王珊，蘇玉紅，喬敏

1. 新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，烏魯木齊 830046 2. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085

酚類化合物短期暴露對(duì)小麥和大麥苗期根伸長(zhǎng)的影響

王珊1,2，蘇玉紅1,*，喬敏2

1. 新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，烏魯木齊 830046 2. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085

采用小麥和大麥為受試作物，以其在受試化合物污染的土壤中培育3 d后獲得的根伸長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度(IC50)評(píng)價(jià)了12種酚類化合物的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，在所設(shè)濃度范圍內(nèi)，酚類對(duì)作物根伸長(zhǎng)均存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。小麥對(duì)受試酚類的IC50范圍為：12.92～231.76 mg·kg-1，其中鄰苯二酚只在最高濃度500 mg·kg-1時(shí)對(duì)小麥的毒性效應(yīng)顯著。大麥對(duì)受試化合物的IC50范圍為：7.15～478.31 mg·kg-1。小麥對(duì)3-甲基酚、雙酚A、2-萘酚和壬基酚相對(duì)敏感，而其它8種化合物則是大麥相對(duì)更敏感。酚類化合物對(duì)小麥和大麥的毒性強(qiáng)度整體趨勢(shì)一致。

酚類化合物；小麥；大麥；根伸長(zhǎng)；植物毒性

酚類物質(zhì)是指芳香環(huán)與羥基相連的一大類有機(jī)化合物，被廣泛地應(yīng)用于石油化工、煉焦、制藥、造紙、顏料合成、木材防腐、塑料制造、皮革等工業(yè)部門(mén)[1-2]，是重要的化工原料之一，也是有毒化學(xué)物質(zhì)。酚類化合物具有致癌、致畸和致突變的潛在毒性[3]。它們經(jīng)空氣及水傳播，可長(zhǎng)期殘留于土壤中，會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重的危害。20世紀(jì)70年代中期，美國(guó)國(guó)家環(huán)保局(Environmental Protection Agency, EPA)就將11種酚類化合物列入129種環(huán)境優(yōu)先污染物之中[4]。中國(guó)也將6種酚類化合物確定為優(yōu)先控制有機(jī)污染物[5]，世界各國(guó)對(duì)于酚類化合物的環(huán)境污染和生態(tài)效應(yīng)都給予了普遍的關(guān)注和高度的重視。

然而，單純的化學(xué)分析不足以評(píng)估污染土壤的潛在生態(tài)影響，因此，利用生物對(duì)污染土壤進(jìn)行生態(tài)毒性評(píng)估獲得了廣泛的關(guān)注[6]。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，研究人員廣泛開(kāi)展生態(tài)毒理試驗(yàn)方法的研究，其中土壤生態(tài)毒理診斷通過(guò)選擇敏感物種(如，土壤微生物、陸生植物、土壤中脊椎動(dòng)物、與土壤接觸的無(wú)脊椎動(dòng)物等)作為毒性診斷的指標(biāo)，提供土壤污染的信息。高等植物是生態(tài)系統(tǒng)中的基本組成部分，利用其生長(zhǎng)狀況診斷土壤污染，是土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要方法之一。目前已建立的高等植物毒理試驗(yàn)方法有根伸長(zhǎng)抑制試驗(yàn)、種子發(fā)芽試驗(yàn)和植物幼苗早期生長(zhǎng)試驗(yàn)[7]。試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)一般選擇種子發(fā)芽率、根伸長(zhǎng)抑制率、芽伸長(zhǎng)抑制率、生物量(鮮重、干重)等。其中植物根因與土壤直接接觸，常常能快速敏感的反映污染物毒性，多項(xiàng)研究結(jié)果也表明對(duì)外源污染物的敏感性短期內(nèi)通常表現(xiàn)為根伸長(zhǎng)抑制率大于芽伸長(zhǎng)等其他評(píng)價(jià)指標(biāo)[8-10]。

小麥作為全球最主要的糧食作物之一，常被用來(lái)進(jìn)行根分生組織細(xì)胞遺傳學(xué)測(cè)試[11]及表征化學(xué)品生態(tài)毒性效應(yīng)[12-13]。大麥在我國(guó)栽培作物中分布最廣泛，也常被用于生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估測(cè)試[14]。本研究選擇典型須根系作物小麥和大麥作為供試作物，采集自然土樣進(jìn)行作物早期生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察酚類化合物污染土壤對(duì)小麥和大麥苗期根伸長(zhǎng)抑制率的影響，確定小麥和大麥根伸長(zhǎng)對(duì)不同酚類物質(zhì)的敏感程度，為快速評(píng)價(jià)酚類污染土壤的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料和儀器

試劑：2,4,6-三氯酚，2,4-二氯酚，2-氯酚，雙酚A(純度均為98%，北京伊諾凱科技有限公司)，4-硝基酚，3-甲基酚，2,4-二甲基酚，苯酚，間苯二酚(純度均為99%，百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司)，鄰苯二酚(純度為99%，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)，壬基酚(純度為98%，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司)，2-萘酚(純度為99%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)，丙酮為國(guó)產(chǎn)色譜純。上述試劑均避光保存。

供試土壤和種子：供試土壤黃棕壤，采自北京市大興區(qū)黃村鎮(zhèn)耕地區(qū)0～20 cm表層黃棕壤(風(fēng)干，過(guò)2 mm篩，無(wú)明顯植物殘?bào)w)，土壤理化性質(zhì)見(jiàn)表1。小麥(Triticum aestivum，中國(guó)春)，大麥(Hordeum vulgare，ZDM09906，〔京〕306)種子購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

儀器：RXZ-430B型培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)，AR224CN型萬(wàn)分之一天平(OHAUS公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)備實(shí)驗(yàn)

稱取100 g風(fēng)干土，直接取配置成0、0.1、1、5、10、50 mg·mL-16個(gè)不同濃度梯度的酚類化合物的丙酮溶液1 mL先與少量土壤混合，通過(guò)遞增土壤、多次混合的方法以達(dá)到均勻染毒的效果。將染毒后的土壤放于通風(fēng)櫥，至溶劑揮發(fā)完全[15]。

將染毒后的土壤依次加入直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，調(diào)節(jié)水土比為1∶5[15]。取200粒種子，先用10%的H2O2消毒10 min，再用去離子水沖洗干凈，然后放入25 ℃人工氣候箱中催芽24 h，挑選出發(fā)芽一致的種子，用鑷子將其均勻播種于土壤中，在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d[16]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用名義濃度表示，為了防止水分流失和揮發(fā)損失，培養(yǎng)過(guò)程中用封口膜密封培養(yǎng)皿，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。確定根伸長(zhǎng)抑制濃度(IC)達(dá)到0%～60%抑制率的區(qū)間后，開(kāi)始正式試驗(yàn)。

表1 土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil

注：C/N表示碳氮比，CEC表示陽(yáng)離子交換量，WHC表示土壤持水量。

Note: C/N is the ratio of total carbon and total nitrogen, CEC is short for cation exchange capacity, WHC is short for water holding capacity.

1.2.2 正式實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置至少6個(gè)不同處理濃度，每個(gè)處理放入10粒種子。在與預(yù)備試驗(yàn)相同的溫度、水分等條件下，培養(yǎng)3 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，記錄下各處理土壤中種子根伸長(zhǎng)(根長(zhǎng)的測(cè)定以胚軸與根之間的過(guò)度點(diǎn)開(kāi)始)，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。各化合物正式實(shí)驗(yàn)設(shè)置濃度列于表2，其中苯酚對(duì)小麥的毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)加設(shè)了200 mgkg-1濃度。

表2 12種酚類化合物植物毒性正式試驗(yàn)濃度設(shè)置Table 2 Test concentrations of 12 phenols

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Sigma Plot 10.0對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)抑制率與供試污染物濃度進(jìn)行擬合，SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)分析，并且所有數(shù)據(jù)顯著性差異水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果(Results)

2.1 酚類對(duì)植物根伸長(zhǎng)的毒性

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)在低濃度時(shí)對(duì)作物根伸長(zhǎng)影響不顯著甚至促進(jìn)根伸長(zhǎng)，高濃度時(shí)則存在抑制作用。隨著濃度的進(jìn)一步升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)。例如壬基酚，在其濃度為1、10、50 mg·kg-1時(shí)，對(duì)大麥根伸長(zhǎng)的抑制率分別為-5.42%、-7.51%、-3.29%，當(dāng)其濃度高于50 mg·kg-1時(shí)，對(duì)大麥根伸長(zhǎng)抑制率隨濃度升高，抑制作用也越強(qiáng)，在最高設(shè)定濃度500 mg·kg-1，抑制率達(dá)到75.72%。與相關(guān)文獻(xiàn)中酚類對(duì)植物生長(zhǎng)影響作用趨勢(shì)結(jié)論一致[17]。

將小麥和大麥根伸長(zhǎng)抑制率與酚類化合物設(shè)定的濃度進(jìn)行擬合，得到酚類化合物對(duì)小麥(表3)和大麥(表4)根伸長(zhǎng)抑制的IC50值。對(duì)比不同酚類化合物作用于同種作物的IC50值，發(fā)現(xiàn)除雙酚A、2-萘酚和2,4-二甲基酚外，酚類化合物對(duì)兩種作物的毒性趨勢(shì)一致，均是2,4,6-三氯酚>2,4二氯酚> 4-硝基酚>2-氯酚>3-甲基酚>苯酚>間苯二酚>壬基酚>鄰苯二酚。并且由回歸方程及其相關(guān)系數(shù)(R)可以看出酚類對(duì)小麥和大麥毒性存在明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系。

12種酚類化合物中3-甲基酚、壬基酚、2-萘酚和雙酚A共4種化合物對(duì)小麥的IC50值分別為62.40、38.83、63.59、175.70 mg·kg-1，低于大麥相應(yīng)的IC50值，可見(jiàn)小麥對(duì)這4種物質(zhì)相對(duì)敏感，而其它8種化合物則是大麥相對(duì)更敏感。

3 討論(Discussion)

本研究以小麥和大麥根伸長(zhǎng)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析了12種酚類化合物的生態(tài)毒性。結(jié)果表明，酚類化合物毒性整體趨勢(shì)為氯酚>甲基酚>苯酚>二元酚，4-硝基酚毒性介于2,4-二氯酚和2-氯酚之間，壬基酚毒性介于間苯二酚和鄰苯二酚之間，雙酚A和2-萘酚因其對(duì)2種作物的IC50值有顯著不同，故不適用此規(guī)律。 本研究發(fā)現(xiàn)在最低設(shè)定濃度下，2,4二氯酚、2-氯酚、雙酚A、2,4-二甲基酚、間苯二酚和2-萘酚化合物對(duì)作物根伸長(zhǎng)影響與空白對(duì)照沒(méi)有顯著差異；2,4,6-三氯酚表現(xiàn)出顯著抑制作用；3-甲基酚、苯酚、壬基酚、4-硝基酚、鄰苯二酚均表現(xiàn)刺激根伸長(zhǎng)效應(yīng)。

表3 酚類化合物濃度對(duì)小麥根伸長(zhǎng)抑制率的回歸方程和IC50值Table 3 Regression equation between phenols concentration and inhibition rate of root elongation for wheat and the calculated IC50 values

表4 酚類化合物濃度對(duì)大麥根伸長(zhǎng)抑制率的回歸方程和IC50值Table 4 Regression equation between phenols concentration and inhibition rate of root elongation for barley and the calculated IC50 values

而在在高濃度范圍內(nèi)所有酚類均表現(xiàn)出顯著抑制作用。這種毒物在較低的濃度下表現(xiàn)出對(duì)植物生長(zhǎng)的刺激作用，在高濃度時(shí)則表現(xiàn)出對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用的雙相劑量-效應(yīng)關(guān)系被稱為毒物刺激效應(yīng)(hormesis效應(yīng))，又稱毒物興奮效應(yīng)。有研究認(rèn)為化學(xué)興奮效應(yīng)廣泛存在于不同種屬、不同結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)中以及各種生命終點(diǎn)[18-19]。Calabrese等[18]統(tǒng)計(jì)了1 450篇文獻(xiàn)中約5 600個(gè)劑量效應(yīng)關(guān)系，建立了毒物刺激效應(yīng)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)在重金屬、抗生素、有機(jī)物等化學(xué)物質(zhì)中均存在這種刺激效應(yīng)。關(guān)于毒物刺激效應(yīng)機(jī)制也引起廣泛關(guān)注，在少有的相關(guān)研究報(bào)道中，普遍認(rèn)為低濃度范圍內(nèi)自由基(活性氧)含量升高，可以激活蛋白酶，調(diào)節(jié)合成以及誘導(dǎo)基因表達(dá)等，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為生長(zhǎng)刺激效應(yīng)[20-21]。

4-硝基酚是一種重要的有機(jī)合成原料，還是醫(yī)藥工業(yè)和染料工業(yè)的重要中間體。酚類化合物對(duì)枯草芽孢桿菌[22]和大鼠肝細(xì)胞[23]的毒性研究比較發(fā)現(xiàn)：2,4-二氯酚>4-硝基酚>2-氯酚，本研究以小麥和大麥根伸長(zhǎng)的IC50值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，測(cè)得3種化合物對(duì)2種作物的毒性大小順序同樣為：2,4-二氯酚>4-硝基酚>2-氯酚，與上述結(jié)論相符。

氯酚化合物是芳香族化合物中用途最廣、毒性較大、污染較嚴(yán)重的一類化合物，通常包括一個(gè)羥基和不同數(shù)目的氯原子取代苯環(huán)上的氫原子。有研究指出，氯酚的分子結(jié)構(gòu)如氯化的程度以及氯原子和羥基基團(tuán)的位置對(duì)毒性都有較大影響[24]。董克虞等[25]研究了氯代酚類污染物結(jié)構(gòu)與冬小麥、蘿卜、油菜等作物毒性的關(guān)系，結(jié)果表明氯代酚毒性都大于苯酚，其毒性隨苯環(huán)上氫原子被氯取代個(gè)數(shù)的增加而增大，且取代個(gè)數(shù)相同時(shí)，不同取代部位的毒性不同，鄰位取代毒性最大，與本研究趨勢(shì)一致。

甲基酚化合物被廣泛用作染料、表面活性劑、殺蟲(chóng)劑、農(nóng)藥、酚醛樹(shù)脂和黏合劑等。目前，國(guó)內(nèi)外已利用魚(yú)類、細(xì)菌和海藻等實(shí)驗(yàn)生物[26-27]的不同指標(biāo)，對(duì)不同的甲基酚類化合物進(jìn)行了毒性實(shí)驗(yàn)，然而涉及其植物毒性的研究較少。有研究采用月牙藻對(duì)苯酚、氯酚和甲基酚類化合物毒性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)氯酚和甲基酚毒性均高于苯酚，且相同取代位置上氯酚毒性均高于甲基酚[26]，與本研究結(jié)論相符。劉征濤等[27]研究甲基酚類化合物對(duì)發(fā)光菌的毒性，結(jié)果表明甲基酚毒性排序?yàn)椋?,4-二甲基酚>2,6-二甲基酚>2-甲基酚>3-甲基酚。本實(shí)驗(yàn)反而是3-甲基酚高于2,4-二甲基酚，可能是因?yàn)椴捎貌煌铮←溂按篼湆?duì)兩種化合物敏感程度和月牙藻不同。

間苯二酚與鄰苯二酚作為重要的精細(xì)化工中間體，被廣泛應(yīng)用于塑料、農(nóng)藥、抗氧化劑、染料、涂料等精細(xì)化工產(chǎn)品的生產(chǎn)中。研究表明，間苯二酚對(duì)黃瓜的毒性比苯酚低[28]，本研究也得出相同結(jié)果。王洪斌等[29]研究間苯二酚對(duì)3種海洋微藻的毒性發(fā)現(xiàn)隨其濃度的升高對(duì)藻類的毒性增強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)間苯二酚對(duì)小麥和大麥的毒性趨勢(shì)與之一致，且間苯二酚毒性高于鄰苯二酚。

壬基酚是非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚的主要的生物代謝產(chǎn)物。目前，研究人員就壬基酚對(duì)魚(yú)類、藻類、哺乳動(dòng)物的毒害作過(guò)大量的研究[30-31]，但有關(guān)其對(duì)陸生植物的毒性效應(yīng)的研究相對(duì)很少。Domene等[32]以油菜和黑麥草的發(fā)芽率及生物量鮮重為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)壬基酚毒性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)黑麥草的生物量鮮重對(duì)其毒性最敏感，IC50值為1 449.1 mg·kg-1。比本實(shí)驗(yàn)小麥和大麥根伸長(zhǎng)IC50值175.70 mg·kg-1和181.75 mg·kg-1高出8倍之多。

雙酚A作為環(huán)境激素類物質(zhì)，在眾多工業(yè)產(chǎn)品中被廣泛使用。有研究以大豆幼苗地上部各組織為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)雙酚A毒性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其濃度為1.5 mg·L-1時(shí)，對(duì)各指標(biāo)均有促進(jìn)作用，在濃度為7.0～50 mg·L-1時(shí)，隨濃度升高，抑制作用增強(qiáng)[33]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2-萘酚是一種典型的酚類化合物，主要用于有機(jī)合成原料及染料中間體，也是橡膠防老劑、選礦劑、殺菌劑、防霉劑、防腐劑、防治寄生蟲(chóng)和驅(qū)蟲(chóng)藥物等的原料。本研究獲得2-萘酚對(duì)小麥和大麥根伸長(zhǎng)IC50值分別為63.59 mg·kg-1和139.71 mg·kg-1。有報(bào)道2-萘酚對(duì)黃瓜根伸長(zhǎng)抑制的IC50值為69.2 mg·L-1[28]。

綜上所述，可以得到以下結(jié)論：(1)低濃度酚類物質(zhì)對(duì)小麥和大麥苗期生長(zhǎng)影響不顯著甚至促進(jìn)根伸長(zhǎng)，高濃度酚類物質(zhì)對(duì)其生長(zhǎng)存在抑制作用。(2)酚類化合物取代基的種類影響其對(duì)小麥和大麥的毒性，整體表現(xiàn)為：氯酚>甲基酚>苯酚>二元酚。氯酚對(duì)小麥和大麥的毒性隨其氯化程度的增加而增大。(3)小麥對(duì)3-甲基酚、雙酚A、2-萘酚和壬基酚4種化合物污染較敏感，而對(duì)于其他受試化合物則是大麥更敏感。

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Effect of Short-term Exposure of Phenols on Root Elongation of Wheat and Barley

Wang Shan1,2, Su Yuhong1,*, Qiao Min2

1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, Urumqi 830046, China 2. Research Center for Eco-environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

7 March 2014 accepted 9 May 2014

To evaluate the toxic effects of 12 phenols, the root elongation of wheat and barley after exposure to different concentrations of phenols were investigated. Results showed that root elongation was significantly inhibited with the increasing of phenol concentration. The IC50(half maximal inhibitory concentration of root elongation) was used as an indicator. The IC50values ranged from 12.92 to 231.76 mg·kg-1for wheat and between 7.15 and 478.31 mg·kg-1for barley. For pyrocatechol, significant inhibition of root elongation for wheat was observed only under the highest concentration of 500 mg·kg-1. Wheat was relatively more sensitive to 3-cresol, bisphenol A, 2-naphthol and nonylphenol, while barley was more sensitive to other phenols. In general, the rank of phenols toxicity on wheat was similar to that of barley.

phenols; wheat; barley; root elongation; phytotoxicity

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2012AA06302)；國(guó)家自然科學(xué)基金(21377154)

王珊(1989-)，女，碩士，研究方向?yàn)槎纠韺W(xué)，E-mail: wangshan870325@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: yuhong_su2010@sina.com

10.7524/AJE.1673-5897.20140307001

2014-03-07 錄用日期：2014-05-09

1673-5897(2015)2-283-07

X171.5

A

蘇玉紅(1973-)，女，博士，教授，主要研究方向?yàn)橛袡C(jī)污染物在植物體內(nèi)的遷移、轉(zhuǎn)化、過(guò)程及機(jī)制，發(fā)表學(xué)術(shù)論文40余篇。

王珊, 蘇玉紅, 喬敏. 酚類化合物短期暴露對(duì)小麥和大麥苗期根伸長(zhǎng)的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(2): 283-289

Wang S, Su Y H, Qiao M. Effect of short-term exposure of phenols on root elongation of wheat and barley [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 283-289 (in Chinese)