歐俐蘋，杜紅飛，楊 雪，唐 敏，蔡曉鐘，羅春麗

（重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室，重慶 400016）

PLCε通過 PKCα/β/TBX3信號通路調(diào)控人膀胱癌細(xì)胞系T24的遷移和侵襲

歐俐蘋，杜紅飛，楊 雪，唐 敏，蔡曉鐘，羅春麗*

（重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室，重慶 400016）

目的 體外實驗研究PLCε基因調(diào)節(jié)人膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲的分子機制。方法 設(shè)計并合成針對PLCε基因mRNA的寡核苷酸序列，構(gòu)建重組腺病毒Ad-shPLCε。T24細(xì)胞感染Ad-shPLCε腺病毒后，用Western blot檢測PKCα/β及TBX3、E-cadherin的表達;用劃痕實驗、Transwell遷移和侵襲實驗檢測膀胱癌細(xì)胞T24的遷移、侵襲能力。結(jié)果 Ad-shPLCε重組腺病毒感染膀胱癌細(xì)胞T24，對其PLCε mRNA表達抑制率為75.6%，對其PLCε蛋白表達抑制率為67.4%。Ad-shPLCε感染組T24細(xì)胞遷移能力較空載組和空白對照組明顯減弱（P＜0.05）;重組腺病毒Ad-shPLCε感染組T24細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)較空載組和空白對照組明顯減少（P＜0.05）。Ad-shPLCε重組腺病毒感染膀胱癌T24細(xì)胞后下游PKCα/β的活化受到抑制（P＜0.05），同時，TBX3的表達減少，而E-cadherin的表達增高（P＜0.05）。結(jié)論 通過以重組腺病毒干擾抑制PLCε基因，能有效抑制膀胱癌T24細(xì)胞系中PLCε下游PKCα/β的活化情況及TBX3，E-cadherin的表達變化，并且對T24細(xì)胞的遷移、侵襲能力具有一定的抑制作用。

PLCε;PKCα/β;TBX3;膀胱癌;遷移

*通信作者（corresponding author）:luochunli79@hotmail.com

PLCε是2001年發(fā)現(xiàn)的一種磷脂酶C的同工酶，能被H-ras癌基因的蛋白表達產(chǎn)物（小G蛋白）和G蛋白雙向調(diào)節(jié)［1-2］。H-ras基因突變廣泛存在于人類實體瘤中，在結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌和胃癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有H-ras癌基因突變，并且其突變與某些腫瘤的分期和侵襲轉(zhuǎn)移存在一定的相關(guān)性。PLCε具有調(diào)節(jié) PKCα 活性的潛能［3］，抑制 PKCα/β的活性可抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力;TBX3可轉(zhuǎn)錄抑制E-cadherin的表達，而TBX3、E-cadheirn都被證實參與實體癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的調(diào)節(jié)。因此，為明確PLCε調(diào)節(jié)膀胱癌遷移、侵襲能力的具體機制，本研究從體外實驗觀察PLCε基因?qū)ο掠蜳KCα/β，TBX3，E-cadherin的表達影響，分析PLCε與PKCα/β表達和活性的關(guān)系。本研究以設(shè)計針對PLCε基因的短發(fā)夾狀 RNA（short hairpin RNA，shRNA）表達載體，采用高效、特異的RNA干擾腺病毒沉默基因方法，通過腺病毒感染膀胱癌細(xì)胞系T24，以觀察對該基因表達的調(diào)控作用并進一步觀察對膀胱癌T24細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

膀胱癌細(xì)胞系T24（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲研究所惠贈），RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司）;Ad-shPLCε干擾腺病毒載體（武漢淅瑪有限公司）;引物合成、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（TaKaRa公司）;山羊抗人PLCε多克隆抗體（SANTA CRUZ公司）;兔抗山羊IgG（北京中杉）;兔抗人 PKCα和兔抗人 PKCβ（Bioworlde），兔抗人 E-cadherin（Immunaway），兔抗人 TBX3（Proteintech）;Transwell小室及基質(zhì)膠（B.D公司）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建重組腺病毒及病毒感染:Ad-shPLCε干擾腺病毒載體和Ad-HK空載腺病毒載體（武漢淅瑪有限公司構(gòu)建）保存于－80℃。待細(xì)胞匯合度達70%～80%時分別加入適量Ad-shPLCε及Ad-HK腺病毒，設(shè)立空白組（blank組），Ad-HK空載組（Ad-HK 組），Ad-shPLCε 感染組（Ad-shPLCε 組）。

1.2.2 RT-PCR分析PLCε mRNA表達量:用Trizol分別提取各組細(xì)胞總RNA，取0.5 μg總RNA用于RT-PCR，方法參照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒，引物序列為:PLCε上游引物5'-CATGGAAGGATAAGCGTTG GT-3'，下游引物 5'-CCCAAGTCCCGTGTTAAGA-3'，擴增片斷為395 bp。以β-actin作為內(nèi)參照，β-actin引物序列:上游引物5'-GGGACCTGACTGACTACC TC-3'，下游引物 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3'，擴增片斷為543 bp。RT反應(yīng)條件為:42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min;PCR反應(yīng)條件:94℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)，最后72℃再次延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，BIORAD分析電泳條帶。對各條帶吸光度值與β-actin條帶吸光度值的比值進行分析，用A值比值的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，n=3。

1.2.3 Western blot檢測PLCε蛋白表達量:細(xì)胞裂解液裂解各組T24細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。分別取等量各組蛋白樣品上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn) PVDF膜，PVDF膜用5%脫脂奶室溫封閉2 h后依次加入1∶200 PLCε一抗和1∶5 000二抗，TBS洗膜后 ECL顯色。結(jié)果采用半定量圖像分析。對各條帶吸光度值與GAPDH條帶吸光度值的比值進行分析，用A值比值的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，n=3。

1.2.4 觀察重組腺病毒感染對T24細(xì)胞遷移侵襲能力影響

1.2.4.1 劃痕實驗:常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞于6孔板中，待細(xì)胞匯合度達70% ～80%，給予各種處理因素;待細(xì)胞長滿6孔板時，于超凈工作臺內(nèi)，用10 μL的槍頭，十字交叉劃線，劃線后0、12和24 h時間點于顯微鏡下拍照;利用Olympus DP72軟件分析細(xì)胞遷移面積。

1.2.4.2 Transwell侵襲實驗:采用 Transwell小室體外侵襲實驗，8 μm孔徑聚碳酸酯微孔濾膜上均勻涂布一層1∶5稀釋的人工基底膜Matrigel約40 μL/室，小室的上室分別加入各組 T24細(xì)胞懸液200 μL，細(xì)胞濃度均為5×105個/mL，每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔，測定各組細(xì)胞的侵襲力。每孔隨機計數(shù)5個視野（×400），取平均值，以穿膜的腫瘤細(xì)胞數(shù)目多少作為評價其侵襲力的指標(biāo)。

1.2.4.3 Transwell遷移實驗:步驟同侵襲實驗，去Transwell上室的基質(zhì)膠，種植于Transwell上室的細(xì)胞數(shù)為1.5×104個。

1.2.4.4 Western blot檢測下調(diào)PLCε 后 PKCα/β、TBX3和E-cadherin的活性:細(xì)胞感染腺病毒后，提取細(xì)胞膜、質(zhì)蛋白及總蛋白，Western blot檢測PKCα，PKCβ在細(xì)胞膜、胞質(zhì)的分布及蛋白表達。PVDF膜封閉2 h后分別依次加入一抗（1∶1 000兔抗人PKCα或1∶1 000兔抗人PKCβ或1∶200兔抗人TBX3抗體或兔抗人 E-cadherin 1∶1 000）和1∶5 000二抗，TBS洗膜后ECL顯色。結(jié)果采用半定量圖像分析，方法同前。

1.2.4.5 QRT-PCR分析TBX3和E-cadherinmRNA表達量:用Trizol分別提取各組細(xì)胞總 RNA，取0.5 μg總RNA用于RT-PCR，方法參照QRT-PCR試劑盒，其中每組設(shè)置3個復(fù)孔，以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)溶解曲線以2－ΔΔCt法計算基因表達定量結(jié)果。引物序列為:TBX3上游引物5'-TTCCACATTGTAA GAGCCAATG-3'，下游引物 5'-CTTTGAGGTTCGTTG TCCCTAC-3';E-cadherin上游引物5'-CGCCTTATG ATTCTCTGCTCGTGTT-3'，下游引物 5'-CGATTGCC CCATTCGTTCAAGTAGT-3'。以 β-actin作為內(nèi)參照，β-actin引物序列:上游引物5'-CTGGAACGGT GAAGGTGACA-3'，下游引物 5'-AAGGGACTTCCT GTAACAATGCA-3'。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0進行方差分析，所有計量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用q檢驗（SNK法）。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒感染對T24細(xì)胞 PLCε基因的影響

2.1.1 RT-PCR檢測PLCε mRNA的表達:PLCε mRNA在Ad-shPLCε腺病毒組細(xì)胞內(nèi)表達明顯低于空白對照和Ad-HK腺病毒組（P＜0.01）（圖1）。以空白對照組PLCε mRNA表達值為標(biāo)準(zhǔn)，Ad-HK腺病毒組、Ad-shPLCε腺病毒組對目的基因表達抑制率分別為2.7%、75.6%。

2.1.2 Western blot檢測PLCε蛋白的表達:結(jié)果顯示感染Ad-shPLCε腺病毒組的比值明顯低于其他兩組（P＜0.01）（圖2），其蛋白表達抑制率為67.4%。

2.2 重組腺病毒感染對T24細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

圖1 重組腺病毒感染各組T24細(xì)胞PLCε mRNA的RT-PCR結(jié)果Fig 1 RT-PCR analysis of the intracellular PLCε mRNA expression in all groups of T24

2.2.1 劃痕實驗、Transwell遷移、侵襲實驗:Ad-shPLCε組T24細(xì)胞的遷移面積較空載組和空白對照組顯著減少（P＜0.05）（圖3）。在Transwell遷移、侵襲實驗中Ad-shPLCε組T24細(xì)胞的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)較空載組和空白對照組顯著減少（P＜0.05）（圖 4）。

2.2.2 下調(diào)PLCε的表達抑制 PKCα/β的活性:感染 Ad-shPLCε組與 Ad-HK和空白組比較，shPLCε能夠抑制 PKCα，PKCβ的活化，PLCε高表達的空白對照組，PKCα，PKCβ在細(xì)胞膜的分布較PLCε低表達的Ad-shPLCε腺病毒組更多，通過腺病毒感染后，PKCα，PKCβ在細(xì)胞膜蛋白內(nèi)的表達較對照組降低（P＜0.05）（圖5），PKCα，PKCβ 在胞質(zhì)蛋白內(nèi)的表達明顯較對照組增高（P＜0.01）（圖5）。

2.2.3 下調(diào)PLCε的表達抑制TBX3的表達和促進E-cadherin的表達:Ad-shPLCε組T24細(xì)胞的TBX3 mRNA及蛋白表達較空載組和空白對照組顯著降低（P＜0.05）（圖6）;Ad-shPLCε組T24細(xì)胞的E-cadherin的RNA及蛋白表達較空載組和空白對照組顯著升高（P＜0.05）。

3 討論

圖2 Western blot檢測T24細(xì)胞各組PLCε蛋白表達水平Fig 2 Western blot analysis of PLCε protein expression level in T24 groups

圖3 劃痕實驗中T24細(xì)胞遷移能力Fig 3 The migratory ability of T24 in wound healing assay

圖4 T24細(xì)胞的遷移、侵襲能力Fig 4 The migratory and invasive ability of T24 cells

圖5 下調(diào)PLCε的表達抑制PKCα、PKCβ的活化Fig 5 Inactivation of PKCα/β by down-regulation of PLCε for T24 cells

圖6 下調(diào)PLCε的表達抑制TBX3的表達和增加E-cadherin的表達Fig 6 Down-regulation of PLCε repressed TBX3 expression and increased E-cadherin expression for Western blot and QRT-PCR

PLCε是 Ras蛋白的效應(yīng)分子并以GTP-依賴的方式被Ras調(diào)控。Ras突變激活PLCε后，PLCε定位于細(xì)胞膜并水解細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）產(chǎn)生IP3和DAG兩種重要的細(xì)胞內(nèi)信使［1-2］。DAG可與Ca2+一起激活依賴 Ca2+、磷脂的蛋白激酶C（PKC），PKC激活后能使腫瘤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性增高，該物質(zhì)已成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲能力的靶點。PKCα總的表達水平及膜/質(zhì)內(nèi)表達比例在腫瘤組織中較正常組織中顯著增高;隨著腫瘤分級的增高，PKCα在膜內(nèi)水平顯著增高，而漿內(nèi)水平卻顯著降低，總的表達水平相對增高［4］。這些研究表明Ras突變導(dǎo)致的PLCε/PKC信號活化在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

PKCα的表達與膀胱癌的病理參數(shù)具有正相關(guān)性［5］;PKCα/β 抑制劑Go6976能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力［6］;本研究表明PLCε能夠通過新的信號通路調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力;下調(diào)PLCε的表達能夠抑制PKCα、PKCβ的活性，能夠抑制癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，充分證明PKCα/β為PLCε重要的下游分子及參與PLCε介導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的調(diào)節(jié)。

TBX3作為轉(zhuǎn)錄抑制因子在多種實體癌中異常高表達，而大量研究表明TBX3的高表達與癌細(xì)胞的侵襲潛能相關(guān)。另外，TBX3能夠抑制黏附分子E-cadherin的表達，進而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的遷移、侵襲功能［7］。E-cadherin是細(xì)胞與細(xì)胞黏附作用的重要調(diào)節(jié)者，在維持上皮細(xì)胞骨架的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。在腫瘤發(fā)生的晚期，可發(fā)生E-cadherin的低表達甚至缺失［8］。E-cadherin表達與肝癌侵襲能力呈負(fù)相關(guān)［9］，E-cadherin表達減弱，肝癌侵襲能力增強;癌旁組織中E-cadherin高表達，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的時間晚，概率低。本研究結(jié)果首次在膀胱癌中證實TBX3可轉(zhuǎn)錄抑制E-cadherin的表達;PLCε可通過TBX3介導(dǎo)E-cadherin的表達。另外，本實驗結(jié)果顯示通過下調(diào)PLCε而抑制PKCα/β的活性能夠進一步抑制TBX3的表達，促進、誘導(dǎo) E-cadherin的表達。PLCε/PKCα/β/TBX3/E-cadherin新通路的證實，為充分了解膀胱癌發(fā)病的病理機制奠定了堅實基礎(chǔ)，為膀胱癌的臨床治療提供了新思路。

［1］Song C，Hu CD，Masago M，et al.Regulation of a novel human phospholipase C，PLCepsilon，through membrane targeting by Ras［J］.Biol Chem，2001，276:2752-2757.

［2］Bunney TD，Baxendale RW，Katan M.Regulatory links between PLC enzymes and Ras superfamily GTPases:signalling via PLCepsilon［J］.Adv Enzyme Regul，2009，49:54-58.

［3］Ling Y，Chunli L，Xiaohou W，et al.Involvement of the PLCε/PKCα pathway in human BIU-87 bladder cancer cell proliferation［J］.Cell Biol Int，2011，35:1031-1036.

［4］Zhu YY，Wang HM，Kong CZ，et al.The role of protein kinase C alpha in recurrence of superficial bladder carcinoma［J］.Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2005，43:662-666.

［5］Aaltonen V，Koivunen J，Laato M，et al.Heterogeneity of cellular proliferation within transitional cell carcinoma:correlation of protein kinase C alpha/betaI expression and activity［J］.J.Histochem Cytochem，2006，54:795-806.

［6］Koivunen J，Aaltonen V，Koskela S，et al.Protein kinase C alpha/beta inhibitor Go6976 promotes formation of cell junctions and inhibits invasion of urinary bladder carcinoma cells［J］.Cancer Res，2004，64:5693-5701.

［7］Mowla S，Pinnock R，Leaner V，et al.PMA-induced upregulation of TBX3 is mediated by AP-1 and contributes to breast cancer cell migration［J］.Biochem J，2011，433:145-153.

［8］Rodriguez M，Aladowicz E，Lanfrancone L，et al.Tbx3 represses E-cadherin expression and enhances melanoma invasiveness［J］.Cancer Res，2008，68:7872-7881.

［9］洪堅善，彭浩，段小嫻.E-cadherin的表達與肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2005，24:1139-1142.

PLCε regulates invasion and migration of human bladder cancer cells T24 through PKCα/β/TBX3 pathway

OU Li-ping，DU Hong-fei，YANG Xue，TANG Min，CAI Xiao-zhong，LUO Chun-li*

（Key Laboratory of Diagnostics Medicine Designated by the Ministry of Education，Laboratory Medical College，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo investigate the molecular mechanisms ofPLCε in regulating the invasion and migration of human bladder cancer cellsin vitro.MethodsAfter cells treated with recombinant adenovirus，the migratory/invasive abilities of T24 cells were explored by wound healing and Transwell chamber cell migration and invasion assay;RT-PCR was used to detect the mRNA levels ofPLCε;The protein levels of PLCε，PKCα，PKCβ，TBX3 and E-cadherin were determined by Western blot;QRT-PCR was used to detect the mRNA levels ofTBX3andE-cadherin.ResultsIt was confirmed by digesting and sequencing that the recombinant adenovirus had been constructed successfully.The expression ofPLCε mRNA and PLCε protein were both decreased after the infection of AdshPLCε.Wound healing and Transwell chamber cell migration/invasion assay showed that Ad-shPLCε treatment could inhibit the migratory and invasive activity of bladder cancer cells（P＜0.05）.The results of Western blot indicated that the expression of PKCα/β in membrane decreased（P＜0.05），and phosphorylation level of PKCα and PKCβ was reduced.QRT-PCR and Western blot analysis demonstrated that the expression level of TBX3 decreased，but the expression level of E-cadherin increased.ConclusionsPLCε shRNA can inhibit migratory and invasive ability of bladder cancer cells through PKCα/β/TBX3/E-cadherin pathway.

PLCε;PKCα/β;TBX3;bladder cancer;migration

R737

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.001

1001-6325（2015）09-1155-07

2014-12-29

2015-03-26

國家自然科學(xué)基金（81072086）;重慶市教委自然科學(xué)基金（KJ110305）