 巿 兒 童醫(yī)院制劑室)；大鼠丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA 檢測(cè)試劑盒，大鼠 谷胱甘肽(glutathione，GSH)ELISA 檢測(cè)試劑盒；戊巴比妥(上海江萊生物科技有限公司)；多聚甲醛(天津博迪化工股份有限公司)；蔗糖(天津博迪化工股份有限公司)。

四、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

大鼠按照分組制作m TBI模型，各組在接受液壓致傷前24 h進(jìn)行手術(shù)埋入液壓致傷連接管，mTBI組接受(1.5±0.2)atm 壓力的液壓傷，而 Sham-TBI組則行與m TBI組所有相同的麻醉和手術(shù)，不做液壓損傷。處理后按上述所提供條件飼養(yǎng)，分別于致傷后6 h、24 h隨機(jī)處死，每個(gè)時(shí)間段每組均處死6只。

五、腦標(biāo)本采集和切片

大鼠 在 各 預(yù)設(shè)的 時(shí) 間 點(diǎn)用 100 g/L 水 合 氯 醛腹腔注射麻醉(300mg/kg)后，立即緊貼枕骨孔處離斷鼠頭，用小咬骨鉗沿枕骨大孔起逐塊咬除枕、頂、額骨，離斷顱底神經(jīng)，取出全腦組織，標(biāo)本取樣在腦損傷灶區(qū)，標(biāo)本腦組織浸入40 g/L多聚甲醛內(nèi)于4℃固定48 h后，再修成厚4mm塊狀，常規(guī)用酒精脫水，石臘包埋，作5 μm冠狀切片，行HE染色，顯微鏡下觀察。擬進(jìn)行生化指標(biāo)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA及抗氧化劑GSH及檢測(cè)的大鼠，經(jīng)左心室穿刺插管快速灌注 200m l冷凍生理鹽水(4℃)后，立即斷頭取腦。

六、大鼠MDA、GSH檢測(cè)

mTBI組及 Sham-TBI組腦組織標(biāo)本取出后準(zhǔn)確稱重，各加入適量生理鹽水，在冰浴中用電動(dòng)攪拌 機(jī) 制 成 腦 組 織 勻 漿 ，低 溫 高 速(離 心 半 徑 5 cm，3 000 r/m in，4℃)離心 10m in 后取上清液 1m l。采用ELISA 法檢測(cè)。在 Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光度(A)值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

兩組的 GSH 和 MDA 濃度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表 示 ，應(yīng) 用 SPSS 19.0 統(tǒng) 計(jì) 軟 件 對(duì) 不 同 時(shí) 間 點(diǎn) 采 用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、HE染色后光鏡觀察

m TBI組HE染色后觀察，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)見(jiàn)出血，神經(jīng)元損傷核固縮，細(xì)胞壞死呈空泡狀，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及組織間隙水腫，出血灶周邊血管有擴(kuò)張，水腫帶可見(jiàn)中性粒細(xì)胞積聚(圖 1A)。

Sham-TBI組HE染色后觀察，腦細(xì)胞染色均勻，無(wú)腫脹，無(wú)充血及出血灶，腦組織結(jié)構(gòu)正常，腦血管無(wú)擴(kuò)張，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖 1B)。

二 、ELISA檢 測(cè) 致 傷 后 6 h、24 h大 鼠 腦 組 織 中MDA及GSH結(jié)果

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書配置不同濃度的樣品(表 1)，測(cè)量 A450后，繪制MDA 及 GSH 標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 2、3)。

MDA 檢 測(cè) 結(jié) 果 顯 示 ，6 h 時(shí) m TBI組 為(8.34±2.03)μg/g，Sham-TBI組為(3.92±1.20)μg/g，差異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義(t=6.493，P=0.000) ；24 h 時(shí) m TBI組 為 (12.74 ± 2.44)μg/g，Sham-TBI組 為 (3.96 ± 1.18) μg/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(t=11.222，P=0.000，圖 4)。

圖1 腦損傷大鼠腦組織病理切片(HE染色 ×50)Fig.1 Pathologic section of brain tissue of craniocerebral injury rats,HE staining

表1 不同濃度MDA及GSH的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Tab.1 Standard curve dataofMDA and GSH in differentconsistency

GSH 檢 測(cè) 結(jié) 果 顯 示 ，6 h 時(shí) m TBI 組 為(2.65±0.63)μg/g，Sham-TBI組為(4.90±0.56)μg/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.247，P=0.000)；24 h 時(shí) mTBI組為(2.20±0.62)μg/g，Sham-TBI組為(4.88±0.55)μg/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.202，P=0.000，圖 5)。

討論

原發(fā)性TBI在醫(yī)療上不能干預(yù)，但隨之而來(lái)的繼發(fā)性腦損傷對(duì)腦組織的破壞性較原發(fā)性損傷更為廣泛和嚴(yán)重[1]。氧化應(yīng)激指機(jī)體在病理狀態(tài)下，體 內(nèi) 高 活 性 分 子 如 活 性 氧 自 由 基(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過(guò)多，氧化程度超出氧化物的清除水平，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。研究表明氧化應(yīng)激在TBI的同時(shí)出現(xiàn)，也是 TBI后神經(jīng)元、血管損傷的主要病理生理基礎(chǔ)[2]。

圖2 丙二醛標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線Fig.2 Standard curve of malondialdehyde

圖3 谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線Fig.3 Standard curve of glutathione

圖4 腦損傷大鼠MDA檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The resultsofMDA testof craniocerebral injury rats

圖5 腦損傷大鼠GSH檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The resultsof GSH testof craniocerebral injury rats

中樞神經(jīng)系統(tǒng)含有豐富脂質(zhì)，對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)非常敏感，脂質(zhì)氧化后形成的活性羰基類物質(zhì)主要是一些不飽和醛，這些活性羰基分子本身含有羰基，如：4-羥基壬烯醛、丙烯醛、MDA，這些活性羰基分子能與蛋白質(zhì)側(cè)鏈的組氨酸、賴氨酸、半胱氨酸等氨基酸的殘基共價(jià)結(jié)合，從而造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的異常[3]。蛋白質(zhì)羰基化能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的喪失和修飾蛋白質(zhì)的水解[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí) TBI后脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量明顯增加，羰基蛋白水平亦明顯提高[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)研究說(shuō)明TBI后脂質(zhì)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。TBI動(dòng)物模型研究證實(shí)，使用抗氧化劑能夠減輕創(chuàng)傷后繼發(fā) TBI[7]。GSH 含有的特異活潑巰基結(jié)構(gòu)-SH，易被氧化脫氫，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，使其成為體內(nèi)主要的自由基清除劑。TBI后脂質(zhì)過(guò)氧化自由基反應(yīng)增強(qiáng)，而由氧自由基介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是引起繼發(fā)性腦損傷加重的一個(gè)重要因素。

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Experimental study on oxidative stress in rats after moderate fluid-percussion brain injury

Lin Hengzhou1,2,Zhang Meng2,Chen Baodong2,Huang Xianjian2,Zhang Qiusheng2,Ji Tao2,He Yi2, LiWeiping2.1Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,China;2Department ofNeurosurgery,The Second People’sHospitalofShenzhen,Shenzhen 518037,China

LiWeiping,Email:Liweiping60@126.com

Objective To study the change of biochemical index ofmalondialdehyde(MDA) and glutathione(GSH)ofmoderate traumatic brain injury(TBI)ratsmodel,which are the end products of lipid oxidation and antioxidant,respectively.To explore the relationship between these two chemicals and secondary brain injury.Methods 48 adultmale Sprague-Daw ley ratswere random ly assigned to 2 groups:moderate-TBI(m TBI,n=24)group and sham-TBI(sham,n=24)group. Hydraulic moderate TBI index was induced to mTBIgroup.The rats were killed 6 h and 24 h after injured respectively,the levels of MDA and GSH were examined by ELISA enzymictechnology to analyze the different expression among 2 groups and to evaluate the oxidative stress injury of the rats after traumatic brain injury.The data was analyzed by SPSS 19.0 statistical analysis software,the concentration of GSH and MDA among 2 groupswas tested by independent-samples t Test.Results Brain contusion and subarachnoid hemorrhage could be observed in m TBI rats,in brain sectionsw ith HE staining,nuclear pyknosis and vesicular neurons could be detected.However,no similar injurycould be found in sham group.The concentration of MDA inmTBIgroup was significantly higher than that in sham group(in 6 h,level of mTBI 8.34 ± 2.03μg/g,level of sham 3.92 ± 1.20μg/g,t=6.493, P=0.000),and the concentration displayed a significantupregulated trend as timewentby post TBI(in 24 h,level of mTBI 12.74 ± 2.44μg/g,level of sham 3.96 ± 1.18μg/g,t=11.222,P=0.000).The concentration of GSH inm TBIgroup was significantly lower than that in sham group(in 6 h,level of m TBI 2.65 ± 0.63μg/g,level of sham 4.90 ± 0.56μg/g,t=9.247,P=0.000),and the concentration displayed a significant downtrend as time went by post TBI(in 24 h,level ofmTBI 2.20 ± 0.62μg/g, level of sham 4.88±0.55μg/g,t=11.202,P=0.000). Conclusions The injury level of hydraulic TBI model can be evaluated,moderate closed brain trauma resulted in brain tissue pathological changesand oxidative stress injury.The index of oxidative stresswas correlated w ith the injury period.Blockage of the process of the oxidative stress in the early stage post TBI may play an important role in neuroprotectiveeffect.

Traumatic brain injury; Traumatology; Sprague-Daw ley rats; Oxidative stress; Malondialdehyde; Glutathione

2014-12-01)

(本文編輯：楊藝)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.01.003

深圳巿協(xié)同創(chuàng)新科技計(jì)劃國(guó)際合作研究項(xiàng)目(20120608210932744)

510182 廣州，廣州醫(yī)科大學(xué)1；518035 深圳，深圳巿第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科2

李維平，Email：Liweiping60@126.com

林恒州,張猛,陳保東,等 .大鼠中度液壓顱腦損傷后氧化應(yīng)激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1 (1):7-10.