郝燕捷，陳 瑩，薛 林，韓曉寧，丁文惠*

（北京大學(xué)第一醫(yī)院1.心內(nèi)科;2.風(fēng)濕免疫科，北京 100034）

IL-10抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化

郝燕捷1，2，陳 瑩1，薛 林1，韓曉寧1，丁文惠1*

（北京大學(xué)第一醫(yī)院1.心內(nèi)科;2.風(fēng)濕免疫科，北京 100034）

目的 研究白細(xì)胞介素10（IL-10）對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）誘導(dǎo)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞（CFBs）增殖、向肌樣成纖維細(xì)胞（MyoFbs）轉(zhuǎn)化的影響及其作用通路。方法 原代培養(yǎng)SD乳鼠CFBs，應(yīng)用第2～4代，分為對(duì)照組、IL-10刺激組、TGF-β1刺激組、IL-10與TGF-β1共同刺激組（IL-10預(yù)處理后加入TGF-β1）。每個(gè)刺激組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。四氮唑鹽比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色及Western blot檢測(cè)α-平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和ERK1/2、P38激酶磷酸化蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，TGF-β1（10 μg/L）能顯著刺激 CFBs增殖及表型轉(zhuǎn)化（α-SMA 表達(dá)）（P＜0.01），用 IL-10（10、50和100 μg/L）預(yù)處理后，TGF-β1誘導(dǎo)的CFBs增殖及α-SMA表達(dá)呈劑量依賴(lài)性被顯著抑制（P＜0.01）。TGF-β1能顯著刺激CFBs內(nèi)ERK1/2和P38磷酸化水平（P＜0.01），而IL-10（100 μg/L）預(yù)處理后，TGF-β1誘導(dǎo)的ERK1/2和P38激酶磷酸化被明顯抑制（ERK1/2:P＜0.05;P38:P＜0.01）。結(jié)論 IL-10可能通過(guò)抑制ERK1/2和P38激酶活化抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的CFBs增殖及向MyoFbs轉(zhuǎn)化。

白細(xì)胞介素-10;心臟成纖維細(xì)胞;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶;P38激酶

在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后的心室重構(gòu)發(fā)展過(guò)程中，心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFBs）增殖、向肌樣成纖維細(xì)胞（myofibroblasts，MyoFbs）轉(zhuǎn)化、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)是重要的病理機(jī)制之一。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）能夠促進(jìn) CFBs 增殖及表型轉(zhuǎn)化，是AMI后左室重構(gòu)重要促進(jìn)因子［1］。

白介素10（interleukin-10，IL-10）是一種多功能性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，在抑制纖維化方面也有重要作用，它能拮抗 TGF-β1 促進(jìn)肝臟纖維化［2］。在A(yíng)MI患者的血漿及心肌組織中IL-10有高表達(dá)，而且能夠改善AMI大鼠的左室重構(gòu)［3］。IL-10能否抑制CFBs的增殖/表型轉(zhuǎn)化及拮抗TGF-β1的作用，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）超家族成員ERK1/2及P38在TGF-β1誘導(dǎo)的CFBs表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用［4］，IL-10能夠抑制 MAPKs通路［5］。本研究觀(guān)察 IL-10 對(duì) TGF-β1 誘導(dǎo)的大鼠CFBs增殖及向MyoFbs表型轉(zhuǎn)化的影響，及是否通過(guò)ERK1/2及P38通路調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用清潔級(jí)SD乳鼠［北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SYXK（京）2014-0010］;重組大鼠 IL-10及重組人 TGF-β1（Peprotech公司）;小鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）單克隆抗體（武漢博士德公司）;小鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒PV-6001/6002 PowerVisionTM（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;兔抗大鼠ERK1/2、磷酸化ERK1/2、P38和磷酸化 P38多克隆抗體（Cell Signaling公司）;ERK1/2及 P38的抑制劑 PD98059和SB203580（Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)SD乳鼠CFBs及鑒定:將乳鼠心室剪碎，0.1%胰蛋白酶消化、離心、收集細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)液中，差速貼壁法培養(yǎng)30 min，貼壁的主要是心臟成纖維細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞接近匯合時(shí)以1∶3傳代。實(shí)驗(yàn)采用第2～4代。

免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定:Vimentin染色陽(yáng)性而α-SMA染色陰性證實(shí)為成纖維細(xì)胞。

1.2.2 IL-10對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFBs增殖及表型轉(zhuǎn)化的影響:實(shí)驗(yàn)分組:1）對(duì)照組（control）:培養(yǎng)過(guò)程中不加任何刺激劑;2）IL-10刺激組（10、50和100 μg/L3 個(gè)亞組）;3）TGF-β1 刺激組:10 μg/L;4）IL-10（10、50 和 100 μg/L）預(yù)處理 1 h 后再加TGF-β1（10 μg/L）共同刺激組。48 h 后進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)。

MTT比色法:參照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行。

免疫細(xì)胞化學(xué)染色法測(cè)定PCNA及α-SMA表達(dá):按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。在MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上IL-10選取100 μg/L劑量。染色之后，每張爬片在400倍倒置相差顯微鏡下拍攝4個(gè)無(wú)重復(fù)視野，用Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)細(xì)胞核呈棕色的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞核及所有細(xì)胞核，計(jì)算增殖指數(shù):增殖指數(shù)（proliferation index）（%）=（PCNA陽(yáng)性染色細(xì)胞核數(shù)/所有細(xì)胞核數(shù)）×100%。計(jì)數(shù)胞質(zhì)染成黃色的α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及所有細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化指數(shù):轉(zhuǎn)化指數(shù)（transformation index）=（α-SMA陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)/所有細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.3 TGF-β1對(duì) ERK1/2、P38 磷酸化的影響:實(shí)驗(yàn)分組:1）對(duì)照組（control）:即0 min組;2）TGF-β1刺激組:分別刺激 30 min及 1、2、4、8和 24 h。Western blot測(cè)定ERK1/2及 P38總蛋白及磷酸化表達(dá)，根據(jù)文獻(xiàn)［5］進(jìn)行。

1.2.4 應(yīng)用ERK1/2、P38激酶阻斷劑后TGF-β1對(duì)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響:實(shí)驗(yàn)分組:1）對(duì)照組（control）;2）TGF-β1刺激組;3）PD98059（ERK1/2阻斷劑）組:50 μmol/L;4）SB203580（P38阻斷劑）組:20 μmol/L;5）TGF-β1+PD98059 組:先 用PD98059（50 μmol/L）預(yù)處理 1 h 后再與 TGF-β1 共同刺激;6）TGF-β1+SB203580組:先用預(yù)處理SB203580（20 μmol/L）1 h 后再與 TGF-β1 共同刺激。刺激24 h后收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。Western blot測(cè)定 α-SMA蛋白表達(dá)，結(jié)果以相對(duì)α-SMA表達(dá)（α-SMA/β-actin吸光度比值）表示。

1.2.5 IL-10 對(duì) TGF-β1 活化的 ERK1/2、P38 激酶的影響:實(shí)驗(yàn)分組:1）對(duì)照組（control）;2）IL-10刺激組:100 μg/L;3）TGF-β1 刺激組;4）IL-10（100 μg/L）預(yù)處理1 h后再TGF-β1共同刺激組。Western blot測(cè)定ERK1/2及P38蛋白表達(dá)。ERK1/2組于TGF-β1刺激4 h后收集蛋白;P38組于進(jìn)行TGF-β1刺激2 h后收集蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果以相對(duì)ERK1/2或P38表達(dá)（ERK1/2或P38/β-actin吸光度比值）表示。

上述實(shí)驗(yàn)n=3，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 IL-10抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFBs增殖

2.1.1 MTT結(jié)果:TGF-β1組 A值顯著增加（P＜0.01），用IL-10與TGF-β1共同刺激后，細(xì)胞增殖較單純 TGF-β1 刺激組下降（10 μg/L 及 50 μg/L 組P＜0.05;100 μg/L組P＜0.01），抑制作用隨IL-10濃度增加而有所增強(qiáng)（圖1）。在不加用TGF-β1而單獨(dú)用IL-10刺激的狀態(tài)下，各個(gè)IL-10劑量組細(xì)胞增殖較對(duì)照組均無(wú)明顯變化（各組間比較P＞0.05，圖2）。

2.1.2 PCNA染色結(jié)果:TGF-β1組細(xì)胞增殖指數(shù)顯著增加（P＜ 0.01），IL-10（100μg/L）+TGF-β1組增殖指數(shù)顯著低于TGF-β1組（P＜0.01）（圖3）。

2.2 L-10濃度依賴(lài)性地抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFBs表型轉(zhuǎn)化

圖1 IL-10對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effect of IL-10 on cardiac fibroblasts proliferationinduced by TGF-β1（±s，n=9/group）

圖2 IL-10對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響Fig 2 Effect of IL-10 on cardiac fibroblasts proliferationunder basal condition（±s，n=9/group）

TGF-β1刺激組較對(duì)照組α-SMA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著增多（P＜0.01）;但I(xiàn)L-10+TGF-β1組較單純TGF-β1組，α-SMA陽(yáng)性表達(dá)明顯減少（10 μg/L組P＜0.05;50 μg/L 及 100 μg/L 組:P＜0.01），且抑制作用隨IL-10濃度增加而增強(qiáng)（圖4）。

2.3 TGF-β1及 IL-10對(duì) ERK1/2和 P38磷酸化的影響

2.3.1 TGF-β1誘導(dǎo) ERK1/2及 P38磷酸化:ERK1/2在加入TGF-β1刺激后30 min時(shí)即發(fā)生明顯磷酸化，4 h磷酸化水平最高，維持至8 h，24 h恢復(fù)至基礎(chǔ)水平;P38于TGF-β1刺激后2 h磷酸化程度最高，隨后磷酸化水平逐漸降低，24 h恢復(fù)基礎(chǔ)水平（圖5）。

2.3.2 阻斷ERK1/2、P38激酶活性TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA 表達(dá)降低:與 TGF-β1 組相比，50 μmol/L PD98059預(yù)處理1 h再與TGF-β1共孵育組α-SMA蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），20 μmol/LSB203580預(yù)處理組α-SMA蛋白的表達(dá)也顯著降低（P＜0.01）（圖6）。

圖3 IL-10對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)及TGF-β1誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響Fig 3 Effects of IL-10 on the PCNA expression of cardiac fibroblasts under basal and TGF-β1-induced conditions

圖4 IL-10對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)及TGF-β1誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞向肌樣成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響Fig 4 Effects of IL-10 on the α-SMA expression of cardiac fibroblasts under basal and TGF-β1 induced conditions measured by immunocytochemical staining（×400）

圖5 ERK1/2、P38蛋白在TGF-β1刺激后各時(shí)間點(diǎn)磷酸化蛋白表達(dá)情況Fig 5 Effects of TGF-β1 on the phosphorylation of ERK1/2 and P38 in cardiac fibroblasts measured by Western blot

圖6 ERK1/2及P38抑制劑對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA蛋白表達(dá)的影響Fig 6 Effects of TGF-β1 on the α-SMA expression of cardiac fibroblasts when ERK1/2 and P38 pathway were inhibited

2.3.3 與TGF-β1組相比，IL-10抑制了 TGF-β1誘導(dǎo)的ERK1/2和P38激酶磷酸化 IL-10（100 μg/L）+TGF-β1組ERK1/2及P38磷酸化水平均顯著低于 TGF-β1刺激組（ERK1/2:P＜0.05;P38:P＜0.01）（圖7）。

圖7 IL-10對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的ERK1/2及P38磷酸化蛋白表達(dá)的影響Fig 7 Effects of IL-10 on the phosphorylation of ERK1/2 and P38 stimulated by TGF-β1 in cardiac fibroblasts

3 討論

在大鼠 AMI模型上發(fā)現(xiàn)，在 AMI后 TGF-β1 mRNA在心肌中的表達(dá)顯著增加，與其相伴隨的是MyoFbs增多及膠原的堆積［7］。本結(jié)果顯示TGF-β1刺激后CFBs增殖顯著增強(qiáng)，同時(shí)向MyoFbs轉(zhuǎn)化增多，進(jìn)一步從細(xì)胞水平證實(shí)了TGF-β1在A(yíng)MI后促纖維化的作用機(jī)制。

在缺血再灌注心肌組織中IL-10 mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高，IL-10能夠改善心肌梗死大鼠的左室重構(gòu)［3］，能夠抑制大鼠梗死后心肌細(xì)胞外Ⅰ、Ⅲ型膠原的沉積［8］。但具體機(jī)制尚不清楚。本研究證實(shí)IL-10對(duì)于基礎(chǔ)狀態(tài)下的CFBs無(wú)顯著影響，但能夠抑制TGF-β1促CFBs增殖的作用，且此作用呈濃度依賴(lài)趨勢(shì)。

既往在IL-10與成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化方面僅見(jiàn)少數(shù)研究報(bào)道:IL-10能夠抑制人類(lèi)蛻膜間質(zhì)細(xì)胞（一種類(lèi)肌樣成纖維細(xì)胞）α-SMA 的表達(dá)［9］;IL-10-/-小鼠損傷愈合明顯較正常對(duì)照組快，且表達(dá)α-SMA的MyoFbs數(shù)量明顯增多［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在細(xì)胞水平證實(shí)了IL-10能夠抑制TGF-β1所誘導(dǎo)的CFBs向MyoFbs的轉(zhuǎn)化。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在體外IL-10能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFBs及向MyoFbs表型轉(zhuǎn)化，這可能是AMI后IL-10抑制心室重構(gòu)的作用機(jī)制之一。

研究顯示AMI后ERK1/2和P38通路的活化與心室重構(gòu)關(guān)系密切，而一系列研究證實(shí)幾種MAPKs（ERK1/2及P38等）都能夠被TGF-β1迅速激活［11-12］，本實(shí)驗(yàn)證實(shí) TGF-β1 能夠促進(jìn) ERK1/2及P38的磷酸化，而ERK1/2及P38的抑制劑能夠顯著減少TGF-β1所誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)，更進(jìn)一步證實(shí)了TGF-β1與MAPKs之間的生物聯(lián)系。IL-10的經(jīng)典作用信號(hào)通路是JAK-STAT通路系統(tǒng)，但有研究發(fā)現(xiàn)IL-10改善心肌梗死大鼠左室重構(gòu)的作用部分是通過(guò)抑制P38激酶發(fā)揮的［3］，本實(shí)驗(yàn)室的前期研究顯示IL-10能夠通過(guò)抑制此通路抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成。本研究結(jié)果進(jìn)一步從細(xì)胞水平證實(shí)了IL-10能夠抑制 TGF-β1誘導(dǎo)的ERK1/2及 P38磷酸化，提示抑制ERK1/2及P38通路可能是IL-10抑制TGF-β1作用的可能機(jī)制。

本研究顯示IL-10可能是通過(guò)抑制ERK1/2和P38激酶活化抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFBs的增殖及表型轉(zhuǎn)化。

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IL-10 inhibits cardiac fibroblasts proliferation and phenotype transformation induced by TGF-β1 in rats

HAO Yan-jie1，2，CHEN Ying1，XUE Lin1，HAN Xiao-ning1，DING Wen-hui1*
（1.Dept.of Cardiology;2.Dept.of Rheumatology and Clinical Immunology，the First Hospital，Peking University，Beijing 100034，China）

ObjectiveTo examine the effects of IL-10 on cardiac fibroblasts（CFBs）proliferation and phenotype transformation to myofibroblasts（MyoFbs）induced by transforming growth factor-β1（TGF-β1）;and to investigate the regulating pathways.MethodsCardiac fibroblasts were isolated from cardiac ventricles of neonatal SD rats.The passage 2～4 were used and divided into the following groups for treatment:1）control group，2）IL-10 reaction group，3）TGF-β1 reaction group，and 4）IL-10 plus TGF-β1 reaction group（TGF-β1 treatment followed with IL-10 pretreatment）.Cells proliferation was assessed by MTT assay and immunocytochemistry staining for proliferating cell nuclear antigen（PCNA）;the phenotype transformation into MyoFbs was assessed by immunocytochemistry of α-smooth muscle actin（α-SMA）;extracellular signal related kinase（ERK1/2）and P38 kinase pathways were assessed by western-blot.ResultsTGF-β1（10 μg/L）treatment boosted the proliferation and the expression of α-SMA significantly（P＜0.01），while IL-10（10，50 or 100 μg/L）plus TGF-β1 co-treatment induced lower cell proliferation and expression of α-SMA than treating with TGF-β1 alone（P＜ 0.05），with the inhibitory effect of IL-10 being concentration dependent.TGF-β1 could significantly stimulate the ERK1/2 and P38 kinase phosphorylation（P＜0.01），however IL-10（100 μg/L）plus TGF-β1 co-treatment failed to down-regulated the phosphorylation of ERK1/2 and P38 kinase compared with TGF-β1 alone（ERK1/2:P＜0.05;P38:P＜0.01）.ConclusionsIL-10 can attenuate TGF-β1-induced CFBs proliferation and phenotype transformation to MyoFbs.The inhibitory effects may explained by a mechanism of inhibiting the activation of ERK1/2 and P38 kinase.

interleukin-10;cardiac fibroblasts;transforming growth factor-β1;extracellular signal related kinase;P38 kinase

R541.1

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.007

1001-6325（2015）09-1182-06

2015-01-09

2015-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金（30640083）

*通信作者（corresponding author）:dwh_rd@126.com