徐吉洋，張文萍，李少南，郎倩萍

浙江大學農藥與環(huán)境毒理研究所，杭州310029

萼花臂尾輪蟲毒性試驗的方法學研究

徐吉洋，張文萍，李少南*，郎倩萍

浙江大學農藥與環(huán)境毒理研究所，杭州310029

為嘗試以群體取代個體作為輪蟲室內毒性試驗目標物的可行性，本項研究以萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)作為實驗生物開展相關實驗，建立生命表并確定接種密度對于種群生長率的影響，并且用3種農藥(毒死蜱、丁草胺、三唑酮)開展了輪蟲毒性試驗。生命表實驗結果表明，輪蟲的平均壽命和世代周期分別為(78.76±33.08) h和(51.56±20.55) h。接種密度實驗結果表明，隨著接種密度的提高，輪蟲種群增長率呈下降趨勢?；诮臃N密度實驗的結果，毒性試驗以35個·(100 mL)-1作為受試種群的起始密度，試驗周期定為144 h。毒性試驗結果顯示，毒死蜱對輪蟲的96 h-EC50和120 h-EC50分別為0.6066 mg·L-1和0.7323 mg·L-1；丁草胺對輪蟲的96 h-EC50和120 h-EC50分別為1.851 mg·L-1和3.058 mg·L-1；三唑酮對輪蟲的96 h-EC50和120 h-EC50分別為12.84 mg·L-1和11.63 mg·L-1。本項研究的結果肯定了以群體取代個體作為輪蟲室內毒性試驗目標物的可行性。

毒死蜱；丁草胺；三唑酮；萼花臂尾輪蟲；毒性試驗；接種密度；試驗周期

輪蟲具有生殖速度快、生活周期短、對毒物敏感、全球分布而成為生態(tài)毒理學研究的受試動物[1]。輪蟲是水生生態(tài)系統(tǒng)中的重要成員，連接食物鏈中的初級生產者與高級消費者，在物質轉化與能量傳遞方面起著十分重要的作用[2]，因此也已經成為水生毒理學研究中的受試動物之一，目前國內外有許多污染物對輪蟲毒性的研究[3]。

開展生態(tài)毒理學研究的一個關鍵問題就是尋找適宜、敏感度高的測試終點[4]。目前，大多數急性毒性試驗所用的受試動物都是臂尾輪蟲屬的種類。Snell等[5]分別利用紅臂尾輪蟲(B. rubens)和褶皺臂尾輪蟲(B. plicatilis)的休眠卵得到受試動物，提出了標準化24 h-LC50實驗方案。目前被美國公共衛(wèi)生協(xié)會(APHA)和美國材料與試驗協(xié)會(ASTM)采用的輪蟲標準毒性試驗方法(24 h急性毒性試驗和48 h無性繁殖試驗)只包括了輪蟲生命史的一部分。但是，就自然環(huán)境中的生物而言，可能是生命史的某階段暴露在毒物中，也可能是生命史都暴露在毒物中，因此，敏感的測試終點應能夠代表整個生命史[4]。從輪蟲的毒性試驗方法和應用上來看，趙玉明等[6]進行了在蒙古裸腹溞培養(yǎng)中用藥物殺滅褶皺臂尾輪蟲的研究，得出了5種常用化學藥物甲醛、次氯酸納、次氯酸鈣、孔雀石綠、碘對蒙古裸腹溞和褶皺臂尾輪蟲的24 h-LC50和48 h-LC50。趙含英等[7]研究了Cu2+對萼花臂尾輪蟲的毒性影響，得出了Cu2+對萼花臂尾輪蟲的24 h、48 h、96 h-LC50。謝欽銘等[8]研究了孔雀石綠、高錳酸鉀和甲醛對褶皺臂尾輪蟲的24 h急性毒性。呂林蘭等[9]采用2天種群增長和生命表，研究了不同濃度氟他胺對萼花臂尾輪蟲的毒性影響。從這些報道可以看出，測試終點集中在24 h和48 h，均以單個個體為實驗對象。如果在24 h和48 h內不頻繁的檢查結果，由于輪蟲生命周期短，生殖速度快，短時間內會產出下一代，如果參照OECD“化學品測試準則202”[10]的毒性測定方法，會在一定程度上對結果的準確性產生很大的影響。因此，探索一個易于操作并能適當延長試驗周期的輪蟲毒性試驗方法具有重要的生態(tài)毒理學意義。

目前，關于萼花臂尾輪蟲毒性試驗方法的研究較少，大多數都是采用24 h或48 h急性試驗的方法，Gallardo等[11]曾參照脊椎動物方法研究激素對褶皺臂尾輪蟲種群變化影響。本文以萼花臂尾輪蟲喂受試生物，系統(tǒng)的提出了以種群增長完成輪蟲毒性試驗的方法，為利用輪蟲評價農藥毒性風險提供依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗生物來源與培養(yǎng)

實驗用的萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus，以下簡稱輪蟲)來自浙江大學農藥與環(huán)境毒理研究所，經實驗室連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間6個月以上。選用蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)作為輪蟲的餌料。藻種來自浙江大學農藥與環(huán)境毒理研究所，實驗室條件下培養(yǎng)至指數生長期，經離心濃縮后至4 ℃冰箱中冷藏待用。采用L9培養(yǎng)液，24 h光照，光照強度為1 000～1 200 lx，培養(yǎng)溫度為25 ℃～30 ℃。

1.2 供試化學品

97%毒死蜱(chlorpyrifos)原藥、90%丁草胺(butachlor)、90%三唑酮(triadimefon)均由浙江新農化工有限公司提供。用丙酮配成一定濃度的母液，使用前用稀釋水配成不同濃度的稀釋液。

1.3 輪蟲的預培養(yǎng)

采用用6孔細胞培養(yǎng)板，每孔放入5只活潑健壯帶孤雌生殖卵的雌體，每4小時觀察一次，待幼體出生后選擇約2 h內幼體作為生命表編制實驗的實驗材料。輪蟲培養(yǎng)液采用Gilbert[2]配方。實驗前，用(美國環(huán)境保護局)EPA[3]為培養(yǎng)液，并調節(jié)pH值為7.5，靜置30 min左右后備用。預培養(yǎng)條件設置為：培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光周期晝長比為16 h∶8 h，光強度為1 000～2 000 lx。以實驗室培養(yǎng)的經離心濃縮的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)作為輪蟲的食物來源，密度約為6×107cells·mL-1。

1.4 生命表實驗

生命表參數的定義和計算方法與席貽龍和黃祥飛的[14]基本相同。采用24孔細胞培養(yǎng)板，每孔添加3 mL EPA培養(yǎng)液，接種1只出生2 h左右的輪蟲，投喂30 μL小球藻，小球藻密度約為6×107cells·mL-1，每4小時檢查一次實驗結果，記錄輪蟲的產卵數、孵化出的幼體數及母體的存活數，并移去幼體，實驗期間不更換培養(yǎng)液。實驗至全部個體死亡為止。實驗共操作了291個輪蟲。

1.5 接種密度實驗

1.5.1 實驗設置

實驗設置了19種接種密度，在預培養(yǎng)輪蟲中挑選活潑健壯的不帶卵的成體，采用100 mL燒杯。分別為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20，1.40，1.60，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00個·mL-1營養(yǎng)液，接種后每天投喂餌料為1 mL，投喂小球藻為用L9營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d左右離心后的小球藻，濃度約為6×107cells·mL-1。光照強度1 000～1 200 lx；控制溫度(25±2) ℃ 。

1.5.2 計數方法

每24 h計數一次，采用1 mL計數板計數，取樣時將燒杯輕輕攪拌，取1 mL輪蟲培養(yǎng)液，在體視鏡下計算輪蟲的總個數，計數3次取平均值。實驗周期為240 h，實驗期間不更換培養(yǎng)液。輪蟲數量的增長倍數和平均日增長率計算方法分別為：

增殖倍數=輪蟲總量/接種輪蟲數

平均日增長率R=(lnNt-lnNo)/t

No和Nt分別表示實驗開始時和結束時輪蟲種群密度，t表示實驗時間[15]。為便于比較，本文在計算日平均增殖率時，Nt均采用輪蟲達到最高密度時的數值。

1.6 三種農藥對輪蟲毒性試驗的應用

采用丙酮為助溶劑設置1個空白對照組和1個丙酮最大濃度(0.01 %)照組，以及5個濃度水平，分別每個濃度設置4個重復。先用丙酮將原藥配成母液，再用稀釋水配成不同濃度的稀釋液。各濃度組稀釋液中丙酮的終濃度不超過0.1 mL·L-1。己有研究顯示該丙酮濃度對實驗結果無顯著影響[16]。設空白和溶劑(丙酮)兩組對照。溶劑對照中丙酮的終濃度與最高濃度組相同。毒死蜱濃度設為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg·L-1；丁草胺的濃度設置為0、1、2、4、6、8 mg·L-1；三唑酮的濃度設置為0、4、6、8、10、14 mg·L-1。根據接種密度實驗結果，每個燒杯中放35個活潑健壯不帶卵的成體。實驗期間不更換實驗溶液。投喂餌料與計數方法同接種密度實驗。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 生命表實驗結果與分析

從表1中得出，輪蟲的平均壽命為(78.76±33.08) h，世代時間為(51.56±20.55) h，可見輪蟲在較短的時間內就可以由幼體轉變?yōu)槌审w，最快在一天左右就進入到繁殖期，大多數的輪蟲在實驗周期內都處在生殖前期和生殖期，輪蟲會產出幼體，幼體會在較短時間內轉化為成體，如果受試輪蟲挑選不嚴密、檢查周期和試驗周期不合理，在很大程度上會影響毒性試驗結果的準確性。

2.2 接種密度實驗結果與分析

通過表2得出接種密度為0.35個·mL-1在第144小時的增殖倍數為136.4，最高種群密度為47.75個·mL-1，在所有接種密度中最高，達到最高種群密度的時間也最短，僅需要144 h。接種密度在低于0.35個·mL-1時，隨著接種密度的增高，在一定時間里所能達到的最高種群密度越高；接種密度在0.40個·mL-1和1.60個·mL-1之間時，隨著接種密度的增高，在一定時間里所能達到的最高種群密度也越高，但是趨勢不明顯；接種密度在2.00個·mL-1和10.00個·mL-1之間時最高種群密度沒有明顯的波動，隨著接種密度的增高，平均日增長率呈明顯的降低趨勢?？傊臃N密度為0.35個·mL-1在所有接種密度中具有很高的代表性，具有短時間內達到最高種群密度的優(yōu)勢，所以選擇0.35個·mL-1作為毒性試驗開展時所需要的接種密度。

選擇差異性較顯著的接種密度組作出圖1。接種密度為0.35個·mL-1在第4至第8天的種群密度明顯高于其他各組。在實驗第5天，接種密度為0.35個·mL-1的種群密度為41個·mL-1，分別是接種密度為0.20個·mL-1、0.60個·mL-1、1.20個·mL-1和2.00個·mL-1的1.28倍、1.86倍、1.62倍和2.05倍。由此可見，接種密度為為0.35個·mL-1在所有各組中種群增長最快，在144 h時達到最高種群密度，所以選擇144 h作為毒性實驗的周期具有合理性。

表1 萼花臂尾輪蟲的生命表Table 1 Brachionus calyciflorus’s life table

表2 不同接種密度下輪蟲可達最高種群密度與種群日平均增殖率Table 2 Maximum population density and population growth rate of Brachionus calyciflorus cultured from the different initial population densities

圖1 不同接種密度對輪蟲種群增長的影響Fig. 1 Effects of initial population densities on population growth of Brachionus calyciflorus

2.3 分析與討論

從輪蟲24 h急性毒性試驗方法的應用來看并不統(tǒng)一，或者沒有嚴格的按照標準方法操作。儲昭霞等[17]取齡長在0～2 h內的輪蟲幼體若干個，將每10個個體放入容量為3 mL的小玻璃杯中，然后加入體積為2 mL(內含密度為3.0×109cells·mL-1的斜生柵藻)的各濃度草甘膦溶液24 h后，檢查記錄每個玻璃杯中輪蟲個體的存活數。黃林等[18]從預培養(yǎng)的試管中隨機吸取帶非混交卵的輪蟲雌體若干個置于培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，2 h后收集孵化出的輪蟲幼體。每10個輪蟲幼體放人容積為5 mL的特制小玻璃杯中，加人3 mL測試液。分別于24 h、48 h后觀察記錄每個小杯中輪蟲的死亡數目。陳艷等[19]取預培養(yǎng)48 h中活潑健壯帶孤雌生殖卵的雌體置入另外同樣條件的燒杯中培養(yǎng)，觀察卵的孵出情況，取2 h內孵出的幼體作為毒性試驗的材料，24 h后觀察記錄試驗結果。張才學等[20]用浮游植物網過濾出幼小輪蟲，在每支試管各加入隨機抽取的30個不帶卵的幼小輪蟲。試驗期間不充氣，約投以1×106cells·mL-1小球藻和少量酵母。于6 h，12 h，24 h分別檢查各時間段的輪蟲死亡個數。然而，對比前人的實驗操作方法，本方法具有較多優(yōu)勢，本方法在輪蟲生命表的基礎上，以種群為研究對象，通過接種密度實驗找到了較適宜的接種密度，克服了頻繁檢查實驗結果的困難(采用24 h檢查一次實驗結果)，將測試周期可以延長到7 d，在一定程度上降低了實驗操作的復雜性，提高了方法的可行性和準確性。

本文應用的毒死蜱、三唑酮和丁草胺都是中國稻田里的常用農藥，將輪蟲的毒性試驗方法應用于這3種農藥具有很高的代表性。毒死蜱(chlorpyrifos)作為高毒有機磷類農藥的替代品種，在我國有著廣闊的應用空間。值得注意的是，隨著該農藥的大力推廣，其親體及代謝產物有可能通過多種途徑進入水體。例如美國環(huán)境保護局(EPA)從1987年開始對毒死蜱的水體污染進行檢測。1987—1996年間在水體中檢測到的毒死蜱濃度為0.04～0.40 μg·L-1，并且呈逐年上升趨勢[21]。至于該農藥的生態(tài)毒性，以往對魚類有較多研究[22-24]，對水生生物的毒性研究還不夠充分。三唑酮(triadimefon)是一種高效、低毒、內吸性強的廣譜殺菌劑，對多種植物上的真菌病害如白粉病、銹病等有良好的防治效果[25]。三唑酮在農田施用后能夠向土壤深處遷移和擴散，從而污染土壤和地下水體，并對土壤生態(tài)環(huán)境造成破壞[26]。Vincelli[27]模擬了三唑酮施用于高爾夫球場后發(fā)現(xiàn)，濃度在0.3 mg·L-1時，三唑酮會大量出現(xiàn)在地表水中。目前，關于三唑類殺菌劑對水生生物的毒性研究不多，國內的相關研究涉及更少。丁草胺(butachlor)是我國在水稻田使用最多的一種除草劑。己有的研究表明丁草胺不僅在上壤中具有明顯的持留性[28]。而且對水生生物有較高的毒性[29]。通過輪蟲毒性試驗方法得到3種農藥對輪蟲的毒性效應，進一步評價了這3種農藥在稻田中應用的風險性。

2.4 輪蟲毒性試驗的結果與分析

通過毒性試驗結果可以得出，3種農藥對輪蟲的毒性大小為毒死蜱>丁草胺>三唑酮。我國“化學農藥環(huán)境安全評價試驗準則”[30]將農藥對溞類的毒性劃分為3個等級：LC50≤1 mg·L-1為高毒，1 mg·L-110 mg·L-1為低毒。按照上述標準， 無論以理論濃度，還是以實測濃度計，以施藥后96 h和120 h來看，毒死蜱對于輪蟲為高毒；丁草胺對輪蟲為中等毒性；三唑酮為低毒。

表3 三種農藥對輪蟲的毒性試驗匯總Table 3 Summary of the three pesticides’ toxicity test to Brachionus calyciflorus

綜上，本文根據輪蟲的生命表實驗，接種密度實驗，選擇了包含輪蟲整個生命周期的試驗周期。從種群增長的角度肯定了以群體取代個體作為輪蟲室內毒性試驗目標物的可行性。

通過把這種輪蟲毒性試驗方法應用到毒死蜱、三唑酮、丁草胺，與輪蟲傳統(tǒng)的24 h和48 h急性毒性方法相比，這種新的方法易于操作，不需要單獨操作一只輪蟲，而是從種群增長的角度完成毒性試驗；便于測定，不需要每4 h或6 h測定一次實驗結果，而是24 h觀察記錄一次實驗結果；誤差相對較小，實驗設置4個重復，取樣前將輪蟲輕輕攪拌均勻，每個重復計數3次求平均值；試驗周期合理，包含了輪蟲的整個生命史。因此，將接種密度設置為35個·(100mL)-1，試驗周期設置為120 h或144 h都較為合理，但這種輪蟲毒性試驗方法的完善和推廣還有待于進一步研究。

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Research on Toxicity Test Method forBrachionuscalyciflorus

Xu Jiyang, Zhang Wenping, Li Shaonan*, Lang Qianping

Institute of Pesticide and Environmental Toxicology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China

5 May 2014 accepted 12 August 2014

To investigate the possibility of taking the populations instead of the individuals as object of indoor toxicity tests of rotifer, Brachionus calyciflorus was employed in this study to perform experiments to establish life-table and to determine population growth rates corresponding to different densities of inoculation. In addition to that, rotifer toxicity tests were performed using three types of pesticides, i.e. chlorpyrifos, butachlor and triadimefon. The experiment for life-table establishment indicated that the average lifetime and generation cycle of the rotifer were (78.76±33.08) h and (51.56±20.55) h, respectively. The experiments on inoculation density indicated that with increase in density of inoculation, growth rate of the populations decreased. Due to the information from the experiments, the toxicity tests started in density of 35 ind·(100 mL)-1and the tests lasted 144 h. Result of the toxicity tests showed that 96 h-EC50and 120 h-EC50were 0.6066 mg·L-1and 0.7323 mg·L-1, respectively, for chlorpyrifos; they were 1.851 mg·L-1and 3.058 mg·L-1, respectively, for butachlor; and the values were 12.84 mg·L-1and 11.63 mg·L-1, respectively, for triadimefon. Result of the study affirmed the possibility of taking the populations instead of the individuals as object of indoor toxicity tests of rotifers.

chlorpyrifos; butachlor; triadimefon; Brachionus calyciflorus; toxicity tests; inoculation density; test period

浙江省自然科學基金(LY12B07008)

徐吉洋(1988-)，男，碩士，研究方向為水生生物生態(tài)毒理，E-mail: xujiyang2012@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: snli@zju.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20140505002

2014-05-05 錄用日期：2014-08-12

1673-5897(2015)2-346-07

X55; Q81

A

李少南(1963—)，農學博士，副教授，主要研究方向為生態(tài)毒理學，重點研究農藥對非目標生物的影響及生態(tài)效應，發(fā)表學術論文60余篇。

徐吉洋, 張文萍, 李少南, 等. 萼花臂尾輪蟲毒性試驗的方法學研究[J]. 生態(tài)毒理學報, 2015, 10(2): 346-352

Xu J Y, Zhang W P, Li S N, et al. Research on toxicity test method for Brachionus calyciflorus [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 346-352 (in Chinese)