李開濟，郝曉方，章廣玲，魏 潔，林雅軍，魏靜波，甄永占*

（1.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院河北省慢性疾病重點實驗室唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室，河北唐山 063000;

2.衛(wèi)生部北京醫(yī)院/北京老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100730）

賴氨大黃酸減輕百草枯中毒小鼠心臟損傷

李開濟1，郝曉方1，章廣玲1，魏 潔2，林雅軍2，魏靜波1，甄永占1*

（1.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院河北省慢性疾病重點實驗室唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室，河北唐山 063000;

2.衛(wèi)生部北京醫(yī)院/北京老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100730）

目的 觀察賴氨大黃酸（RHL）對百草枯中毒小鼠心臟損傷的保護作用及其機制。方法 小鼠隨機分為對照組、百草枯模型組（腹腔注射百草枯建立活性氧自由基引起心臟損傷的小鼠模型）及RHL治療組（造模前1周給予RHL（50 mg/kg）。用硫代巴比妥酸法檢測心臟組織MDA含量，用聯(lián)苯三酚自氧化法檢測SOD活性，用NADPH偶聯(lián)法檢測GSH-Px活性。HE染色及DCFH-DA染色分別觀察心臟病理改變及活性氧水平;Western blot檢測心肌衰老相關(guān)基因的表達。結(jié)果 與對照組相比，百草枯模型組小鼠心臟組織SOD和GSH-Px活性下降（P＜0.05），MDA水平升高（P＜0.05），RHL能減輕百草枯的作用（P＜0.05）;百草枯引起心肌結(jié)構(gòu)破壞，心肌組織活性氧水平升高，RHL減輕上述變化（P＜0.05）。百草枯能夠降低SIRT1的表達，增加P53的乙?；癙53和P66的表達。RHL減輕上述變化（P＜0.05）。結(jié)論 RHL可以減輕百草枯中毒后所致的小鼠心臟損傷。

賴氨大黃酸;百草枯;心臟損傷;活性氧自由基

*通信作者（corresponding author）:yongzhanzhen@126.com

百草枯（paraquat，PQ）是一種世界廣泛使用的除草劑，其化學(xué)名稱1，1'-二甲基-4，4'-聯(lián)吡啶，屬有機雜環(huán)類化合物，可經(jīng)皮膚、呼吸道及消化道吸收進入人體，產(chǎn)生活性氧自由基，導(dǎo)致心臟、肺、肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)等全身多器官功能衰竭［1-2］。其心臟損傷主要表現(xiàn)為炎性細胞浸潤、水腫、細胞核溶解、胞質(zhì)內(nèi)空泡形成和心肌細胞壞死等;也觀察到線粒體的損害、肌絲的溶解和斷裂以及線粒體空泡化等超微結(jié)構(gòu)的改變，但其機制尚不明確［3-4］。目前對于百草枯中毒的治療主要是支持性的，迄今尚無特異性解毒劑和有效的治療。

賴氨大黃酸（Rhein lysinate，RHL）是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所腫瘤室對大黃酸進行結(jié)構(gòu)改造獲得的水溶性好的化合物［5］，體外研究表明其低劑量（10 μmol/L）可保護H2O2誘導(dǎo)的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞損傷［6］。衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所曾發(fā)現(xiàn)RHL能夠延長快速老化小鼠（SAMP10）的壽命，其作用也與清除活性氧自由基有關(guān)。但其是否對百草枯中毒引起的心臟損傷具有保護作用尚未見報道［7］。本研究采用百草枯建立活性氧自由基引起心臟損傷模型，觀察賴氨大黃酸對心臟的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物、主要試劑:SPF級雄性C57小鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量24～28 g［中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所，動物合格證號SCXK（京）2013-0020］。賴氨大黃酸（rhein lysinate，RHL）由本室合成，分子式:C21H22N2O8，相對分子質(zhì)量:430，純度98%;百草枯和DCFH-DA活性氧檢測試劑盒（Sigma公司）;超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）和HE（hematoxylin and eosin）染色試劑盒（北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司）。acetyl-P53（lys382）抗體（Upstate公司）SIRT1、P53、P66 和 P21抗體（Cell Signaling公司）;化學(xué)發(fā)光增強劑、GADPH、抗兔二抗和抗小鼠二抗（Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理:將小鼠隨機分為對照組、百草枯模型組（腹腔注射百草枯10 mg/kg，每周1次）、RHL治療組，每組10只。RHL治療組在造模前1周給予RHL（50 mg/kg）灌胃，對照組和百草枯模型組給予等體積蒸餾水灌胃。百草枯模型組和RHL治療組腹腔注射百草枯（10 mg/kg），每周1次，正常對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，每周1次，持續(xù)2周。標(biāo)本采集，造模2周后，用10%水合氯醛麻醉小鼠，右心房采血，4℃、3 000 r/min離心15 min，收集血清進行MDA含量、SOD和GSHPx活性檢測。收集心臟，將一部分組織制作石蠟切片;剩余心臟組織置于液氮中，凍透后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱中備用。通過Western blot檢測衰老相關(guān)蛋白表達水平變化。

1.2.2 HE染色觀察心臟病理變化:心臟在4℃ 預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液中反復(fù)清洗，置于10% 中性甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋，切片，HE染色后，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 心臟組織MDA含量與SOD和GSH-Px活性測定:MDA含量采用硫代巴比妥酸法，SOD活力采用聯(lián)苯三酚自氧化法，GSH-Px活性采用NADPH偶聯(lián)法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 心臟組織活性氧水平檢測:取心臟在4℃ 預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液中反復(fù)清洗，然后置于OCT中包埋，放入液氮冷卻，－80℃凍存，冰機切片后，按照DCFH-DA活性氧檢測試劑盒說明書進行染色，在熒光顯微鏡下觀察紅色活性氧熒光強度，并照相。

1.2.5 Western blot分析:凍存的心臟組織加入新鮮配制的組織裂解液（mmol/L）:137 NaCl，20 Tris，pH 7.4，10 PMSF，1 Na3VO4，10 NaF，2.5 μg/mL抑肽酶，2.5 μg/mL leupetin，1%NP40，20%磷酸酶抑制劑復(fù)合物），4℃下勻漿，冰上裂解15 min，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測蛋白濃度。等量蛋白（40 μg）于10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶37℃封閉1 h，分別加入抗SIRT1、acetyl-P53、P53、P66（1∶1 000）及 GADPH（1∶2 000）抗體，4℃孵育過夜。洗滌10 min×4次，用含辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1∶5 000）孵育1 h，洗膜15 min×4次，膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強劑，按照試劑說明進行操作，結(jié)果在凝膠成像儀上照相并使用Bio-Rad公司Quantity One分析軟件測量條帶吸光度值，目的條帶與GADPH條帶吸光度值的比值即為該目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況和心臟重量

與對照組比較，百草枯模型組小鼠活動及進食量均減少。RHL治療組小鼠活動量和進食量較正常對照組雖略有下降，與百草枯模型組相比活動量和進食量均增多，但無差異。對照組、百草枯模型組和RHL治療組體質(zhì)量分別為（28.0±1.8）g、（25.0±2.8）g（百草枯模型組與對照組相比P＜0.05）和（26.0±2.7）g百草枯模型組。正常對照組、百草枯模型組和RHL治療組心臟重量分別為（0.21±0.04）g、（0.24±0.05）g和（0.22±0.05）g。

2.2 RHL對百草枯誘導(dǎo)的氧化損傷模型小鼠心臟組織MDA含量與SOD和GSH-Px活性的影響

與正常對照組相比，百草枯誘導(dǎo)的氧化損傷模型小鼠心臟SOD和GSH-Px活性顯著降低（P＜0.05），MDA含量明顯升高（P＜0.05）。RHL顯著緩解上述變化（表1）。

表1 RHL對百草枯誘導(dǎo)的氧化損傷模型小鼠心臟MDA、SOD和GSH-Px的影響Table 1 The effect of RHL on MDA content，SOD and GSH-Px activities in the cardiac tissue in oxidative damage mice model induced by paraquat（±s，n=10）

表1 RHL對百草枯誘導(dǎo)的氧化損傷模型小鼠心臟MDA、SOD和GSH-Px的影響Table 1 The effect of RHL on MDA content，SOD and GSH-Px activities in the cardiac tissue in oxidative damage mice model induced by paraquat（±s，n=10）

*P＜0.05 compared with control group;#P＜0.05 compared with model group.

group MDA（nmol/mgprot）SOD（U/mgprot）GSH-Px（U/mL）control 2.1±0.2 246±21 978±62 model 3.0±0.2* 167±17* 494±35*RHL（50 mg/kg） 2.1±0.3# 226±22# 705±41*#

2.3 RHL對百草枯模型小鼠心臟組織病理改變的影響

與對照組相比，百草枯模型小鼠心肌組織可見明顯水腫，心肌細胞邊界不清，細胞核增大，染色變淺，異染色質(zhì)沿核膜分布，部分細胞核溶解，細胞質(zhì)染色變淺，且不均勻。RHL改善心肌組織上述病理變化。各組心肌組織炎性細胞浸潤都不明顯，組織結(jié)構(gòu)均未見明顯破壞（圖1）。

圖1 RHL對百草枯氧化損傷模型小鼠心臟組織病理變化的影響Fig 1 The effect of RHL on the change of pathological profile in the cardiac tissue in oxidative damage mice model induced by paraquat（×200）

圖2 RHL對百草枯氧化損傷模型小鼠心肌組織活性氧水平的影響Fig 2 The effect of RHL on ROS level in the cardiac tissue in oxidative damage mice model induced by paraquat（×200）

2.4 RHL對百草枯模型小鼠心臟組織活性氧水平的影響

百草枯氧化損傷模型小鼠心肌組織活性氧水平為（2 074±280），顯著高于對照組（3.67±3.09）（P＜0.05）。RHL顯著回調(diào)活性氧表達水平至（10.51±2.8）（P＜0.05）（圖2）。

2.5 RHL對百草枯氧化損傷模型小鼠心臟衰老相關(guān)基因表達的影響

與對照組相比，百草枯模型組小鼠心臟組織SIRT1表達水平降低 （P＜0.05），P53乙?；缴撸≒＜0.05），P53和P66表達水平升高 （P＜0.05）。與模型組相比，RHL使小鼠心臟組織SIRT1表達水平升高 （P＜0.05），P53乙酰化水平降低（P＜0.05），P53和P66表達水平也降低（P＜0.05）（圖3，表2）。

圖3 RHL對百草枯氧化損傷模型小鼠心肌組織衰老相關(guān)基因表達的影響Fig 3 The effect of RHL on the expression of the aging-related gene in the cardiac tissue in oxidative damage mice model induced by paraquat

表2 RHL對百草枯誘導(dǎo)的氧化損傷模型小鼠心臟組織衰老相關(guān)基因表達的影響Table 2 The effect of RHL on the expression of the aging-related gene in the cardiac tissue in oxidative damage mice model induced by paraquat（±s，n=10）

表2 RHL對百草枯誘導(dǎo)的氧化損傷模型小鼠心臟組織衰老相關(guān)基因表達的影響Table 2 The effect of RHL on the expression of the aging-related gene in the cardiac tissue in oxidative damage mice model induced by paraquat（±s，n=10）

*P＜0.05 compared with control group;#P＜0.05 compared with model group.

group Sir2 P66 acetyl-P53 P53 control 100±8 100±5 100±11 100±9 model 60±6* 120±7* 116±13* 127±11*RHL 94±12# 88±9*# 94±12# 110±8#

3 討論

百草枯是一種非選擇性除草劑，由于除草效果好和價廉，在農(nóng)業(yè)國家有廣大的市場，但由于其代謝產(chǎn)物和氧化還原作用產(chǎn)生的活性氧（ROS）對人和動物的危害極大，目前尚無特效解毒劑，致死率可高達60% ～70%［8］，甚至更高。百草枯進入人體后，造成心臟、肺、肝、腎和中樞神經(jīng)等多器官功能不全，其中心臟毒性是中毒死亡的重要原因之一。百草枯可導(dǎo)致心肌損傷，嚴(yán)重者可出現(xiàn)休克癥狀，煩渴、多飲，血壓下降和脈率加快細弱。高劑量百草枯中毒動物心肌損傷，心肌肌鈣蛋白I（cTnI）水平與中毒程度有高度相關(guān)性［9］。百草枯中毒患者血清肌酸激酶（CK-MB）水平升高，早期觀察能評價中毒程度及指導(dǎo)預(yù)后［10］。

前期研究發(fā)現(xiàn)低劑量RHL能夠清除活性氧自由基，保護臍靜脈內(nèi)皮細胞免受 H2O2的損害［7］，RHL能否清除動物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧尚未見報道。本研究采用百草枯誘導(dǎo)動物體內(nèi)氧自由基生成模型，發(fā)現(xiàn)百草枯降低小鼠體質(zhì)量及血清 SOD和GSH-Px活性，升高 MDA含量;RHL能升高血清SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量。提示RHL能夠清除百草枯誘發(fā)的體內(nèi)活性氧自由基生成。百草枯模型組心肌組織活性氧水平顯著升高，RHL顯著降低活性氧水平。RHL能夠逆轉(zhuǎn)百草枯對心肌組織的損傷。

衰老在活性氧自由基誘導(dǎo)心臟損傷中發(fā)揮著重要作用，長壽基因SIRT1高表達能夠保護百草枯引起的心臟損傷［11］。在高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷模型中發(fā)現(xiàn)SIRT1能夠抑制P66c的表達［12］。百草枯模型小鼠SIRT1表達水平降低，P66表達水平顯著升高。RHL升高SIRT1表達水平，顯著降低P66表達。P53是受SIRT1調(diào)控的下游基因［6］，它作用于P66啟動子上的P53反應(yīng)元件上調(diào)P66的表達水平［13-14］。百草枯模型組小鼠P53乙?；?、P53及P66表達水平也顯著升高，與百草枯氧化損傷模型組相比，RHL顯著下調(diào)P53乙酰化水平及P53和P66表達水平。說明SIRT1/P53/P66信號通路在百草枯誘導(dǎo)心臟組織衰老和RHL保護心肌免受氧化損傷中起著重要作用。

總之，RHL能清除活性氧，降低活性氧自由基對心肌組織的損傷。它有望成為治療百草枯中毒的候選藥物。

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Rhein lysinate attenuated paraquat-induced cardiac injury in mice

LI Kai-ji1，HAO Xiao-fang1，ZHANG Guang-ling1，WEI Jie2，LIN Ya-jun2，WEI Jing-bo1，ZHEN Yong-zhan1*

（1.Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases，Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases，School of Basic Medical Sciences，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000;
2.Beijing Hospital＆ Beijing Institute of Geriatrics，Ministry of Health，Beijing 100730，China）

ObjectiveTo investigate the protective effects of rhein lysinate（RHL）on cardiac tissue damage induced by paraquat in experimental mice，and to clarify its mechanism.MethodsIn this study mice were assigned to the following three groups:control，paraquat model，and RHL-treated groups.The model of oxidative damage mice was established by intraperitoneal injection of paraquat.RHL-treated group was given RHL（50 mg/kg）by gavage for one week before performing model.The other two groups were given equal volume of distilled water.For making model，paraquat was intraperitoneally injected in the paraquat model and RHL-treated group.The content of MDA was detected by thiobarbituric acid assay.The activities of SOD and GSH-Px were detected by biphenyl three phenolic autoxidation assay and NADPH coupling method respectivly.The pathological profile of cardiac tissue was observed by hematoxylin and eosin（HE）staining and reactive oxygen species was observed by DCFH-DA staining.The change of proteins related to myocardial damage detected by Western blot.ResultsCompared with control group，the activities of SOD and GSH-Px decreased（P＜0.05）and the content of MDA increased（P＜0.05）in paraquat model group.However，these changes were attenuated byr RHL treatmen（P＜0.05）.The pathological examination indicated the structure of cardiac tissue was damaged and reactive oxygen species of cardiac tissue was increased after paraquat was given，however，these changes were attenuated after RHL treatmen.It was shown in western blot analysis that compared with control group，the expression of SIRT1 decreased，the acetylation of P53 and the expression of P53 and P66 increased in paraquat-treated group.These changes were attenuated by RHL treatmen（P＜0.05）.ConclusionsRHL may attenuate paraquat-induced cardiac injury in mice.

rhein lysinate;paraquat;cardiac injury;reactive oxygen species

R543

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.005

1001-6325（2015）09-1171-05

2015-01-20

2015-04-24

國家自然科學(xué)基金（81001439）;河北聯(lián)合大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃（X2014078）