徐軼 ，章白苓 ，章潔苓 ，尚姝 ，張楠 ，胡曉彥

(1、江西省人民醫(yī)院高干病房,江西 南昌330006；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

由于抗菌藥物在臨床的廣泛使用，鮑曼不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌，檢出率和耐藥率不斷攀升，并且由單一耐藥到多重耐藥，甚至出現(xiàn)對(duì)臨床常用抗菌藥物呈泛耐藥現(xiàn)象[1]，鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，近年來(lái)對(duì)修飾酶、降解酶和作用靶位的改變等方面耐藥機(jī)制的研究較多，而對(duì)主動(dòng)外排系統(tǒng)在鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制中的作用研究甚少。主動(dòng)外排系統(tǒng)由細(xì)菌胞膜介導(dǎo)抗菌劑外排的蛋白組成，是導(dǎo)致細(xì)菌多重耐藥的重要原因[2，3]。為了解鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排泵基因，探討其耐藥機(jī)制，我們對(duì)主動(dòng)外排泵adeB基因表達(dá)水平與臨床分離的泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(pan-drug resistance Acinetobacter baumannii，PRABA)耐藥性的關(guān)系進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2010年1月至2011年12月臨床分離的PRABA菌36株,江西省人民醫(yī)院2010年1月至2011年12月臨床分離的PRABA菌14株，共50株。標(biāo)本種類包括痰液30株、傷口分泌物13株、尿液5株、血液2株。同一患者的重復(fù)標(biāo)本按1株計(jì)算。其中ICU20株，呼吸內(nèi)科15株，神經(jīng)外科10株，骨科5株，4株P(guān)SABA菌株。所有菌株經(jīng)Vitek2-compact微生物鑒定儀鑒定。質(zhì)控菌株：銅綠假單胞菌ATCC 27853，大腸埃希菌ATCC 25922。

1.1.2 主要儀器及試劑 Vitek2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀(法國(guó)生物梅里埃公司)；9700PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(英國(guó)GENE GENIUS 公司)。 氧氟沙星(OFLX)、慶大霉素(GEN)、四環(huán)素(TET)、頭孢噻肟(CTX)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物品檢定所；亞胺培南(IPM杭州默沙東有限公司)；泵抑制劑羰基氰氯苯腙 (CCCP)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。RNA提取Trizol試劑盒為美國(guó)Molecular Research Center公司產(chǎn)品，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 外排泵表型檢測(cè) 用瓊脂稀釋法檢測(cè)5種抗菌藥物 OFLX、GEN、TET、CTX、IPM 的 MIC。 同時(shí)制備含有CCCP的MH瓊脂，CCCP濃度20μg/ml，同樣用瓊脂稀釋法檢測(cè)上述5種抗菌藥物對(duì)各菌株的MIC值。加入CCCP后的MIC值下降≥4倍時(shí)，則可判定外排泵表型陽(yáng)性[4]。

1.2.2 adeB基因檢測(cè) 細(xì)菌DNA提取采用煮沸法。 引物合成：P1：5′-AAA GAC TTC AAA GAG CGG ACT A-3′;P2：5′-TCA CGC ATT GCT TCA CCG-3′。 反應(yīng)總體積 50μl；Taq 酶 25μl，上、下游引物 P1、P2 各 2μl，模板 DNA 2μl，雙蒸水 19μl。 反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)下成像分析結(jié)果。隨機(jī)選取10個(gè)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)序。

1.2.3 adeB基因表達(dá)水平檢測(cè) 細(xì)菌總RNA提取按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。RT-PCR擴(kuò)增引物為P1和P2，內(nèi)參基因recA擴(kuò)增引物序列為5′-TTT CAC AAC CCG ACA ATG-3′和 5′-TGC CTC GCT CAT AAG ACG-3′。操作方法參照說(shuō)明書進(jìn)行一步法RT-PCR 反應(yīng)。 反應(yīng)條件：45℃ 45min；95℃ 2min；94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，30 個(gè) 循 環(huán) ；72℃7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)成像后用美國(guó)Quantity One 4.4軟件分析所得相對(duì)灰度值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)前處理 用WHO NET5.4和SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外排泵表型檢測(cè)結(jié)果 50株P(guān)RABA菌株對(duì)OFLX、GEN、TET、CTX、IPM 的 MIC 值范圍分別為36 ～128μg/ml、2048 ～8192μg/ml、1024 ～2048μg/ml、512～1024μg/ml和 4～128μg/ml。

以加入CCCP的MIC值比不加降低4倍或以上作為外排表型陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)，OFLX 45株陽(yáng)性、GEN 50株全部陽(yáng)性、TET 42株陽(yáng)性、CTX 50株全部陽(yáng)性、IPM 45株陽(yáng)性。在僅含 20μg/ml CCCP的瓊脂平板中，所有試驗(yàn)菌株均生長(zhǎng)良好，表明20μg/ml CCCP對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。

2.2 adeB基因檢測(cè)結(jié)果 50株P(guān)RABA菌和4株P(guān)SABA菌株產(chǎn)物均檢測(cè)到目的基因adeB基因條帶，片段約為675bp，ATCC 27853未見擴(kuò)增片段。結(jié)果見圖1(部分結(jié)果圖)。隨機(jī)選取10個(gè)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，在GenBanK基因庫(kù)中比對(duì)分析，7號(hào)菌株結(jié)果與登陸號(hào)NC009085.1的菌株親緣關(guān)系最近，其同源性為100%，3號(hào)菌株結(jié)果與登陸號(hào)NC009085.1的菌株親緣同源性為98%，其他菌株同源性為99%。見圖2。

圖1 adeB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 adeB基因測(cè)序圖

2.3 adeB基因表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 以adeB和recA電泳條帶灰度值的比值(adeB/recA)表示adeB相對(duì)表達(dá)水平，PRABA組和PSABA組細(xì)菌株adeB/recA 計(jì)算結(jié)果分別為(3.52±0.68)和(0.85±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛分布于自然界和醫(yī)院環(huán)境，是醫(yī)院感染的重要病原菌[5]，鮑曼不動(dòng)桿菌作為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌已引起世界范圍內(nèi)的廣泛重視，隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素和第三代頭孢菌素等廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，誘導(dǎo)了大量耐藥株的產(chǎn)生，由單一抗生素耐藥發(fā)展到多重耐藥，甚至出現(xiàn)了泛耐菌株，給抗感染治療帶來(lái)巨大困難[5，6]。從本組50株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株來(lái)源，主要來(lái)源于ICU、呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科和骨科，標(biāo)本主要為痰液和傷口分泌物，ICU、呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科鮑曼不動(dòng)桿菌分離率高，與這3個(gè)科室住院患者住院時(shí)間長(zhǎng)，大多有嚴(yán)重疾病和長(zhǎng)期使用廣譜抗生素有關(guān)。

鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，其中細(xì)菌的主動(dòng)外排泵系統(tǒng)是介導(dǎo)細(xì)菌多重藥物耐藥的主要機(jī)制[7]，依據(jù)氨基酸序列的同源性可分為5個(gè)主要超家族[8]，包括ATP結(jié)合盒超家族(ABC)、主要易化子超家族(MFS)、耐藥節(jié)結(jié)化分化家族(RND)、多藥及毒性化合物外排家族(MATE)和小多重耐藥性家族(SMR)。

Sophie Magnet等在一株鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥株BM 4454中發(fā)現(xiàn)存在adeABC基因簇編碼的泵出系統(tǒng)，經(jīng)證實(shí)，AdeABC是鮑曼不動(dòng)桿菌所特有[9]。AdeABC外排泵隱藏在野生的鮑曼不動(dòng)桿菌中，其作用受到AdeRS調(diào)控[10],AdeB蛋白包含12個(gè)跨膜片段，此類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)多種抗生素有轉(zhuǎn)運(yùn)作用，屬于RND類[11]。我們研究發(fā)現(xiàn)，臨床分離的泛耐藥株和敏感株均能檢測(cè)到adeB基因[12，13]。通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)該基因mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)泛耐藥菌株表達(dá)水平顯著高于敏感株[13，14]，這種編碼外排泵的基因高表達(dá)可能導(dǎo)致了該菌的泛耐藥和多重耐藥。外排泵基因adeABC位于鮑曼不動(dòng)桿菌的染色體基因組中，無(wú)論敏感或耐藥菌株均普遍存在，而在敏感菌株中不表達(dá)或低表達(dá)，可能與泵基因上游的調(diào)控序列有關(guān)。

本研究中通過(guò)PCR擴(kuò)增受試菌株的adeB基因，測(cè)序分析顯示其序列與GenBank上登陸的登陸號(hào)NC009085.1adeB的同源性為98.0%～100%，證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物為adeB基因。

CCCP作為一種外排耐藥系統(tǒng)抑制劑，是一種抑制質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的解偶聯(lián)劑，可以阻斷菌體表面蛋白能量的供應(yīng)，使外排泵無(wú)法正常工作，藥物不被外排而蓄積于菌體內(nèi)，恢復(fù)細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性[15]。我們研究試驗(yàn)表明，PRABA菌株加入CCCP 20μg/ml后，四環(huán)素、氧氟沙星、亞胺培南、頭孢噻肟、慶大霉素MIC值小于原值的1/4或1/4以下，分別為84%～100%，以慶大霉素下降最明顯。這說(shuō)明CCCP外排泵抑制劑對(duì)逆轉(zhuǎn)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥行之有效，但是對(duì)于不同抗菌藥物的耐藥性逆轉(zhuǎn)程度有所差異。表明鮑曼不動(dòng)桿菌中存在主動(dòng)外排機(jī)制，鮑曼不動(dòng)桿菌的高度耐藥與藥物主動(dòng)外排系統(tǒng)密切相關(guān)。

綜上所述，主動(dòng)外排系統(tǒng)在介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥和泛耐藥中發(fā)揮重要作用，編碼基因adeB高表達(dá)導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌同時(shí)對(duì)幾類藥物耐受，泵抑制劑能夠部份逆轉(zhuǎn)這種耐受，但是，有關(guān)外排泵的底物與耐藥表型的關(guān)系還未完全明確，因此，應(yīng)加強(qiáng)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制的基礎(chǔ)研究，改進(jìn)藥物設(shè)計(jì)，研發(fā)新型藥物，為臨床更好地選擇藥物和更有效地治療疾病提供理論基礎(chǔ)。

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