支 良，陳 鵬，李朝戰(zhàn)，李昌亮，關(guān) 興，褚 朋，阿永俊*

（1.棗莊市立醫(yī)院普外科，山東棗莊 277000;2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰一科，云南昆明 650101）

恒河猴骨髓來源未成熟樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

支 良1，2，陳 鵬2，李朝戰(zhàn)1，李昌亮1，關(guān) 興1，褚 朋1，阿永俊2*

（1.棗莊市立醫(yī)院普外科，山東棗莊 277000;2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰一科，云南昆明 650101）

目的 建立一種體外誘導(dǎo)恒河猴骨髓CD34+細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞（DC）的方法，并對其細(xì)胞形態(tài)及表面標(biāo)志進(jìn)行鑒定。方法 用免疫磁珠分選系統(tǒng)（MACS）分選恒河猴骨髓細(xì)胞，收集高純度的CD34+造血干細(xì)胞;加入重組粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和白細(xì)胞介素4（IL-4）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α），誘導(dǎo)其分化為骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，并采用電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。用樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志CD1a及成熟樹突狀細(xì)胞（mDC）表面標(biāo)志CD83流式抗體染色后分析。結(jié)果 細(xì)胞因子誘導(dǎo)6d后成功培養(yǎng)出表面呈絨毛狀和樹枝狀突起的典型DC樣細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示92.35%的細(xì)胞為DC，27.61%的細(xì)胞為mDC。結(jié)論 用此方法可在體外培養(yǎng)出高純度且典型的恒河猴骨髓源性未成熟樹突狀細(xì)胞（imDC），為進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性及功能奠定了基礎(chǔ)。

恒河猴;未成熟樹突狀細(xì)胞;免疫耐受

*通信作者（corresponding author）:997991476～qq.com

樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）是目前體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職性抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），根據(jù)DC成熟狀態(tài)的不同分為未成熟DC（immature dendritic cell，imDC）和成熟 DC（mature dendritic cell，mDC），DC誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答或者免疫耐受，取決于其所處的成熟狀態(tài)［1］。imDC誘導(dǎo)免疫耐受，mDC誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)［2］。在不使用免疫抑制劑的情況下，imDC能夠誘導(dǎo)移植器官產(chǎn)生免疫耐受而長期存活，認(rèn)為是一種防治移植排斥反應(yīng)的有效方法［3］。imDC用于誘導(dǎo)器官移植免疫耐受已成為目前研究的熱點(diǎn)和重要發(fā)展方向。

由于DC在體內(nèi)散在分布且含量低，在動物和人外周血中低于有核細(xì)胞數(shù)的0.1%，尚不足白細(xì)胞總量的1%，這已成為系統(tǒng)研究DC的生物學(xué)功能所面臨的主要問題。由于DC主要來源于骨髓的CD34+造血干細(xì)胞，故如何在體外誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞增殖分化為DC，獲得一定量有功能的DC是深入研究其生物學(xué)功能的關(guān)鍵，也是研究者目前亟待解決的問題［4］。非人靈長類動物在形態(tài)學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)上是與人類最為接近的實驗動物，因此建立以恒河猴為動物模型的DC研究平臺具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

10周歲中國雄性恒河猴（昆明動物研究所）。

1.2 試劑

猴淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-Hypaque）（天津市灝洋生物制品公司）;RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司）;GM-CSF（Peprotech 公司）;TNF-α、和 IL-4（R＆D 公司）;免疫磁珠試劑盒包括 I抗（Anti-Human PECD34）、Ⅱ抗（PE selection cocktail）、納米磁珠、磁極（Stem Cell公司）;FITC抗人 CD83和FITC IgG1 k Isotype Control（BD 公司）;Mouse monoclonal［NA/34］to CD1a（Phycoerythrin）和 Mouse IgG2a-Isotype Control（Abcam公司）。

1.3 磁珠分選CD34+細(xì)胞

用免疫磁珠法（magnetic activated cell sorting，MACS）分離恒河猴骨髓CD34+細(xì)胞，首先用猴淋巴細(xì)胞分離液根據(jù)密度梯度離心法，分離骨髓中單個核細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)移到新的離心管內(nèi)備用。再按CD34 MicroBeads humanmonocyte kit操作說明，分離收集CD34+細(xì)胞，并取出一部分做流式細(xì)胞術(shù)鑒定。

1.4 誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞分化為DC

將分離得到的CD34+細(xì)胞使用細(xì)胞計數(shù)板，按1×106個/1.5 mL種入12孔板中，添加含10%FCS的1640完全培養(yǎng)液和細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4，其濃度分別為0.1 mg/L和0.05 mg/L，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的溫箱內(nèi)培養(yǎng)。換液前于顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況，半量換液1次/2 d，保持細(xì)胞因子終濃度一致。在培養(yǎng)的第6天，一部分用于做流式細(xì)胞術(shù)分析和電鏡觀察，另一部分加入 TNF-α（0.1 mg/L）、刺激2 d后成熟。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)的細(xì)胞

將每孔內(nèi)的細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管內(nèi)，800 r/min離心10 min，棄上清，取10%FCS的1640完全培養(yǎng)基將沉淀懸起并計數(shù)，4×104個細(xì)胞/300 μL，轉(zhuǎn)入 500 μL 離心管內(nèi)，分別加入 10 μL 小鼠單克?。跱A/34］to CD1a，或 20 μL 小鼠 IgG2a同型對照，或20 μL FITC 鼠抗人 CD83，或20 μL FITC小鼠IgG1 k同型對照;并充分混勻常溫下染色20 min，以利于抗原抗體結(jié)合，將染色后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移于流式細(xì)胞術(shù)測定管，用流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.6 細(xì)胞的電鏡觀察分析

1.6.1 掃描電鏡:分別收集誘導(dǎo)的imDC和mDC，加入3.5%戊二醛固定液，放入4℃冰箱內(nèi)固定2 h以上。用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗后再次用1%鋨酸固定2 h。乙醇脫水后，換醋酸異戊酯15 min。采用冷凍干燥后用真空鍍膜儀鍍膜。掃描電鏡下觀察。

1.6.2 透射電鏡:分別收集誘導(dǎo)的imDC和mDC，加入2.5%戊二醛固定液，放入4℃冰箱內(nèi)24 h。將培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液于1 500 r/min離心10 min，棄上清后加入1.0 mL 10%FCS的1640培養(yǎng)基，充分吹打混勻，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管內(nèi)，1 500 r/min離心10 min。將管內(nèi)上清全部吸出，加入2.5%戊二醛固定液約400 μL，勿吹散細(xì)胞團(tuán)，放4℃冰箱內(nèi)固定2 h。使用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗3～5次。再將樣品置于1%四氧化鋨溶液中固定2 h;用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗3～5次，置于緩沖液中過夜。將樣品放入丙酮中進(jìn)行脫水處理后;將樣品依次放入環(huán)氧樹脂與丙酮1∶2、1∶1溶液及純環(huán)氧樹脂中進(jìn)行浸透處理，每次2 h。將樣品放入模具，加入環(huán)氧樹脂，置于溫箱，40℃ 12～20 h，60℃ 48～60 h進(jìn)行包埋處理。取出包埋塊，切片處理。將超薄切片進(jìn)行染色處理后蒸餾水沖洗;完成后靜置待切片干燥后透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 MACS磁珠分選得到高純度的CD34+造血干細(xì)胞

樣本1磁珠分選前（圖1A）后（圖1B）細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，分選前 CD34+細(xì)胞純度為12.45%，分選后純度達(dá)到91.59%;樣本2分選前（圖2A）后（圖2 B）細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，分選后CD34+細(xì)胞純度達(dá)到85.89%。

2.2 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定得到大量高純度imDC

圖1 磁珠分選前（A）后（B）細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析Fig 1 Flow cytometry analysis of cells before（A）and after（B）magnetic bead separation

圖2 磁珠分選前（A）后（B）細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析Fig 2 Flow cytometry analysis of cells before（A）and after（B）magnetic bead separation

2.2.1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定誘導(dǎo)后的細(xì)胞為DC:陰性組中陰性細(xì)胞的百分含量為22.91%（圖3A）;陽性組CD1a+DC的百分含量為92.35%（圖3B），CD1a是DC表面特異性標(biāo)志，其陽性細(xì)胞數(shù)的百分含量代表恒河猴DC的純度，即DC的純度為92.35%。

2.2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定mDC:CD83陰性組細(xì)胞中百分含量為9.24%（圖4 A）;陽性組CD83+DC的百分含量為27.61%（圖4 B）;CD83為mDC的表面標(biāo)志，即大多數(shù)DC為imDC。

2.3 電鏡觀察所見為典型的DC

2.3.1 掃描電鏡結(jié)果imDC與mDC:imDC表面有皺褶和較少的毛刺狀、絨毛狀突起（圖5A）;mDC表面大量樹枝狀細(xì)長突起（圖5B）。

2.3.2 透射電鏡下imDC與mDC形態(tài):imDC形態(tài)較規(guī)則，突起較少，胞質(zhì)內(nèi)有許多吞引泡和多泡體（圖6A）;而mDC細(xì)胞表面有大量微絨毛，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核明顯，核膜結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)中有大量深色、高電子密度的細(xì)胞器，可見少量線粒體（圖6B）。

3 討論

DC是一種具有刺激初次免疫應(yīng)答功能的專職抗原提呈細(xì)胞，是連接固有免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的紐帶［5］。imDC具有攝取和處理抗原的能力，存在于機(jī)體除腦以外的所有組織。當(dāng)接觸抗原或炎性介質(zhì)后imDC可發(fā)育分化為mDC，遷移至T細(xì)胞活化依賴區(qū)發(fā)揮抗原提呈功能［6］。同時，在誘導(dǎo)免疫耐受調(diào)節(jié)中也起著重要的生物學(xué)作用。目前，體外誘導(dǎo)DC擴(kuò)增的方法較多，多數(shù)方法采用細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)DC前體細(xì)胞擴(kuò)增。由于DC的前體細(xì)胞不同，刺激前體細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子亦不同。故不同來源的前體細(xì)胞及不同的細(xì)胞因子所培養(yǎng)的DC在功能上有一定的差異。由骨髓來源的CD34+造血干細(xì)胞擴(kuò)增得到的DC比外周血來源CD34+細(xì)胞擴(kuò)增得到的DC成熟的晚［7］，而且刺激T細(xì)胞的增殖能力較外周血來源的DC弱。因此本研究用高純度的恒河猴骨髓CD34+細(xì)胞作DC前體細(xì)胞，更適合培養(yǎng)imDC。細(xì)胞因子在體外擴(kuò)增DC的過程中發(fā)揮重要作用。實驗中GM-CSF+IL-4誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞分化為DC，其中GM-CSF因子最為重要，既能誘導(dǎo)DC前體細(xì)胞增殖，又能促進(jìn)DC分化和延長 DC 壽命［8］。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定誘導(dǎo)的細(xì)胞Fig 3 Cultured DCs were identified by flow cytometry

圖4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定誘導(dǎo)的細(xì)胞Fig 4 Cultured DCs were identified by flow cytometry

圖5 掃描電鏡觀察imDC與mDCFig 5 ImDC and mDC were observed by scanning electron microscopy（×2 500）

圖6 透射電鏡觀察imDC與mDCFig 6 ImDC and mDC were observed by transmission electron microscopy（×1 000）

本實驗采用恒河猴骨髓CD34+造血干細(xì)胞體外原代培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)了大量骨髓源性imDC，為進(jìn)一步研究其特性和功能提供實驗材料，且培養(yǎng)的imDC具有較高的純度并保持體內(nèi)DC所具有的生物學(xué)特性。這為imDC的體外培養(yǎng)提供了有效的方法，也為在細(xì)胞水平研究DC的表型、功能及免疫治療等提供可靠的體外實驗材料，為最終研究恒河猴肝移植免疫耐受又向前邁出了一步。恒河猴是與人類最為接近的實驗動物，建立其肝移植免疫耐受的實驗平臺，為將來在臨床上解決同種異體移植排斥反應(yīng)誘導(dǎo)受者產(chǎn)生針對移植物的免疫耐受［9］，使移植受體能夠避免長期服用免疫抑制劑所帶來的機(jī)會感染和腫瘤的危險，將有非常重要的意義。

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Culture and identification of immature dendritic cells from rhesus monkey myeloid

ZHI Liang1，2，CHEN Peng2，LI Chao-zhan1，LI Chang-liang1，GUAN Xing1，CHU Peng1，A Yong-jun2*

（1.Dept.of General Surgery，Zaozhuang Municipal Hospital，Zaozhuang 277000;2.Dept.of 1st Hepatobiliary Pancreatic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101，China）

ObjectiveTo develop a method for culturing dendritic cells（DC）from rhesus monkey bone marrow CD34+cells，and identify the cells by morphological observation and cell surface marker detection.MethodsTo screen rhesus monkey bone marrow cells using a magnetic activated cell sorting（MACS）system then to collect highly purified CD34+hematopoietic stem cells.Recombinant granulocyte macrophage colony stimulating factor（GM-CSF），interleukin-4（IL-4）and tumor necrosis factor-α （TNF-α）were applied to isolate CD34+hematopoietic stem cells to induce bone marrow-derived DCs.Morphological change of cells was observed under an electron microscope，and cell surface molecules were detected using flow cytometry after cells were stained with DC surface marker CD1a and mature DC surface marker CD83.ResultsTypical DCs with surface villous and dendritic protrusions were identified 6 days after cytokine treatment.92.35%of the cultured cells were DC and 27.61%of the cultured cells were mature DCs（mDC）.ConclusionsWe have established a method for culturing highly purified rhesus monkey bone marrowderived immature DCs（imDC），which may function as a technine plateform to support research in future.

rhesus monkey;immature dendritic cells;immune tolerance

Q813.1+1

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.019

1001-6325（2015）09-1243-06

2014-12-14

2015-04-28

國家自然科學(xué)基金（30960378，81160069）;內(nèi)設(shè)研究機(jī)構(gòu)云南省衛(wèi)生廳研究項目（Z011WS0084）