徐軼 ，章白苓 ，章潔苓 ，尚姝 ，張楠 ，胡曉彥

(1、江西省人民醫(yī)院高干病房,江西 南昌330006；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

由于抗菌藥物在臨床的廣泛使用，鮑曼不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌，檢出率和耐藥率不斷攀升，并且由單一耐藥到多重耐藥，甚至出現(xiàn)對(duì)臨床常用抗菌藥物呈泛耐藥現(xiàn)象[1]，鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，近年來(lái)對(duì)修飾酶、降解酶和作用靶位的改變等方面耐藥機(jī)制的研究較多，而對(duì)主動(dòng)外排系統(tǒng)在鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制中的作用研究甚少。主動(dòng)外排系統(tǒng)由細(xì)菌胞膜介導(dǎo)抗菌劑外排的蛋白組成，是導(dǎo)致細(xì)菌多重耐藥的重要原因[2，3]。為了解鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排泵基因，探討其耐藥機(jī)制，我們對(duì)主動(dòng)外排泵adeB基因表達(dá)水平與臨床分離的泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(pan-drug resistance Acinetobacter baumannii，PRABA)耐藥性的關(guān)系進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2010年1月至2011年12月臨床分離的PRABA菌36株,江西省人民醫(yī)院2010年1月至2011年12月臨床分離的PRABA菌14株，共50株。標(biāo)本種類(lèi)包括痰液30株、傷口分泌物13株、尿液5株、血液2株。同一患者的重復(fù)標(biāo)本按1株計(jì)算。其中ICU20株，呼吸內(nèi)科15株，神經(jīng)外科10株，骨科5株，4株P(guān)SABA菌株。所有菌株經(jīng)Vitek2-compact微生物鑒定儀鑒定。質(zhì)控菌株：銅綠假單胞菌ATCC 27853，大腸埃希菌ATCC 25922。

1.1.2 主要儀器及試劑 Vitek2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀(法國(guó)生物梅里埃公司)；9700PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(英國(guó)GENE GENIUS 公司)。 氧氟沙星(OFLX)、慶大霉素(GEN)、四環(huán)素(TET)、頭孢噻肟(CTX)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物品檢定所；亞胺培南(IPM杭州默沙東有限公司)；泵抑制劑羰基氰氯苯腙 (CCCP)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。RNA提取Trizol試劑盒為美國(guó)Molecular Research Center公司產(chǎn)品，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 外排泵表型檢測(cè) 用瓊脂稀釋法檢測(cè)5種抗菌藥物 OFLX、GEN、TET、CTX、IPM 的 MIC。 同時(shí)制備含有CCCP的MH瓊脂，CCCP濃度20μg/ml，同樣用瓊脂稀釋法檢測(cè)上述5種抗菌藥物對(duì)各菌株的MIC值。加入CCCP后的MIC值下降≥4倍時(shí)，則可判定外排泵表型陽(yáng)性[4]。

1.2.2 adeB基因檢測(cè) 細(xì)菌DNA提取采用煮沸法。 引物合成：P1：5′-AAA GAC TTC AAA GAG CGG ACT A-3′;P2：5′-TCA CGC ATT GCT TCA CCG-3′。 反應(yīng)總體積 50μl；Taq 酶 25μl，上、下游引物 P1、P2 各 2μl，模板 DNA 2μl，雙蒸水 19μl。 反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)下成像分析結(jié)果。隨機(jī)選取10個(gè)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)序。

1.2.3 adeB基因表達(dá)水平檢測(cè) 細(xì)菌總RNA提取按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。RT-PCR擴(kuò)增引物為P1和P2，內(nèi)參基因recA擴(kuò)增引物序列為5′-TTT CAC AAC CCG ACA ATG-3′和 5′-TGC CTC GCT CAT AAG ACG-3′。操作方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行一步法RT-PCR 反應(yīng)。 反應(yīng)條件：45℃ 45min；95℃ 2min；94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，30 個(gè) 循 環(huán) ；72℃7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)成像后用美國(guó)Quantity One 4.4軟件分析所得相對(duì)灰度值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)前處理 用WHO NET5.4和SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外排泵表型檢測(cè)結(jié)果 50株P(guān)RABA菌株對(duì)OFLX、GEN、TET、CTX、IPM 的 MIC 值范圍分別為36 ～128μg/ml、2048 ～8192μg/ml、1024 ～2048μg/ml、512～1024μg/ml和 4～128μg/ml。

以加入CCCP的MIC值比不加降低4倍或以上作為外排表型陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)，OFLX 45株陽(yáng)性、GEN 50株全部陽(yáng)性、TET 42株陽(yáng)性、CTX 50株全部陽(yáng)性、IPM 45株陽(yáng)性。在僅含 20μg/ml CCCP的瓊脂平板中，所有試驗(yàn)菌株均生長(zhǎng)良好，表明20μg/ml CCCP對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。

2.2 adeB基因檢測(cè)結(jié)果 50株P(guān)RABA菌和4株P(guān)SABA菌株產(chǎn)物均檢測(cè)到目的基因adeB基因條帶，片段約為675bp，ATCC 27853未見(jiàn)擴(kuò)增片段。結(jié)果見(jiàn)圖1(部分結(jié)果圖)。隨機(jī)選取10個(gè)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，在GenBanK基因庫(kù)中比對(duì)分析，7號(hào)菌株結(jié)果與登陸號(hào)NC009085.1的菌株親緣關(guān)系最近，其同源性為100%，3號(hào)菌株結(jié)果與登陸號(hào)NC009085.1的菌株親緣同源性為98%，其他菌株同源性為99%。見(jiàn)圖2。

圖1 adeB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 adeB基因測(cè)序圖

2.3 adeB基因表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 以adeB和recA電泳條帶灰度值的比值(adeB/recA)表示adeB相對(duì)表達(dá)水平，PRABA組和PSABA組細(xì)菌株adeB/recA 計(jì)算結(jié)果分別為(3.52±0.68)和(0.85±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛分布于自然界和醫(yī)院環(huán)境，是醫(yī)院感染的重要病原菌[5]，鮑曼不動(dòng)桿菌作為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌已引起世界范圍內(nèi)的廣泛重視，隨著β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和第三代頭孢菌素等廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，誘導(dǎo)了大量耐藥株的產(chǎn)生，由單一抗生素耐藥發(fā)展到多重耐藥，甚至出現(xiàn)了泛耐菌株，給抗感染治療帶來(lái)巨大困難[5，6]。從本組50株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株來(lái)源，主要來(lái)源于ICU、呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科和骨科，標(biāo)本主要為痰液和傷口分泌物，ICU、呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科鮑曼不動(dòng)桿菌分離率高，與這3個(gè)科室住院患者住院時(shí)間長(zhǎng)，大多有嚴(yán)重疾病和長(zhǎng)期使用廣譜抗生素有關(guān)。

鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，其中細(xì)菌的主動(dòng)外排泵系統(tǒng)是介導(dǎo)細(xì)菌多重藥物耐藥的主要機(jī)制[7]，依據(jù)氨基酸序列的同源性可分為5個(gè)主要超家族[8]，包括ATP結(jié)合盒超家族(ABC)、主要易化子超家族(MFS)、耐藥節(jié)結(jié)化分化家族(RND)、多藥及毒性化合物外排家族(MATE)和小多重耐藥性家族(SMR)。

Sophie Magnet等在一株鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥株BM 4454中發(fā)現(xiàn)存在adeABC基因簇編碼的泵出系統(tǒng)，經(jīng)證實(shí)，AdeABC是鮑曼不動(dòng)桿菌所特有[9]。AdeABC外排泵隱藏在野生的鮑曼不動(dòng)桿菌中，其作用受到AdeRS調(diào)控[10],AdeB蛋白包含12個(gè)跨膜片段，此類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)多種抗生素有轉(zhuǎn)運(yùn)作用，屬于RND類(lèi)[11]。我們研究發(fā)現(xiàn)，臨床分離的泛耐藥株和敏感株均能檢測(cè)到adeB基因[12，13]。通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)該基因mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)泛耐藥菌株表達(dá)水平顯著高于敏感株[13，14]，這種編碼外排泵的基因高表達(dá)可能導(dǎo)致了該菌的泛耐藥和多重耐藥。外排泵基因adeABC位于鮑曼不動(dòng)桿菌的染色體基因組中，無(wú)論敏感或耐藥菌株均普遍存在，而在敏感菌株中不表達(dá)或低表達(dá)，可能與泵基因上游的調(diào)控序列有關(guān)。

本研究中通過(guò)PCR擴(kuò)增受試菌株的adeB基因，測(cè)序分析顯示其序列與GenBank上登陸的登陸號(hào)NC009085.1adeB的同源性為98.0%～100%，證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物為adeB基因。

CCCP作為一種外排耐藥系統(tǒng)抑制劑，是一種抑制質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的解偶聯(lián)劑，可以阻斷菌體表面蛋白能量的供應(yīng)，使外排泵無(wú)法正常工作，藥物不被外排而蓄積于菌體內(nèi)，恢復(fù)細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性[15]。我們研究試驗(yàn)表明，PRABA菌株加入CCCP 20μg/ml后，四環(huán)素、氧氟沙星、亞胺培南、頭孢噻肟、慶大霉素MIC值小于原值的1/4或1/4以下，分別為84%～100%，以慶大霉素下降最明顯。這說(shuō)明CCCP外排泵抑制劑對(duì)逆轉(zhuǎn)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥行之有效，但是對(duì)于不同抗菌藥物的耐藥性逆轉(zhuǎn)程度有所差異。表明鮑曼不動(dòng)桿菌中存在主動(dòng)外排機(jī)制，鮑曼不動(dòng)桿菌的高度耐藥與藥物主動(dòng)外排系統(tǒng)密切相關(guān)。

綜上所述，主動(dòng)外排系統(tǒng)在介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥和泛耐藥中發(fā)揮重要作用，編碼基因adeB高表達(dá)導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌同時(shí)對(duì)幾類(lèi)藥物耐受，泵抑制劑能夠部份逆轉(zhuǎn)這種耐受，但是，有關(guān)外排泵的底物與耐藥表型的關(guān)系還未完全明確，因此，應(yīng)加強(qiáng)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制的基礎(chǔ)研究，改進(jìn)藥物設(shè)計(jì)，研發(fā)新型藥物，為臨床更好地選擇藥物和更有效地治療疾病提供理論基礎(chǔ)。

[1]Chan P C.Control of an outbreak of pandrug resistant Acinetobacter baumannii colonization and infection in a neonatal intensive care unit[J].Infect Control Hosp Epidemiol,2007,28(4):423-429.

[2]Viveiros M,Martins M,Couto I,et al.New met hods for the identification of efflux mediated MDR bacteria,genetic assessment of regulators and efflux pump constituents,characterization of efflux systems and screening for inhibitors of efflux pumps[J].Curr Drug Targets,2008,9(9):760-778.

[3]Poole K.Efflux mediated antimicrobial resistance[J].J Antimicrob Chemother,2005,56(1):20-51.

[4]Ribera A，Ruiz J，Anta MT，et al．Effect of an efflux pump inhibi-tor on the MIC of nalidixic acid for Acinetobacter baumannii and Stenotrophomonas maltophilia clinical isolates [J]．J Antimicrob Chemother，2002，49(4):697－698．

[5]史俊艷,張小江,徐英春.2007年中國(guó)CHINET鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志,2009,9(3):196-200.

[6]胡瑩,劉曉莉,馬潤(rùn),等,昆明地區(qū)燒傷病房鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性和分子流行病學(xué)調(diào)查[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2014,32(5):508-510.

[7]于翠香,傅愛(ài)玲,王英田,等,多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌抗菌制劑外排泵基因研究[J].中國(guó)抗生素雜志,2013,38(8):629-632.

[8]Li XZ,Zhang L,Nikaido H.Efflux pumpmedicated intrinsic drug resistance in Mycobacterium smegmatis[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(7):2415-2423.

[9]Chu YW,Chau SL,Houang ET.Presence of active efflux systemsAdeABC,AdeDE andAdeXYZ in differentAcine tobacter genomic DNA groups[J].J Med Microbiol,2006,55(4):477-478.

[10]Macharand I,Damier-Piolle L,Caurvalin P,et al.Expression of the RND-type efflux pump AdeABC in Acinetobacter baumannii is regulated by the AdeRS two-component system[J].Antimicrob A-gents Chemother,2004,48(9):3298-3304.

[11]Camp C,Tatum OL.A review of Acinetobacter baumannii as a highly successful pathogen in times of war[J].Lab Med,2010,41:649-657.

[12]王悅,宋詩(shī)鐸,王玉寶,22株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株的外排泵AdeABC和AdeIJK的表迏研究 [J].中國(guó)抗生素雜志,2009,34(5):304-308.

[13]宋曉萍,劉萍萍,孫明娥,等,鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性監(jiān)測(cè)與外排泵adeB基因表迏水平檢測(cè) [J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,32(12):1297-1298.

[14]吳春陽(yáng),錢(qián)雪峰,張劍峰,等,多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵基因和外膜蛋白基因的檢測(cè)[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2013,31(7):531-534.

[15]孫靜娜,董威,趙帥,等,多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵表型和基因型的研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,37(10):763-766.